TEORI HPLC

SIMON BW WEEKS -8
MESIN HPLC
MESIN HPLC
KOMPONEN HPLC
 Two Types of HPLC Methods

• Normal Phase – polar stationary phase

• (column) with a nonpolar mobile phase
• (solvent)
• Reverse Phase– nonpolar stationary phase
• (column) with a polar mobile phase
• (solvent)
MEKANISME PEMISAHAN FRAKSI SOLUTE DLM
KOLOM HPLC
FRAKSI HASIL PEMISAHAN SENY. DGN
HPLC KOLOM PAK.
 CONTOH UTK ANALISA ASAM
AMINO DENGAN METODE HPLC:
• ADA 2 TAHAP:
1. TAHAP PERSIAPAN SAMPEL
2. TAHAP ANALISA KROMATOGRAFI
3. TAHAP PERSIAPAN SAMPEL:
ADA 2 TAHAP:
1. TAHAP ANALISA ASAM AMINO BEBAS YG
MEMANG ADA DLM SAMPEL: MISAL, DALAM
KECAP ATAU PRODUK FERMENTASI LAINNYA.
• 2. TAHAP ANALISA TOTAL ASAM AMINO YANG
MELIPUTI: ASAM AMINO BEBAS + ASAM AMINO
YANG TERIKAT SEBAGAI MOLEKUL PROTEIN DLM
PRODUK PANGAN.
• PERSIAPAN SAMPEL UTK ASAM AMINO BEBAS:
• SAMPEL PADAT: DIHALUSKAN DGN MORTAR,
KEMUDIAN SAMPEL DIEKSTRAK DGN 0,1 N HCL,
CAMPURAN DI SARING DGN ULTRAFILTASI BARU
FILTRAT DIINJEKSIKAN KE HPLC
 PERSIAPAN SAMPEL PADAT UTK
TOTAL ASAM AMINO.
• 1. METODE ASAM: SAMPEL HALUS DICAMPUR
DGN 6 N HCL dan dimasukkan dalam gelas
ampul, dialiri gas nitrogen, ampul gelas di
sealed dgn api bunsen. Ampul gelas
dimasukkan oven 110 oC selama 20 jam.
• Atau sampel diektrak dgn 6 N HCL selama 24,
48 atau bahkan 72 jam. Tgt manual atau kuat
tidaknya ikatan asam amino dlm polipetida.
 KERUGIAN METODE 6 N HCL
• ASAM AMINO TRYPTOPHAN, RUSAK.
SEBAGIAN CYSTEIN DAN METHIONINE JUGA
RUSAK OLEH HIDROLISA ASAM HCL 6 N.
 METOD LAIN: HIDROLISIS BASA
• SAMPEL HALUS DIEKSTRAK DGN 4,2 N NaOH
DIMASUKKAN DALAM AMPUL GELAS, DI
SEALED, DIBEKUKAN DALAM ES KERING-
ALKOHOL. KEMUDIAN DIPINDAHKAN KE
TABUNG GELAS KHUSUS (Oehlhlegel glass),
agar hidrolisat bisa divakuumkan (0,18 mm
Hg). SESUDAH GELAS INI DIPINDAHKAN KE
SUHU KAMAR, DIMASUKKAN OVEN 110 OC
SELAMA 16 JAM.
 METODE BASA KHUSUS
DILAKUKAN UTK:
• RECOVERY: TRYPTOPHAN, DIMANA DGN
METODE 6 N HCL SELAMA 22/48 JAM, 100%
ASAM AMINO TRYPTOPHAN RUSAK ALIAS 0%.
TEORI KUANTITATIF HPLC

PROF. SIMON BW Ph.D.

Dept. food technology UB
 RESPON DETEKTOR
• RD = AGAR HUB ANTARA BANYAKNYA SAMPEL YG
DIINJEKSIKAN DGN RD DAPAT DIKETAHUI
• RD DIPENGARUHI OLEH:
• TIPE DETEKTOR, JENIS KOLOM, MERK
KROMATOGRAFI DAN JENIS SENYA YG DISELIDIKI
• UNTUK MENENTUKAN RD BERAT SENY.
STANDARD MISALNYA: CAMP. GLUKOSA,
FRUKTOSA, SUKROSA DAN LAKTOSA HARUS
DIKETAHUI
• DENGAN PENGENCERAN YG DIKETAHUI
• SEJUMLAH VOLUME EKSTERNAL STANDARD
DIINJEKSIKAN KE MESIN HPLC.
• INJEKSI HARUS DILAKUKAN BEBERAPA KALI
AGAR DIPEROLEH HASIL YG TELITI.
• TEHNIK INJEKSI VOLUME SAMPLE/STD JUGA
HARUS BENAR BENAR TELITI, AGAR
DIPEROLEH RD YG BENAR DAN VALID.
• SETELAH DIPEROLEH KROMATOGRAM, LUAS MASING
MASING PUNCAK PER SATUAN BERAT DITENTUKAN
• RD = LUAS PUNCAK SAMPEL/BERAT SAMPEL
• RD = LUAS PUNCAK STD/BERAT STD
• UTK MENDAPATKAN FAKTOR KOREKSI: MISAL RD STD
GLUKOSA = 352 UNIT LUAS/ug, maka
• F = RD SENY/RD SENY STD ATAU
• F= RD SENY/352
• UNTUK MENGHITUNG BERAT SENY SCR QUANTITATIVE:
LUAS PUNCAK KROMATOGRAM SENY- F.
• NORMALISASI INTERNAL:
• KOMPOSISI SUATU CAMPURAN DINYATAKAN
DLM % LUAS THD JUMLAH LUAS PUNCAK
SELURUH KOMPONEN. MISAL
KOMPONEN/SENY A (GLUKOSA) MEMILIKI
LUAS PUNCAK 10 UNIT, SEDANG JUMLAH LUAS
PUNCAK SELURUH KOMPONEN DLM SAMPEL
100, MAKA DALAM CAMPURAN SAMPEL TSB
TERDAPAT : 10/100 x 100% = 10%.
• CARA INI/NORMALISASI INTERNAL INI
MEMILIKI KELEMAHAN: YAITU SEMUA LUAS
PUNCAK KOMPONEN HARUS DIUKUR, AGAR
PENGUKURAN AKURAT. DAN SEMUA PUNCAK
HARUS DIKETAHUI RESPONNYA / RD.
• NAMUN DALAM PRAKTEK KELEMAHAN ITU
BISA DIABAIKAN.
 JENIS STANDARD
• Senya. Std eksternal:
• Cara ini dpt memberikan hasil baik bila: senya.
STD dan sampel diinjeksikan beberapa kali 2-3
kali lalu dihitung RATA-2 NYA.
• JUMLAH STD dan SAMPEL yg diinjeksikan harus
mendekati (misal: ± 2 uL)
• Kelemahan tehnik ini: lebih cocok utk analisis
satu seny. (mono sakarida saja/ atau lainnya)
• Namun dalam praktek STD EKSTERNAL INI yg
paling banyak dipakai.
• STD INTERNAL, CONTOH: 5-metiltryptophan, alpha-
metil tryp.
• Cara ini paling baik untuk mendapatkan hasil yg akurat
dan dianjurkan, ASAL MEMENUHI SYARAT-2 TERTENTU:
• 1. SENY. STD HARUS TERELUSI TERPISAH DARI MASING-
MASING KOMPONEN PENYUSUN SAMPEL, TAPI TIDAK
JAUH DARI PUNCAK KOMPONEN YG DICARI/
SEBAIKNYA DIANTARA KOMPONEN YG DICARI.
• 2. SENY STD HARUS MEMILIKI GUGUS FUNGSIONAL YG
SERUPA/SENY YG SERUPA DGN KOMPONEN YG DICARI.
• 3. SENY STD HARUS STABIL DLM KONDISI ANALISIS DAN
TIDAK BEREAKSI DGN SAMPEL YG DIANALISIS
• SENY. STD INTERNAL DITAMBAHKAN DLM
SAMPEL DAN DIKETAHUI
BERATNYA/VOLUMENYA.
• BERAT STD YG DI+KAN DLM SAMPEL HARUS
SEBANDING DGN BERAT SAMPEL.
• UNTUK MENGHITUNG BERAT MASING
MASING FRAKSI KOMPONEN SAMPEL, LUAS
PUNCAK DARI SENY. STD DIPAKAI SBG
PEMBANDING.
• LANGKAH :
• 1. MENYIAPKAN LAR STD
• 2. MENYIAPKAN LAR SAMPEL
• 3. INJEKSIKAN LAR STD
• 4. INJEKSIKAN LAR SAMPEL
• 5. MENGHITUNG MASING- 2 PUNCAK STD &
KOMPONEN SAMPEL
• 6. MENENTUKAN BESARNYA FAKTOR KOREKSI (F)
UTK MASING-2 KOMPONEN
• 7. F komponen= RD SENY/RD SENY. STD.
• 8. MENCAMPURKAN LAR STD + LAR SAMPEL,
INJEKSIKAN KE MESIN HPLC
• 9. HITUNG MASING-2 BERAT KOMPONEN:
• KADAR KOMPONEN (% berat) =
• Luas puncak komponen X berat STD X 100%
• F X Luas puncak STD X berat sampel