Bovine Viral Diarrhea (BVD) adalah penyakit ternak yang secara ekonomi penting dengan distribusi di

seluruh dunia. BVD disebabkan oleh virus diare virus bovine (BVDV) yang termasuk dalam genus
Pestivirus dalam famili Flaviviridae.1 BVDV mampu memproduksi sebuah broadrange tanda klinis, mulai
dari infeksi asimtomatik yang paling sering sampai pada penyakit akut berat dengan tanda-tanda dari
organ enterik, reproduksi atau pernafasan. Janin janin yang terinfeksi dengan biotipe non-sitopatik BVDV
antara hari ke 30 dan 125 kehamilan dapat mengembangkan toleransi kekebalan terhadap virus dan
akan menjadi lahir terus-menerus terinfeksi (PI) menumpahkan virus terus-menerus.2 Diagnosis BVD
bergantung pada deteksi agen agen viral yang berbasis laboratorium (terutama untuk identifikasi
hewanPI) atau antibodi spesifik virus. Metode yang paling umum digunakan untuk tujuan ini adalah
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) .3 Pemberian imunogenisin BVDV yang paling banyak, 4
termasuk struktur struktural Erns dan E2 dan protein NS3 non-struktural telah dikembangkan sebagai
protein rekombinan dan diterapkan untuk merancang ELISA untuk deteksi antibodi spesifik dalam
cattlesera.5 NS3 adalah protein 80 kDa (p80) yang mengandung domain protease serin N terminal dan
terminal C-terminal RNA helicase.6 Produksi NS3 sangat penting untuk replikasi viralRNA dan
sitopatogenesis.7 Protein ini juga sangat dilestarikan di antara pestisida dan menginduksi respon imun
humoral pada pada ternak yang terpapar secara langsung denganVVV baik secara alami atau dengan
vaksinasi.8 Oleh karena itu, antigen kandidat aproper untuk mendeteksi antibodi terhadap virus dalam
sera hewan yang terinfeksi. Untuk tujuan ini, antibodi monoklonal NS3 dan NS3 khusus digunakan untuk
merancang ELISA (ELISA tidak langsung dan kompetitif) untuk mendeteksi antibodi spesifik terhadap
virus.5, 9-11 Selama beberapa tahun terakhir, dampak ekonomi BVDVinfection telah menyebabkan
sejumlah dari negara-negara di Eropa untuk program starteradication atau control.12,13 Di Iran, antibodi
BVDV pada ternak dewasa sekitar 25,0% .14,15 Oleh karena itu, diinginkan untuk memiliki alat yang
cepat, sensitif dan dapat diandalkan untuk mengidentifikasi orang-orang yang terinfeksi pengendalian
dan pemberantasan BVD. Anti-NS3 MAbswere kebanyakan dihasilkan setelah imunisasi dengan
wholevirus. Tujuan utama penelitian ini adalah untuk memproduksi antibodi antimikroba terhadap
antigen NS3 rekombinanBVDV yang diproduksi dalam sistem eksploitasi bakteri yang efisien untuk
merancang ELISA kompetitif lokal untuk mendeteksi hewan yang terinfeksi di masa depan.

Hasil

Hasil

Ekspresi dan pemurnian fusi MBP-NS3

protein. Ekspresi protein MBP-NS3 rekombinan di

vektor ekspresi pMalc2x pada strain E. coli BL-21 adalah

diinduksi dengan menambahkan IPTG ke kultur bakteri yang disiapkan sebagai

instruksi dari sistem ekspresi pMalc2x. Protein

profil bakteri induksi dan non-induced oleh SDS-PAGE

mengungkapkan bahwa polipeptida sekitar 117 kDa

diekspresikan dalam bakteri induksi (Gambar 1). Mengingat

berat molekul 42 dan 75 kDa untuk MBP dan NS3

masing-masing, protein fusi MBP-NS3 diperkirakan

memiliki perkiraan berat molekul 117 kDa.

Seperti ditunjukkan pada Gambar 2, setelah pemurnian yang diekspresikan

protein (MBP-NS3) pada kolom resin amilosa dan

analisis oleh SDS-PAGE, ekspresi rekombinan

MBP-NS3 jelas terdeteksi.

Produksi dan isolasi hibridoma. Setelah

mengimunisasi tikus dengan rekombinan MBP-NS3, anti-

Antibodi NS3 dalam serum tikus ditentukan secara tidak langsung

ELISA pada hari ke 45. Nilai OD dari sera yang diimunisasi

(1: 2000 diencerkan) adalah dari 1,40-1,49 dibandingkan dengan

Nilai OD 0,09 pada serum yang tidak diimunisasi (negatif

kontrol). Sel limpa tikus yang diimunisasi dengan yang tertinggi

Titer antibodi anti-NS3 disatukan dengan mieloma SP2 / 0

sel menggunakan PEG. Hibrida dipilih oleh kemampuan mereka

tumbuh dalam medium HAT. Kemudian, supernatan budaya

Klon primer disaring oleh ELISA MBP-NS3 dan

MBP ELISA. Hibrida positif tersebut di MBP-NS3 ELISA

yang tidak bereaksi dalam MBP ELISA dianggap sebagai

positif. Atas dasar skrining primer, anti-NS3

antibodi dalam supernatan 20 klon diidentifikasi

dengan nilai OD dari 0,20 sampai 1,10 (rata-rata 0,52). Itu

klon positif dengan titer tertinggi anti-NS3 antibodi

dikloning dan disaring oleh ELISA tidak langsung selama tiga tahun

waktu. Nilai OD ELISA lebih tinggi dari 1,10 sampai

2,70 pada kloning kedua dan ketiga dengan tidak bereaksi terhadap MBP.

Namun, produksi antibodi anti-NS3 dihentikan

Tiga klon selama kloning mungkin karena somatik

mutasi atau penghapusan kromosom.

Reaktivitas MAbs terhadap rekombinan dan alami

antigen. Klon positif setelah tiga kali kloning

dipilih dan reaktivitas MAbs dengan

antigen NS3 rekombinan disaring dan ditetapkan oleh

Western blotting (Gambar 3).

Juga spesifisitas dan reaktivitas MAbs dengan

bentuk alami dari antigen NS3, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4,

diperiksa dan dikonfirmasi dengan virus BVD yang terinfeksi

sel sebagai sumber virus di Western blotting. Dalam

Analisis Western Blot, anti-NS3 MAbs bereaksi dengan a

protein BVDV yang lebih rendah dari penanda 97 kDa,

yang sesuai dengan perkiraan berat

NS3 alami (80 kDa) BVDV.

Diskusi

iscussion

Diagnosis BVD bergantung pada deteksi berbasis laboratorium

dari agen penyebab virus atau antibodi spesifik virus.

Identifikasi hewan PI dilakukan dengan isolasi virus,

RT-PCR dan deteksi antigen virus oleh immuno-

histokimia dan AC-ELISA. Isolasi virus dan virus

Uji netralisasi (VNT), sebagai "standar emas" tersebut

tes sensitif dan spesifik namun tergantung pada budaya sel

dan padat karya. ELISA lebih cocok untuk skrining

Serangkaian besar sampel untuk mendeteksi kedua antibodi dan

antigen virus.22,23 Virus diare bovine virus non-

protein struktural 3 (NS3) memiliki peran penting dalam

patogenesis BVDV. Protein nonstruktural ini sangat kuat

menginduksi respon imun humoral dan sangat

dilestarikan diantara pestivirus.

8,24 Oleh karena itu, beberapa

ELISA baru saja dikembangkan untuk mendeteksi BVDV

infeksi menggunakan rekombinan NS3 protein dan anti-NS3

MAbs.5,9-11,25 Protein ini telah menunjukkan sensitivitas tinggi dan

spesifisitas untuk deteksi infeksi BVDV sebagai perbandingan

dengan keseluruhan antigen virus.9,11

Setelah BVDV spesifik Mabs tersedia, beberapa

uji laboratorium yang dilaporkan untuk deteksi BVDV berdasarkan

anti BVDV MAbs Beberapa AC-ELISA dikembangkan

untuk deteksi cepat BVDV berdasarkan poliklonal dan

MAbs spesifik untuk satu atau lebih antigen virus berikut

imunisasi dengan keseluruhan virus.23,26 Dalam sebuah penelitian, sebuah AC-

ELISA dikembangkan menggunakan MAbs terhadap p125 / p80

polipeptida virus penyakit perbatasan (BDV) dan BVDV untuk

mendeteksi antigen virus dari darah sapi yang terinfeksi

dan domba. ELISA MAb ini dibandingkan dengan yang ada

ELISA yang mengandalkan antibodi poliklonal (PAbs). Itu

Deteksi MAb ELISA lebih sensitif dibanding PAb

deteksi ELISA.27 Dalam sebuah penelitian, Mignon dkk. dikembangkan

sebuah AC-ELISA menggunakan anti-gp48 dan anti-NS3 MAbs untuk

mendeteksi antigen BVDV dalam sampel darah dengan sensitivitas

dan spesifisitas100%. Mereka membuktikan AC-ELISA itu a

Kandidat yang baik untuk mengganti isolasi virus sebagai referensi

metode untuk deteksi antigen BVDV pada hewan PI.26 In

Penelitian lain, 860 sampel darah tanpa antibodi

untuk BVDV diperiksa pada kedua isolat virus tersebut dan pada a

AC-ELISA berdasarkan anti- p125 / p80 MAbs. Sebanyak 843

Sampel (98,0%) positif pada kedua tes

menunjukkan protein virus ini sangat dilestarikan

virus BVD yang berbeda.28 Bedekovic dkk. dijelaskan a

Metode imunofluoresensi tidak langsung (indirect immunofluorescence) berdasarkan kolam

Antibodi monoklonal BVDV-spesifik (VLA, Weybridge, Inggris)

menggunakan sampel jaringan takik telinga untuk diagnosis sapi PI.

Dibandingkan dengan RT-PCR assay, JIKA assay memiliki a

sensitivitas dan spesifisitas 100% dan bagus

Alternatif RT-PCR dan antigen ELISA dengan kecepatan tinggi

dan akurasi.29 Pemanfaatan mikropartikel immuno-

uji aglutinasi telah diteliti dengan menggunakan dilapisi

mikropartikel dengan antibodi monoklonal anti-BVDV untuk

Deteksi BVDV Imunoaglutinasi mikropartikel

lebih sensitif daripada RT-PCR untuk mendeteksi virus di

waktu terpendek.30 Kameyama dkk., mengembangkan sebuah immuno-

uji kromatografi untuk diagnosis BVDV yang cepat

infeksi menggunakan antibodi monoklonal anti-NS3 dari

virus. Sensitivitas dan spesifisitas kit ini dibandingkan

dengan isolasi virus masing-masing 100% dan 97,2% .31

Juga uji immuno-peroxidase tidak langsung

Dilaporkan menggunakan anti-gp53 dan anti-NS3 MAbs untuk mendeteksi

Antigen BVDV di CNS.32 Lecomte dkk., Menjelaskan a

ELISA kompetitif menggunakan anti-P80 (NS3) MAbs yang ada

lebih spesifik daripada pengujian tidak langsung untuk mendeteksi antibodi

virus.9 Dalam sebuah penelitian, ELISA pemblokiran NS2-3 diterapkan

untuk deteksi antibodi BVDV menggunakan 1189 susu per

sampel serum dengan sensitivitas dan spesifisitas 96,9% dan

97,8%, dibandingkan dengan isolasi virus.11

Bhatia dkk. mengembangkan inhibisi kompetitif ELISA (CI-

ELISA) untuk mendeteksi antibodi terhadap penggunaan BVDV

domain helicase yang diekspresikan secara prokariotik pada NS3 dan a

anti-NS3 antibodi monoklonal. Studi mereka membuktikan hal itu

domain helicase NS3 sama bergunanya dengan keseluruhan NS3

protein yang digunakan dalam dua kit ELISA komersial untuk deteksi

Antibodi BVDV.25 Dampak ekonomi BVDV

infeksi telah menyebabkan sejumlah negara di Eropa memulai

program pemberantasan atau pengendalian.12

Untuk meringkas, dalam penelitian ini, untuk pertama kalinya,

sejumlah besar rekombinan rekombinan yang aktif secara imunologis

protein dalam sistem ekspresi di bawah kendali

promotor kuat (lac) vektor pMalc2x digunakan untuk

menghasilkan anti-NS3 MAbs dengan uji fusi sel. Anti-NS3

MABS disaring secara tidak langsung ELISA dan reaktivitasnya

dari MAbs dengan rekombinan dan antigen alami adalah

didirikan oleh Western blotting. Berdasarkan hasil kami, itu

muncul antigen rekombinan NS3 dan spesifiknya

Antibodi monoklonal yang diproduksi melawannya mungkin terjadi

cocok untuk pengembangan uji diagnostik laboratorium BVDV

terutama inhibisi kompetitif ELISA.

diskusi

Diagnosis BVD bergantung pada deteksi berbasis laboratorium terhadap agen penyebab virus atau
antibodi spesifik virus. Identifikasi hewan PI dilakukan dengan isolasi virus, RT-PCR dan deteksi antigen
virus oleh immuno-

histokimia dan AC-ELISA. Isolasi virus dan uji netralisasi virus (VNT), karena "standar emas" adalah tes
sensitif dan spesifik namun tergantung pada kultur sel dan padat karya. ELISA lebih cocok untuk skrining
sejumlah besar sampel untuk mendeteksi kedua antibodi tersebut dan

antigen virus.22,23 Virus diare virus di dalam sapi, protein non-struktural 3 (NS3) memiliki peran penting
dalam patogenesis BVDV. Protein nonstruktural ini sangat menginduksi respon imun humoral dan sangat

dilestarikan di antara pestisida.8,24 Oleh karena itu, beberapa

ELISA baru-baru ini dikembangkan untuk mendeteksi infeksi BVDV dengan menggunakan protein NS3
rekombinan dan anti-NS3 MAbs.5,9-11,25 Protein ini telah menunjukkan sensitivitas dan spesifitas yang
tinggi untuk mendeteksi infeksi BVDV dibandingkan dengan keseluruhan antigen virus.9,11

Setelah BVDV spesifik Mabs menjadi tersedia, beberapa tes laboratorium yang dilaporkan untuk deteksi
BVDV berdasarkan anti BVDV MAbs. Beberapa AC-ELISA dikembangkan untuk deteksi cepat BVDV
berdasarkan poliklonal dan

MAbs spesifik untuk satu atau lebih antigen virus setelah imunisasi dengan keseluruhan virus.23,26
Dalam sebuah penelitian, sebuah AC-ELISA dikembangkan dengan menggunakan MAbs terhadap p125 /
p80

polipeptida virus penyakit perbatasan (BDV) dan BVDV untuk mendeteksi antigen virus dari darah sapi
dan domba yang terinfeksi. ELISA MAb ini dibandingkan dengan ELISA yang ada yang mengandalkan
antibodi poliklonal (PAbs). Itu

Deteksi MAb ELISA lebih sensitif daripada deteksi PAb ELISA.27 Dalam sebuah penelitian, Mignon dkk.
dikembangkan

sebuah AC-ELISA menggunakan anti-gp48 dan anti-NS3 MAbs untuk mendeteksi antigen BVDV dalam
sampel darah dengan sensitivitas.

dan spesifisitas100%. Mereka membuktikan bahwa AC-ELISA adalah kandidat yang tepat untuk
mengganti isolasi virus sebagai metode referensi untuk deteksi antigen BVDV pada hewan piaraan.26
Dalam penelitian lain, 860 sampel darah tanpa antibodi terhadap BVDV diperiksa pada isolat virus dan
pada AC-ELISA berdasarkan anti- p125 / p80 MAbs. Sebanyak 843 sampel (98,0%) positif pada kedua tes
tersebut, sehingga protein protein ini sangat dilestarikan

virus BVD yang berbeda.28 Bedekovic dkk. dijelaskan a

Metode imunofluoresensi tidak langsung berdasarkan kumpulan antibodi monoklonal BVDV (VLA,
Weybridge, Inggris)

menggunakan sampel jaringan takik telinga untuk diagnosis sapi PI. Dibandingkan dengan uji RT-PCR, uji
JIKA memiliki sensitivitas dan spesifisitas 100% dan merupakan alternatif yang baik untuk RT-PCR dan
ELISA antigen dengan kecepatan dan ketepatan tinggi.29 Pemanfaatan mikropartikel immuno-

uji aglutinasi telah diteliti menggunakan mikropartikel berlapis dengan antibodi monoklonal anti-BVDV
untuk deteksi BVDV. Imunoaglutinasi mikropartikel

lebih sensitif daripada RT-PCR untuk mendeteksi virus dalam waktu sesingkat-singkatnya.30 Kameyama
dkk., mengembangkan tes imunokromatografi untuk diagnosis cepat infeksi BVDV dengan menggunakan
antibodi monoklonal anti-NS3 pada virus tersebut. Sensitivitas dan spesifisitas kit ini dibandingkan
dengan isolasi virus masing-masing adalah 100% dan 97,2% .31

Juga uji immuno-peroxidase tidak langsung telah dilaporkan menggunakan anti-gp53 dan anti-NS3 MAbs
untuk mendeteksi

Antigen BVDV di CNS.32 Lecomte dkk., Menggambarkan ELISA yang kompetitif dengan menggunakan
anti-P80 (NS3) MAbs yang

lebih spesifik daripada pengujian tidak langsung untuk mendeteksi antibodi

virus.9 Dalam sebuah penelitian, ELISA pemblokiran NS2-3 diterapkan untuk mendeteksi antibodi BVDV
menggunakan 1.899 susu per sampel serum dengan sensitivitas dan spesifisitas 96,9% dan

97,8%, dibandingkan dengan isolasi virus.11 Bhatia et al. mengembangkan inhibisi kompetitif ELISA (CI-

ELISA) untuk mendeteksi antibodi terhadap BVDV menggunakan domain helicase yang diekspresikan
secara prokariot pada NS3 dan sebuah

anti-NS3 antibodi monoklonal. Studi mereka membuktikan bahwa domain helicase NS3 sama-sama
berguna sebagai keseluruhan protein NS3 yang digunakan dalam dua perangkat ELISA komersial untuk
mendeteksi antibodi BVDV.25 Dampak ekonomi dari infeksi BVDV telah menyebabkan sejumlah negara di
Eropa memulai program pemberantasan atau pengendalian.12

o meringkas, dalam penelitian ini, untuk pertama kalinya,

sejumlah besar rekombinan rekombinan yang aktif secara imunologis

protein dalam sistem ekspresi di bawah kendali

promotor kuat (lac) vektor pMalc2x digunakan untuk

menghasilkan anti-NS3 MAbs dengan uji fusi sel. Anti-NS3

MABS disaring secara tidak langsung ELISA dan reaktivitasnya

dari MAbs dengan rekombinan dan antigen alami adalah

didirikan oleh Western blotting. Berdasarkan hasil kami, itu

muncul antigen rekombinan NS3 dan spesifiknya

Antibodi monoklonal yang diproduksi melawannya mungkin terjadi

cocok untuk pengembangan uji diagnostik laboratorium BVDV

terutama inhibisi kompetitif ELISA.