PENDAHULUAN

Bovine Viral Diarrhea (BVD) adalah penyakit ternak yang penting secara ekonomi
dan terdistribusi di seluruh dunia. BVD disebabkan oleh BVDV yang termasuk dalam
genus Pestivirus dalam famili Flaviviridae. 1 Infeksi BVDV menunjukkan rentang
gejala klinis yang luas, mulai dari yang paling sering yaitu infeksi asimtomatik
sampai pada penyakit akut berat di organ enterik, reproduksi atau pernafasan. Janin
sapi yang terinfeksi dengan biotipe non-sitopatik BVDV antara hari ke 30 dan 125
kehamilan dapat memproduksi toleransi imun terhadap virus dan akan terlahir
dengan infeksi persisten/ persistently infected (PI), menyebarkan virus terus-
menerus.2 Diagnosis BVD didasarkan pada temuan laboratorium yaitu virus
penyebab (terutama untuk identifikasi hewan PI) atau antibodi spesifik terhadap
virus. Metode yang paling umum digunakan untuk tujuan ini adalah enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA).3 Protein BDVD yang paling imunogenik seperti Erns
dan protein struktural E2 serta protein non-struktural NS3 digunakan sebagai
protein rekombinan yang diaplikasikan untuk desain ELISA dalam mendeteksi
antibodi spesifik. NS3 merupakan protein 80 kDa (p80) yang mengandung domain N
terminal serin protease dan C-terminal RNA helikase. 6 Produksi NS3 sangat penting
untuk replikasi RNA virus dan sitopatogenesis. 7 Protein ini juga sangat dilestarikan
di antara pestivirus lain dan menginduksi respon imun humoral pada pada ternak
yang terpapar secara langsung dengan BVDV baik secara alami atau dengan
vaksinasi.8 Oleh karena itu, ia merupakan kandidat antigen yang paling tepat untuk
mendeteksi antibodi virus dalam sera hewan yang terinfeksi. Untuk tujuan ini, NS3
dan antibodi monoklonal NS3 digunakan dalam merancang ELISA (indirect dan
kompetitif) untuk mendeteksi antibodi spesifik terhadap virus. 5, 9-11 Selama beberapa
tahun terakhir, dampak ekonomi infeksi BVDV telah menyebabkan sejumlah negara
di Eropa memulai program pengendalian dan pemberantasan. 12,13 Di Iran, prevalensi
ditemukannya antibodi BVDV pada ternak dewasa sekitar 25,0%. 14,15 Oleh karena
itu, diperlukan alat yang cepat, sensitif dan dapat diandalkan untuk
mengidentifikasi hewan-hewan yang terinfeksi dalam rangka pengendalian dan
pemberantasan BVD. Anti-NS3 Mab dihasilkan setelah imunisasi dengan virus utuh.
Tujuan utama penelitian ini adalah untuk memproduksi antibodi monoklonal
terhadap antigen NS3 rekombinan BVDV yang diproduksi dalam sistem eksploitasi
bakteri yang efisien untuk merancang ELISA kompetitif lokal untuk mendeteksi
hewan yang terinfeksi di masa depan.

HASIL

Ekspresi dan pemurnian fusi MBP-NS3 protein.

Ekspresi protein rekombinan MBP-NS3 dalam vektor ekspresi pMalc2x pada strain E.
coli BL-21 diinduksi dengan menambahkan IPTG ke kultur bakteri yang disiapkan
sebagai instruksi dari sistem ekspresi pMalc2x. Profil protein bakteri induksi dan
non-induksi oleh SDS-PAGE menunjukkan bahwa polipeptida sekitar 117 kDa
diekspresikan oleh bakteri induksi (Gambar 1). Berat molekul 42 dan 75 kDa untuk
MBP dan NS3, sementara protein fusi MBP-NS3 diperkirakan memiliki perkiraan
berat molekul 117 kDa. Seperti ditunjukkan pada Gambar 2, setelah pemurnian
MBP-NS3 dalam kolom amylose resin dan analisis SDS PAGE, ekspresi rekombinan
MBP-NS3 dapat terdeteksi dengan jelas

Produksi dan isolasi hibridoma.

Setelah mengimunisasi tikus dengan rekombinan MBP-NS3, anti-Antibodi NS3 dalam
serum tikus ditentukan dengan indirect ELISA pada hari ke 45. Nilai OD dari sera
yang diimunisasi (pengenceran 1: 2000) adalah 1,40-1,49 dibandingkan dengan
nilai OD 0,09 pada serum yang tidak diimunisasi (negatif kontrol). Sel limpa tikus
yang diimunisasi dengan titer antibodi anti-NS3 yang tertinggi disatukan dengan sel
mieloma SP2/0 menggunakan PEG. Hibrida dipilih oleh kemampuan mereka tumbuh
dalam medium HAT. Kemudian, supernatan hasil kultur dari klon primer disaring
oleh ELISA MBP-NS3 dan MBP ELISA. Hibrida positif di MBP-NS3 ELISA yang tidak
bereaksi dalam MBP ELISA dianggap sebagai positif. Atas dasar skrining primer,
antibodi anti-NS3 dalam supernatan 20 klon diidentifikasi dengan nilai OD dari 0,20
sampai 1,10 (rata-rata 0,52). Klon positif dengan titer tertinggi anti-NS3 antibodi
dikloning dan disaring dgn indirect ELISA sebanyak tiga kali. Nilai OD ELISA lebih
tinggi, dari 1,10 sampai 2,70 pada kloning kedua dan ketiga dengan tidak bereaksi
terhadap MBP. Namun, produksi antibodi anti-NS3 dihentikan pada klon tiga selama
proses cloning, hal ini dimungkinkan karena terajdi mutasi somatic atau delesi
kromosom

Reaktivitas MAbs terhadap rekombinan dan antigen alami

Klon positif setelah tiga kali kloning dipilih dan reaktivitas MAbs dengan antigen NS3
rekombinan disaring dan ditetapkan dengan Western blotting (Gambar 3).
Spesifisitas dan reaktivitas MAbs dengan bentuk alami dari antigen NS3, seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 4, diperiksa dan dikonfirmasi dengan virus BVD
yang terinfeksi sel sebagai sumber virus di Western blotting. Dalam Analisis
Western Blot, anti-NS3 MAbs bereaksi dengan protein BVDV yang lebih rendah dari
penanda 97 kDa, yang sesuai dengan perkiraan berat NS3 alami (80 kDa) BVDV.

PEMBAHASAN
Diagnosis BVD bergantung pada deteksi berbasis laboratorium terhadap virus
penyebab atau antibodi spesifik terhadap virus. Identifikasi hewan PI dilakukan
dengan isolasi virus, RT-PCR dan deteksi antigen virus dengan immuno-histokimia
dan AC-ELISA. Isolasi virus dan uji netralisasi virus (VNT), sebagai "standar emas"
merupakan tes sensitif dan spesifik namun tergantung pada kultur sel dan
membutuhkan kerja keras. ELISA lebih cocok untuk skrining sejumlah besar sampel
untuk mendeteksi antibodi dan antigen virus. 22,23 Protein non-struktural 3 (NS3)
BVDV memiliki peran penting dalam patogenesis BVDV. Protein nonstruktural ini
sangat menginduksi respon imun humoral dan sering digunakan di antara pestivirus
lain.8,24 Oleh karena itu, beberapa ELISA baru-baru ini dikembangkan untuk
mendeteksi infeksi BVDV dengan menggunakan protein NS3 rekombinan dan anti-
NS3 MAbs.5,9-11,25 Protein ini telah menunjukkan sensitivitas dan spesifitas yang
tinggi untuk mendeteksi infeksi BVDV dibandingkan dengan keseluruhan antigen
virus.9,11
Setelah tersedia BVDV spesifik Mabs, beberapa uji laboratorium dilaporkan
dalam deteksi BVDV berdasarkan anti BVDV MAbs. Beberapa AC-ELISA
dikembangkan untuk deteksi cepat BVDV berdasarkan poliklonal dan MAbs spesifik
untuk satu atau lebih antigen virus setelah imunisasi dengan keseluruhan virus. 23,26
Dalam sebuah penelitian, sebuah AC-ELISA dikembangkan dengan menggunakan
MAbs terhadap p125 / p80 polipeptida virus penyakit perbatasan (BDV) dan BVDV
untuk mendeteksi antigen virus dari darah sapi dan domba yang terinfeksi. ELISA
MAb ini dibandingkan dengan ELISA yang ada yang mengandalkan antibodi
poliklonal (PAbs). Deteksi MAb ELISA lebih sensitif daripada deteksi PAb ELISA. 27
Dalam sebuah penelitian, Mignon dkk. mengembangkan sebuah AC-ELISA
menggunakan anti-gp48 dan anti-NS3 MAbs untuk mendeteksi antigen BVDV dalam
sampel darah dengan sensitivitas dan spesifisitas 100%. Mereka membuktikan
bahwa AC-ELISA adalah kandidat yang tepat untuk mengganti isolasi virus sebagai
metode referensi untuk deteksi antigen BVDV pada hewan piaraan. 26 Dalam
penelitian lain, 860 sampel darah tanpa antibodi terhadap BVDV diperiksa isolat
virus dan menggunakan AC-ELISA berdasarkan anti- p125 / p80 MAbs. Sebanyak
843 sampel (98,0%) positif pada kedua tes tersebut, sehingga protein protein ini
sangat dilestarikan virus BVD yang berbeda.28 Bedekovic dkk. Menjelaskan metode
imunofluoresensi tidak langsung berdasarkan kumpulan antibodi monoklonal
spesifik BVDV (VLA, Weybridge, Inggris) menggunakan sampel jaringan takik telinga
untuk diagnosis sapi PI. Dibandingkan dengan uji RT-PCR, uji IF memiliki sensitivitas
dan spesifisitas 100% dan merupakan alternatif yang baik untuk RT-PCR dan ELISA
antigen dengan kecepatan dan ketepatan tinggi .29 Pemanfaatan uji mikropartikel
imuno-aglutinasi telah diteliti menggunakan mikropartikel berlapis dengan antibodi
monoklonal anti-BVDV untuk deteksi BVDV. Imunoaglutinasi mikropartikel lebih
sensitif daripada RT-PCR untuk mendeteksi virus dalam waktu sesingkat-
singkatnya.30 Kameyama dkk., mengembangkan tes imunokromatografi untuk
diagnosis cepat infeksi BVDV dengan menggunakan antibodi monoklonal anti-NS3
pada virus tersebut. Sensitivitas dan spesifisitas kit ini dibandingkan dengan isolasi
virus masing-masing adalah 100% dan 97,2%.31 Juga uji immuno-peroxidase tidak
langsung telah dilaporkan menggunakan anti-gp53 dan anti-NS3 MAbs untuk
mendeteksi Antigen BVDV di CNS.32 Lecomte dkk., menggambarkan ELISA yang
kompetitif dengan menggunakan anti-P80 (NS3) MAbs yang lebih spesifik daripada
pengujian tidak langsung untuk mendeteksi antibody virus. 9 Dalam sebuah
penelitian, ELISA NS2-3 blocking diterapkan untuk mendeteksi antibodi BVDV
menggunakan 1899 susu per sampel serum dengan sensitivitas dan spesifisitas
96,9% dan 97,8%, dibandingkan dengan isolasi virus. 11 Bhatia et al.
mengembangkan inhibisi kompetitif ELISA (CI-ELISA) untuk mendeteksi antibodi
terhadap BVDV menggunakan domain helicase yang diekspresikan secara prokariot
pada NS3 dan sebuah anti-NS3 antibodi monoklonal. Studi mereka membuktikan
bahwa domain helicase NS3 sama-sama berguna sebagai keseluruhan protein NS3
yang digunakan dalam dua perangkat ELISA komersial untuk mendeteksi antibodi
BVDV.25 Dampak ekonomi dari infeksi BVDV telah menyebabkan sejumlah negara di
Eropa memulai program pemberantasan atau pengendalian. 12
Kesimpulannya, dalam penelitian ini, untuk pertama kalinya, sejumlah besar
rekombinan rekombinan yang aktif secara imunologis protein dalam sistem ekspresi
di bawah kendali promotor kuat (lac) vektor pMalc2x digunakan untuk menghasilkan
anti-NS3 MAbs dengan uji fusi sel. Anti-NS3 MABS disaring dengan indirect ELISA
dan reaktivitasnya dari MAbs dengan rekombinan dan antigen alami diuji dengan
Western blotting. Berdasarkan hasil kami, antigen rekombinan NS3 dan Antibodi
monoklonal spesifik yang diproduksi melawannya mungkin cocok untuk
pengembangan uji diagnostik laboratorium BVDV terutama inhibisi kompetitif ELISA.