Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Sejak Januari 2020 Elsevier telah membuat pusat sumber daya COVID-19 dengan

informasi gratis dalam bahasa Inggris dan Mandarin tentang virus corona baru COVID-

19. Pusat sumber daya COVID-19 di-host di Elsevier Connect, the

situs berita dan informasi publik perusahaan.

Elsevier dengan ini memberikan izin untuk membuat semua penelitian terkait

COVID-19 yang tersedia di pusat sumber daya COVID-19 - termasuk ini

konten penelitian - segera tersedia di PubMed Central dan tempat penyimpanan lain yang

didanai publik, seperti database WHO COVID dengan hak untuk penggunaan ulang dan

analisis penelitian tanpa batas dalam bentuk apa pun atau dengan cara apa pun

dengan mencantumkan sumber aslinya. Izin ini diberikan secara

gratis oleh Elsevier selama pusat sumber daya COVID-19
tetap aktif.
 Ekspresi dan Pemurnian Protein 186 (2001) 105908

Daftar isi tersedia di SainsLangsung

Ekspresi dan Pemurnian Protein

beranda jurnal: www.elsevier.com/locate/yprep

Ekspresi dan pemurnian protein nukleokapsid SARS-CoV-2 rekombinan

dalam badan inklusi dan penerapannya dalam deteksi serologis

Guang Li sebuah,B,*, Weiping Li sebuah,**, Xiaolan Fang sebuah, Lagu Xuri sebuah, Shujing Teng sebuah, Zong
Ren B, Daoqi Hu B, Songhui Zhou B, Gangqiang Wu B, Keqiang Li B
sebuah Departemen Kedokteran, Sekolah Kejuruan dan Teknik Yueyang, 414000, Yueyang, Hunan, Cina
B Hunan RunKun Pharmaceutical Co., Ltd, 414000, Yueyang, Hunan, Tiongkok

INFO ARTIKEL ABSTRAK

Kata kunci: Standar saat ini untuk diagnosis COVID-19 adalah uji asam nukleat RNA SARS-CoV-2, namun, deteksi antibodi virus
SARS-CoV-2 memiliki keunggulan pengumpulan sampel yang mudah, menyeluruh, dan biaya rendah. Saat menggabungkan
Protein nukleokapsid
deteksi dengan deteksi asam nukleat, deteksi antibodi dapat secara efektif mengimbangi deteksi asam nukleat.
Badan inklusi
Infeksi virus selalu menginduksi titer antibodi yang tinggi terhadap protein nukleokapsid (protein N) SARS-CoV-2,
Tes serologis
yang dapat digunakan untuk mendeteksi COVID-19 baik pada pasien yang terinfeksi maupun dalam masa
pemulihan. Dalam penelitian ini kami melaporkan ekspresi dan pemurnian protein N dalamE.coli dari badan inklusi
dengan kombinasi dua kromatografi pertukaran kation, dan hasil protein N adalah sekitar 50 mg/L kaldu fermentasi
dengan kemurnian lebih dari 90%. Kit deteksi emas koloid yang sesuai yang disiapkan dengan protein N murni kami
digunakan untuk memverifikasi efisiensi dan akurasi protein N kami dalam metode deteksi antibodi. Dari 58 sampel
serum inaktif pasien positif COVID-19 PCR, 40 sampel IgM positif (69,0%), dan 42 sampel IgG positif (72,4%), dan
ke-95 sampel serum inaktif pasien negatif COVID-19 keduanya IgM. dan IgG negatif. Hasil kami menunjukkan bahwa
protein N larut yang dilipat kembali dapat digunakan untuk deteksi awal antibodi IgG dan IgM terhadap SARS-CoV-2.

1. Perkenalan
Epidemi COVID-19 menyebar ke seluruh dunia. Diperkirakan bahwa epidemi
akan memiliki dampak yang signifikan dan luas pada manajemen kesehatan
manusia, perilaku dan kebiasaan sosial, dan bahkan hubungan ekonomi dan
perdagangan internasional. COVID-19 adalah pneumonia yang disebabkan oleh
sindrom pernapasan akut parah coronavirus 2 (SARS CoV-2), yang termasuk dalam
- coronavirus dari coronaviridae, virus RNA untai positif yang berbentuk bulat dan
berselubung. Genom terutama mengkodekan empat protein struktural: protein
lonjakan, protein amplop, protein membran, protein nukleokapsid (protein N).
Protein N terdiri dari 413 residu asam amino dan berikatan dengan RNA genom
virus untuk membentuk nukleokapsid. Protein N memiliki imunogenisitas yang
kuat dan dapat menginduksi respon antibodi yang tinggi dalam serum pasien
yang sembuh.1-3].
Sejak pecahnya epidemi, penelitian tentang protein N telah berkembang.
Penelitian telah mengungkapkan bahwa protein N adalah dimer yang
kompak dan terjalin, mirip dengan coronavirus SARS dan lainnya
virus corona [4]. Analisis bioinformatika yang dikombinasikan dengan bukti
spiritual eksperimental yang ada menunjukkan bahwa protein SARS-CoV-2 N dapat
membentuk atau mengatur agregat biomolekuler in vivo dengan berinteraksi
dengan RNA dan protein sel inang esensial. Protein N dari SARS-CoV-2 dapat
menggunakan aktivitas ini untuk mengontrol siklus hidup virus dan respons sel
inang terhadap infeksi virus [5]. Hamburan cahaya statis, kromatografi eksklusi
ukuran, dan hamburan sinar-X sudut kecil (SAXS) menunjukkan bahwa protein N
yang dimurnikan terutama dimer dalam larutan. Analisis polarisasi fluoresensi
menunjukkan bahwa protein N yang dimurnikan memiliki kemampuan mengikat
asam nukleat yang tidak spesifik. Western blotting mengkonfirmasi antibodi IgA,
IgM dan IgG terhadap protein N dalam serum darah pasien COVID-19, yang
membuktikan pentingnya antigen ini dalam imunitas dan diagnosis pejamu.6].
Sistem analisis imunopresipitasi luciferase digunakan untuk mendeteksi
protein nukleokapsid dan antibodi spinin pada 100 pasien COVID-19. Para
peneliti menguji dan membandingkan sampel dengan dan tanpa inaktivasi
termal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa anti SARS-CoV-2 N

* Penulis yang sesuai. Departemen Kedokteran, Sekolah Tinggi Kejuruan dan Teknik Yueyang, 414000, Yueyang, Hunan, Cina.
* * Penulis yang sesuai.
Alamat email: 451476379@qq.com (G.Li), 1307878066@qq.com (W.Li).

https://doi.org/10.1016/j.pep.2021.105908
Diterima 17 Maret 2021; Diterima dalam bentuk revisi 6 Mei 2021; Diterima 14 Mei 2021
Tersedia online 26 Mei 2021
1046-5928/© 2021 Elsevier Inc. Semua hak dilindungi undang-undang.
G.Li dkk.
antibodi protein lebih sensitif daripada antibodi protein lonjakan pada
infeksi awal [7]. Perkembangan pesat immunoassay telah dilakukan untuk
mendeteksi antibodi SARS-CoV-2, termasuk neutralizing antibody assay,
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescence
immunoassay (CLIA) dan lateral flow immunoassay (LFA). Metode deteksi ini
memiliki potensi untuk meningkatkan diagnosis dan pengendalian berbagai
jenis infeksi. Metode ini didasarkan pada deteksi antibodi IgG dan IgM
terhadap protein N dan protein S dalam serum.8–10]. ELISA berdasarkan
protein N rekombinan digunakan untuk mendeteksi antibodi (IgM dan/atau
IgG), tingkat deteksi sampel positif masing-masing adalah 68,2% dan 70,1%.
Tingkat positif IgM dan IgG meningkat seiring bertambahnya hari tetapi
menurun setelah 35 hari [11]. The Lanthanide-Doped Nanoparticles Based
Lateral Flow Immunoassay menggunakan protein N menunjukkan bahwa
protein N dapat digunakan untuk deteksi IgG anti SARS-CoV-2 yang cepat
dan sensitif [12]. Dengan perbaikan metodologi yang berkelanjutan, metode
serologis digunakan sebagai alat bantu untuk protokol deteksi RT-PCR [13].
Formulasi vaksin dan reagen diagnostik membutuhkan sejumlah besar kemurnian
tinggi, aktivitas tinggi, dan protein N berbiaya rendah, tetapi beberapa penelitian hanya
mengungkapkan fragmen protein N, atau menggunakan metode dengan operasi
kompleks seperti kromatografi filtrasi gel dan lainnya [4,6,14]. Dalam penelitian ini, kami
mengembangkan metode yang efisien dan cerdik untuk mengekspresikan dan
memurnikan protein N, prosesnya sederhana dan cocok untuk produksi massal.
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. bahan
Beijing BioMed Gene Technology Co., Ltd. menyediakan vektor
plasmid PET28a, E. coli BL21 (DE3). Kit kuantitatif protein BCA dan kit
ekstraksi kecil plasmid dibeli dari Sangon Bioengineering (Shanghai)
Co., Ltd. Peptone, bubuk ragi dan bubuk agar-agar dibeli dari Oxid Ltd.,
dan kasein dibeli dari Beijing Solarbio Biotechnology Co., Ltd.
Laboratorium kami mensintesis partikel emas koloid. Sino Biological
Inc. dengan ramah menyumbangkan antibodi monoklonal kelinci
terhadap protein SARS -CoV-2 N. Isopropil-β-D
-thiogalactopyranoside(IPTG) dan gel dekstran G25 dibeli dari GE
Healthcare, dan resin agarosa Ni NTA, resin agarosa kation kuat SP,
dan resin agarosa kation lemah CM dibeli dari Tosoh Bioscience.
2.2. Konstruksi vektor ekspresi pada E. coli
Kodon gen SARS-CoV-2 N (Gene ID: 43740575) dioptimalkan agar
cocok untuk E. coli sistem ekspresi. Gen yang dioptimalkan disintesis
dan dikonstruksi menjadi vektor ekspresi pET28a(+), dan kemudian
diubah menjadi T1E.coli bakteri untuk verifikasi DNA plasmid. Secara
singkat, transformasi dilapisi pada pelat LB yang mengandung
kanamisin 50 g/ml dan diinkubasi pada suhu 37◦C inkubator selama
12-16 jam. Koloni tunggal dipilih dan diinokulasi ke dalam media LB 5
ml dengan kanamisin (50 g/ml) untuk ekstraksi plasmid. Plasmid
dicerna oleh XhoI dan ApaI, dan fragmen divisualisasikan dan
diidentifikasi dengan elektroforesis gel agarosa DNA.
2.3. Ekspresi protein N pada E. coli
Koloni ekspresi rekombinan tunggal transformasi plasmid
rekombinan dengan E.coli BL21 (DE3) dipilih dari cawan dan diinokulasi
ke dalam media LB 3 ml yang dilengkapi dengan kanamisin (50 g/ml)
dan dikultur semalam pada suhu 37 ◦C dan 200rpm. Hari berikutnya,
kultur bakteri diinokulasikan ke dalam media LB 1L yang mengandung
kanamisin (50 g/mL). Larutan bakteri dikultur pada suhu 37◦C dan 250
rpm hingga nilai OD600 mencapai 0,8-1,0 (sekitar 5 jam). IPTG
ditambahkan ke konsentrasi akhir 1 mmol/L, dan kemudian bakteri
diinduksi semalaman pada suhu 37◦C. Auto-induksi berdasarkan media
Studier juga digunakan untuk ekspresi protein N [15]. Setelah induksi,
2
Ekspresi dan Pemurnian Protein 186 (2001) 105908
bakteri dipelet dengan sentrifugasi pada 4500G selama 30 menit pada 4 ◦C.
Pelet bakteri disuspensikan kembali dalam 50 ml larutan buffer Fosfat (pH
9,0) dengan 1% Triton X100, kemudian dipecah dengan sonikasi di atas es
(pengaturan: daya 600 W, waktu ultrasonik 3 detik, waktu jeda 7 detik, waktu
total 30 detik). menit). Setelah sentrifugasi kecepatan tinggi, protein target
diidentifikasi dalam badan inklusi dengan elektroforesis SDS-PAGE dengan
seluruh lisat, supernatan, dan pelet bakteri. Badan inklusi diekstraksi dan
dimurnikan dengan beberapa kali pencucian pelet setelah sonikasi, dan
badan inklusi yang dicuci dilarutkan dalam larutan urea 8 M.
2.4. Pemurnian protein SARS-CoV-2 N
2.4.1. Pemurnian awal protein N rekombinan dengan kromatografi
pertukaran kation SP
Protein N rekombinan dimurnikan dan dilipat kembali dengan
kromatografi penukar kation SP. Secara singkat, kolom SP disetarakan
dengan 50 mM larutan dapar fosfat (pH 9,0) yang mengandung 6 M urea,
badan inklusi yang dilarutkan dalam 8 M urea dimuat pada laju alir 5 ml/
menit. Setelah pemuatan sampel, buffer urea 6 M dicuci sampai garis
penyerapan 280 UV kembali ke garis dasar, dan kemudian konsentrasi urea
secara bertahap dikurangi menjadi 0 pada laju alir 1 ml/menit dan panjang
800 menit. Akhirnya, protein N rekombinan dielusi dengan 50 mM dapar
fosfat yang mengandung 0,45 M NaCI.
2.4.2. Pemurnian halus protein N dengan kromatografi
pertukaran kation CM
Protein N rekombinan primer yang dilipat kembali dan dimurnikan
dengan kromatografi penukar kation SP masih memiliki kontaminasi protein
inang, dan pemurnian pemolesan lebih lanjut dengan kromatografi penukar
kation CM diperlukan untuk menghilangkan kontaminan. Secara singkat,
kromatografi penukar kation CM dipra-ekuilibrasi dengan 50 mM larutan
dapar fosfat (pH 9,0), dan kemudian dielusi dari kolom SP 5 kali pengenceran
dengan 50 mM dapar fosfat (pH9.0) dimuat ke kolom pada laju alir 5 ml/
menit Setelah pemuatan sampel, kolom dicuci dengan 3 kali volume kolom
dengan 50 mM dapar fosfat (pH9.0) yang mengandung 0,25 M NaCI, dan
protein N rekombinan dielusi dengan 50 mM dapar fosfat (pH9.0) yang
mengandung 0,30 M NaCI.
2.4.3. SDS-PAGE dan western blotting
Protein yang dimurnikan dihilangkan garamnya dengan kolom desalting G25
dengan 20 mM Tris dan 50 mM glisin (pH8.0). Setelah kolom G25 diseimbangkan,
pertukaran buffer dilakukan dengan buffer yang sama pada 1 ml/menit. SDS
ditambahkan dengan konsentrasi akhir 0,1%, kemudian protein rekombinan
disimpan pada 20◦C untuk tujuan selanjutnya. Protein N rekombinan yang
dimurnikan menjadi sasaran elektroforesis SDS-PAGE 12%, dan protein diwarnai
dengan pewarna biru Coomassie. Sampel lain dipisahkan dengan SDS-PAGE dan
dipindahkan ke membran nitroselulosa menggunakan Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell
(Bio-Rad). Membran diperiksa dengan antibodi monoklonal kelinci (1:2000)
terhadap SARS-CoV-2 N diikuti dengan serum anti-kelinci kambing (1:10000) yang
dikonjugasi dengan peroksidase lobak, dan protein target divisualisasikan dengan
larutan pengembangan warna TMB.
2.5. Persiapan kit immunoassay emas koloid di rumah
Konjugasi emas koloid disiapkan di rumah. Secara singkat, 10 mL larutan
koloid emas (diameter 40 nm, disiapkan di laboratorium kami) dicampur
dengan 65 mL kalium karbonat (0,1 mol/L) dalam gelas kimia bersih,
kemudian ditambahkan protein N murni dan diinkubasi selama 30 menit
pada suhu kamar. . Untuk memblokir situs yang tidak terkonjugasi, 100 mL
larutan albumin serum sapi 20% ditambahkan ke dalam campuran dan
diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit tambahan. Campuran
disentrifugasi pada 12.000 r/min selama 20 menit dan dicuci dengan 5 mL
phosphate-buffered saline (PBS; 50 mmol/L, pH 7,4). Partikel emas koloid
disuspensikan kembali dalam buffer PBS, dan konsentrasi akhir protein N
adalah 15 g/mL.
G.Li dkk.
Gambar 1. Enzim restriksi ganda mencerna vektor ekspresi. Jalur 1, Plasmid yang
tidak tercerna; Jalur 2: Plasmid dicerna denganXho saya + apa SAYA; Jalur 3:
Penanda DNA.
Kit tes antibodi immunoassay emas koloid aliran lateral cepat juga
dikembangkan di rumah. Secara singkat, protein N berlabel koloid emas
dicampur dengan IgY ayam berlabel koloid emas dengan perbandingan 5:1,
dan disemprotkan ke membran dengan kecepatan 5 l/cm menggunakan
plotter film penyemprot emas, dan zikir dikeringkan semalaman pada suhu
37◦C. IgM anti-manusia monoklonal (2 mg/ml), IgG anti-manusia monoklonal
(2 mg/ml) dan IgY anti-ayam kambing (1 mg/ml) disemprotkan pada
membran nitroselulosa dengan kecepatan 1 l /cm dengan pembuat film
penyemprot emas dan ditandai sebagai garis M, garis G dan garis C,
kemudian zikir dikeringkan pada suhu 45 ◦C semalam.
2.6. Tes kinerja kit
Untuk memverifikasi sensitivitas dan spesifisitas kit, kami mengumpulkan 58
sampel serum tidak aktif dari pasien COVID-19 yang dikonfirmasi dengan deteksi
asam nukleat dan 95 sampel serum tidak aktif dari pasien dengan penyakit yang
tidak terkait untuk studi klinis. Semua sampel
Gambar 2. Analisis SDS-PAGE ekspresi protein N. Jalur M: penanda (100, 70, 50, 40, 30, 25 dan 14 kDa); Jalur 1, supernatan yang tidak diinduksi; jalur 2, supernatan yang
diinduksi IPTG (37◦C); jalur 3, supernatan yang diinduksi IPTG (20◦C); jalur 4, supernatan induksi otomatis; jalur 5, lisat sel yang tidak diinduksi; jalur 6, Seluruh sel lisat
dengan induksi IPTG (37◦C); jalur 7, Seluruh sel lisat dengan induksi IPTG (20◦C); jalur 8, seluruh sel lisat dengan induksi otomatis.
3
Ekspresi dan Pemurnian Protein 186 (2001) 105908
berasal dari Rumah Sakit Pertama Kota Yueyang. Semua prosedur yang
melibatkan peserta manusia dalam penelitian ini sesuai dengan Deklarasi
Helsinki dan disetujui oleh komite etik rumah sakit. Tes antibodi cepat aliran
lateral dilakukan di kabinet biosafety. Setelah menambahkan 10 l sampel
serum yang tidak aktif ke dalam bantalan sampel kit, dan 100 l PBS dengan
cepat ditambahkan ke bantalan sampel kit. 15 menit kemudian, hasil tes
ditentukan secara kualitatif dengan pewarnaan garis IgM dan/atau IgG dan
garis kontrol.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Konstruksi vektor
Enzim restriksi apa saya dan Xho Saya digunakan untuk pencernaan
enzim dari ekspresi DNA plasmid. Produk pencernaan diidentifikasi
dengan elektroforesis gel agarosa, pita vektor 4200 bp dan fragmen
gen sisipan 2300 bp dapat diperoleh setelah pencernaan enzim, yang
konsisten dengan nilai teoritis 4201bp dan 2349bp. Dengan tambahan
hasil sekuensing DNA (data tidak ditampilkan), hasil pencernaan
restriksi ini menunjukkan bahwa plasmid rekombinan berhasil
dibangun dengan benar (Gambar 1).
3.2. Ekspresi protein N pada E. coli BL21 (DE3)
Protein rekombinan SARS-CoV-2 N mengandung 447 asam amino dan
berat molekul yang diharapkan adalah 48,85 kDa. Kondisi induksi yang
berbeda (20◦C dan 37 ◦C) dan medium (induksi IPTG dan autoinduksi) dicoba
untuk mengekspresikan protein terlarut, namun hanya sedikit protein
terlarut yang diekspresikan, sebagian besar protein target berada di badan
inklusi. Sebagai prediksi, tanpa induksi protein N tidak terekspresi baik pada
supernatan maupun pelet (Gambar 2., jalur 1,5). Setelah induksi IPTG, ada
pita protein target yang jelas pada 49 kDa (Gambar 2., jalur 6,7). Namun
protein N diekspresikan pada badan inklusi baik pada 20◦C atau 37 ◦C (
Gambar 2., jalur 2,3,6,7). Anehnya, protein N tidak diinduksi dengan media
autoinduksi baik pada supernatan atau badan inklusi (Gambar 2., jalur 4,8).
Protein N rekombinan diekspresikan pada BL21 (DE3) dalam badan inklusi
dengan tingkat ekspresi yang sangat tinggi.
3.3. Pemurnian protein N
Pada penelitian ini ditemukan bahwa protein N dapat berikatan kuat
dengan resin kation kuat SP dan terelusi pada konsentrasi NaCl yang relatif
tinggi (0,45 M) (Gambar 3). Namun, puncak elusi juga mengandung
sejumlah kecil protein inang dan asam nukleatE.coli, dan sulit untuk
G.Li dkk. Ekspresi dan Pemurnian Protein 186 (2001) 105908

Gambar 3. kromatografi pertukaran kuat SP.

Gambar 4. Kromatografi pertukaran kation CM.

lebih meningkatkan kemurnian setelah mencoba beberapa kondisi yang berbeda. Kami antibodi, dan ada pita reaksi spesifik pada 49 kDa (Gambar 5).
kemudian menggunakan resin kation lemah CM untuk mengadsorpsi elusi kation SP
setelah lima kali pengenceran dengan buffer PB, protein N dapat dielusi pada
3.4. Tes kinerja kit
konsentrasi NaCl yang relatif rendah (0,35 M), dan yang lebih penting adalah protein
pengotor dapat dipisahkan secara efisien dari protein N (Gambar 4). Dengan dua langkah
Kit immunoassay emas koloid yang disiapkan di rumah kami diuji spesifisitas
kromatografi pertukaran ion, kami dapat memperoleh 50 mg protein N terlarut yang
dan sensitivitasnya dengan 58 COVID-19 dan 95 sampel serum tidak aktif pasien
dilipat ulang per liter kaldu fermentasi. Metode pemurnian ini dapat memperoleh protein
yang tidak terkait, yang diverifikasi dengan kit deteksi asam nukleat (Gambar 6).
N dengan kemurnian tinggi dengan efisiensi dan kesederhanaan yang tinggi.
Sampel serum diperoleh dari gejala pasien COVID-19 mulai dari 7 hari hingga 40
Dibandingkan dengan kromatografi afinitas yang umum digunakan, seperti Ni-NTA, resin
hari, dan diberi label acak dengan nomor. Konduktor eksperimen tidak
kationik lemah CM memiliki selektivitas pengikatan yang lebih tinggi untuk protein N,
mengetahui informasi pasien dan mengungkapkannya hanya setelah semua tes
namun, protein target N tidak dapat dielusi oleh konsentrasi imidazol tinggi dengan resin
selesai. Hasil penelitian menunjukkan bahwa antibodi IgM dan IgG dari 95 sampel
Ni NTA, sehingga menghasilkan protein N yang lebih rendah. (data tidak ditampilkan).
dengan penyakit yang tidak terkait adalah negatif. Di antara 58 sampel pasien
COVID-19, 40 sampel menunjukkan IgM positif, dan 42 sampel menunjukkan IgG
Elektroforesis SDS-PAGE menunjukkan bahwa berat molekul protein
positif, dan spesifisitas masing-masing adalah 69,0% dan 72,4% (Tabel 1). Hasil ini
N murni adalah sekitar 50 kDa, yang sesuai dengan harapan, dan
konsisten dengan uji imunosorben terkait-enzim yang dilaporkan menggunakan
kemurnian protein lebih dari 90%. Protein N rekombinan diidentifikasi
protein N terlarut, dan hasilnya menunjukkan bahwa kit yang disiapkan di rumah
dengan western-blotting menggunakan antibodi monoklonal kelinci
kami dengan protein N larut yang dilipat ulang dapat digunakan untuk
terhadap protein N SARS-CoV-2 sebagai
mendeteksi SARS-CoV-2

4
G.Li dkk. Ekspresi dan Pemurnian Protein 186 (2001) 105908

Gambar 5. Analisis protein SARS-CoV-2 N yang dimurnikan. J: Analisis SDS–PAGE dari protein N murni; B: Western blotting oleh antibodi monoklonal kelinci protein anti-
SARS-CoV-2 N. BSA digunakan sebagai kontrol negatif (jalur C).

Pasien positif PCR mungkin karena pasien tersebut berada pada masa infeksi awal
“window period”. Agregasi atau degradasi antibodi yang terjadi setelah
penyimpanan serum dalam jangka panjang juga dapat menyebabkan hasil negatif
palsu dengan metode deteksi antibodi. Karena keterbatasan sampel pasien di
Cina, ukuran sampel yang digunakan dalam penelitian ini kecil, dan diperlukan
lebih banyak sampel untuk verifikasi lebih lanjut.

4. Kesimpulan

Dibandingkan dengan sistem ekspresi eukariotik, sistem ekspresi prokariotik memiliki keuntungan dari tingkat efisiensi yang lebih tinggi dan biaya yang lebih rendah,

E.coli adalah pilihan yang baik untuk mengekspresikan protein N. Kami menemukan bahwa protein N terlarut dapat diekspresikan dalam kondisi induksi ringan, tetapi tingkat

ekspresinya sangat rendah, ini membuat tantangan yang sangat besar untuk produksi skala besar. Ekspresi tubuh inklusi menghasilkan sejumlah besar protein N dan sangat

kondusif untuk pemurnian dan aplikasi lebih lanjut. Seperti kebanyakan protein nukleokapsid, protein SAR CoV-2 N memiliki nilai pI yang tinggi (10,07), dapat berikatan dengan

RNA dan beberapa protein sel inang yang akan berkopurifikasi dengan protein N pada produk akhir. Kontaminasi ini pada akhirnya dapat menyebabkan hasil positif palsu ketika

digunakan untuk deteksi immunoassay. Kromatografi afinitas konvensional untuk pemurnian protein N dengan resin nikel tidak mencapai efek yang diinginkan di lab kami, jadi

kami merancang proses pemurnian berdasarkan perbedaan halus antara kromatografi penukar ion kuat dan kromatografi penukar ion lemah. Prosedur pemurnian kombinasi ini

dapat memperoleh protein N yang sangat murni dan dapat menghilangkan sebagian besar kontaminasi asam nukleat dan protein inang, dan prosesnya sederhana, nyaman, dan

berbiaya rendah, yang sangat kondusif untuk produksi dan aplikasi protein N skala besar. Kit immunoassay emas koloid yang disiapkan dengan protein N larut yang dilipat

kembali dapat memenuhi kebutuhan deteksi awal dan cepat. Metode ini dapat membantu dalam pemurnian protein tubuh inklusi lainnya dengan matriks kromatografi yang

sesuai yang akan dipilih secara hati-hati untuk protein spesifik. Prosedur pemurnian kombinasi ini dapat memperoleh protein N yang sangat murni dan dapat menghilangkan

sebagian besar kontaminasi asam nukleat dan protein inang, dan prosesnya sederhana, nyaman, dan berbiaya rendah, yang sangat kondusif untuk produksi dan aplikasi protein

N skala besar. Kit immunoassay emas koloid yang disiapkan dengan protein N larut yang dilipat kembali dapat memenuhi kebutuhan deteksi awal dan cepat. Metode ini dapat

membantu dalam pemurnian protein tubuh inklusi lainnya dengan matriks kromatografi yang sesuai yang akan dipilih secara hati-hati untuk protein spesifik. Prosedur

pemurnian kombinasi ini dapat memperoleh protein N yang sangat murni dan dapat menghilangkan sebagian besar kontaminasi asam nukleat dan protein inang, dan prosesnya

Gambar 6. Deteksi sampel serum menggunakan colloidal gold test kit.1, IgG dan sederhana, nyaman, dan berbiaya rendah, yang sangat kondusif untuk produksi dan aplikasi protein N skala besar. Kit immunoassay emas koloid yang disiapkan dengan protein

IgM negatif; 2, IgM positif; 3, IgG positif; 4, Baik IgG dan IgM positif. N larut yang dilipat kembali dapat memenuhi kebutuhan deteksi awal dan cepat. Metode ini dapat membantu dalam pemurnian protein tubuh inklusi lainnya dengan matriks

kromatografi yang sesuai yang akan dipilih secara hati-hati untuk protein spesifik. Kit immunoassay emas koloid yang disiapkan dengan protein N larut yang dilipat kembali dapat

memenuhi kebutuhan deteksi awal dan cepat. Metode ini dapat membantu dalam pemurnian protein tubuh inklusi lainnya dengan matriks kromatografi yang sesuai yang akan

Tabel 1 dipilih secara hati-hati untuk protein spesifik. Kit immunoassay emas koloid yang disiapkan dengan protein N larut yang dilipat kembali dapat memenuhi kebutuhan deteksi awal

Hasil diagnostik IgM dan IgG Antibodi untuk sampel serum. dan cepat. Metode ini dapat membantu dalam pemurnian protein tubuh inklusi lainnya dengan matriks kromatografi yang sesuai yang akan dipilih secara hati-hati untuk protein

IgG terhadap SAR CoV-2 IgM terhadap SAR CoV-2 spesifik.

Positif Negatif Positif Negatif

pasien COVID-19 42 16 40 18
Pasien penyakit yang tidak berhubungan 0 95 0 95
Deklarasi kepentingan bersaing

antibodi IgG dan IgM [11].
Ada 13 sampel positif COVID-19 yang dikonfirmasi menunjukkan hasil
negatif dengan alat tes IgG dan IgM kami. Respon antibodi terhadap protein
nukleokapsid SARS-CoV-2 setelah infeksi virus lebih lambat dari jendela
deteksi virus PCR. Hasil deteksi antibodi negatif dengan
Penulis (s) menyatakan tidak ada kepentingan bersaing.
ucapan terima kasih
Penelitian ini didukung oleh Yayasan Ilmu Pengetahuan Alam

5
G.Li dkk.
Departemen Sains dan Teknologi Hunan (2019jj70006) dan yayasan
penelitian ilmiah dari Departemen Pendidikan Hunan (20c1872).
Referensi
[1] P. Zhou, XL Yang, XG Wang, B. Hu, L. Zhang, W. Zhang, dkk., Wabah pneumonia yang
terkait dengan coronavirus baru yang kemungkinan berasal dari kelelawar, Nature 579
(7798) (2020 Mar) 270– 273.
[2] J. Sadasivan, M. Singh, JD Sarma, ekor sitoplasma protein lonjakan coronavirus
memiliki sinyal penargetan intraseluler, J. Biosci. 42 (2) (2017 Juni) 231–244.
[3] MH Verheije, MC Hagemeijer, M. Ulasli, F. Reggiori, PJ Rottier, PS Masters, C.
A. de Haan, Protein nukleokapsid coronavirus secara dinamis terkait dengan
kompleks replikasi-transkripsi, J. Virol. 84 (21) (2010 Nov) 11575–11579.
[4] T. Ye, AMV West, S. Silletti, KD Corbett, Arsitektur dan perakitan mandiri protein
nukleokapsid SARS-CoV-2, Protein Sci. 29 (9) (2020 Sep) 1890–1901.
[5] SM Cascarina, ED Ross, Peran yang diusulkan untuk protein nukleokapsid SARS-
CoV-2 dalam pembentukan dan regulasi kondensat biomolekuler, Faseb. J. 34 (8)
(2020 Agustus) 9832–9842.
[6] W. Zeng, G. Liu, H. Ma, D. Zhao, Y. Yang, M. Liu, A. Mohammed, C. Zhao, Y. Yang,
J. Xie, C. Ding, X. Ma, J. Weng, Y. Gao, H. He, T. Jin, Karakterisasi biokimia protein
nukleokapsid SARS-CoV-2, Biochem. Biofis. Res. komuni. 527 (3) (2020 Jun 30) 618–
623.
[7] PD Burbelo, FX Riedo, C. Morishima, S. Rawlings, D. Smith, S. Das, JR Strich,
DS Chertow, RT Davey Jr., JI Cohen, Deteksi antibodi nukleokapsid terhadap SARS-CoV-2
lebih sensitif dibandingkan antibodi terhadap protein lonjakan pada pasien COVID-19.
Ekspresi dan Pemurnian Protein 186 (2001) 105908
medRxiv [Pracetak]. Perbarui di, J. Infeksi. Dis. (2020 19 Mei),https://doi.org/
10.1101/2020.04.20.20071423. PMID: 32511445.
[8] SM Cascarina, ED Ross, Peran yang diusulkan untuk protein nukleokapsid SARS-
CoV-2 dalam pembentukan dan regulasi kondensat biomolekuler, Faseb. J. 34 (8)
(2020 Agustus) 9832–9842.
[9] C. Sheridan, Tes cepat dan portabel online untuk mengekang pandemi coronavirus, Nat.
Bioteknologi. 38 (5) (Mei 2020) 515–518.
[10] ES Theel, P. Slev, S. Wheeler, MR Couturier, SJ Wong, K. Kadkhoda, Peran tes antibodi
untuk SARS-CoV-2: adakah? J.klin. Mikrobiol. 58 (8) (23 Juli 2020) e00797-20.
[11] W. Liu, L. Liu, G. Kou, Y. Zheng, Y. Ding, W. Ni, Q. Wang, L. Tan, W. Wu, S. Tang,
Z. Xiong, S. Zheng, Evaluasi nukleokapsid dan uji imunosorben terkait-enzim
berbasis protein lonjakan untuk mendeteksi antibodi terhadap SARS-CoV-2, J. Clin.
Mikrobiol. 58 (6) (26 Mei 2020) e00461-20.
[12] Z. Chen, Z. Zhang, X. Zhai, Y. Li, L. Lin, H. Zhao, L. Bian, P. Li, L. Yu, Y. Wu, G. Lin, Deteksi cepat
dan sensitif anti -SARS-CoV-2 IgG, menggunakan immunoassay aliran lateral berbasis
nanopartikel yang didoping lantanida, Anal. Kimia 92 (10) (2020 19 Mei) 7226–7231.
[13] AP Espejo, Y. Akgun, AF Al Mana, Y. Tjendra, NC Millan, C. Gomez-Fernandez,
C. Cray, Tinjauan kemajuan terkini dalam pengujian serologis untuk COVID-19, Am. J.klin.
Patol. 154 (3) (2020 Agustus 5) 293–304.
[14] T. Djukic, M. Mladenovic, D. Stanic-Vucinic, J. Radosavljevic, K. Smiljanic,
L. Sabljic, M. Devic, D. Cujic, T. Vasovic, A. Simovic, M. Radomirovic, T. Cirkovic
Velickovic, Ekspresi, pemurnian dan karakterisasi imunologi fragmen protein
nukleokapsid rekombinan dari SARS-CoV-2, Virology 557 ( 2021 Mei) 15–22.
[15] F William Studier, Produksi protein dengan induksi otomatis dalam kultur pengocok
densitas tinggi, Protein Expr. Purif. 41 (1) (2005 Mei) 207–234.