Pengembangan Multi-Biomarker Penyakit Uji Aktivitas

untuk Rheumatoid Arthritis

Michael Centola1., Guy Cavet2 *., Yijing Shen3, Saroja Ramanujan2, Nicholas Knowlton4,

Kathryn A. Swan2, Mary Turner1, Chris Sutton1, Dustin R. Smith1, Douglas J. Haney2, David
Chernoff5,

Lyndal K. Hesterberg6, John P. Carulli7, Peter C. Taylor8, Nancy A. Shadick9, Michael E.

Weinblatt9,

Jeffrey R. Curtis10

1 Arthritis dan Imunologi, Oklahoma Medis Research Foundation, Oklahoma City, Oklahoma,
Amerika Serikat, 2 Jurusan Teknik Informatika, Crescendo

Bioscience Inc, South San Francisco, California, Amerika Serikat, 3 Departemen Biostatistik dan
Bioinformatika, Crescendo Bioscience, Inc, South San Francisco,

California, Amerika Serikat, 4 Biomarker & proteomik Inti Sarana, Oklahoma Yayasan Medical
Research, Oklahoma City, Oklahoma, Amerika Serikat,

5 Departemen Kedokteran, Crescendo Bioscience, Inc, South San Francisco, California, Amerika
Serikat, 6 Departemen Pengembangan, Crescendo Bioscience,

Inc, South San Francisco, California, Amerika Serikat, 7 Genetika dan Genomics Group, Biogen
Idec, Cambridge, Massachusetts, Amerika Serikat,

8 Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, Oxford, Inggris, 9 Divisi

Reumatologi, Imunologi dan Alergi, Brigham dan Wanita

Rumah Sakit, Boston, Massachusetts, Amerika Serikat, 10 Divisi Imunologi Klinik dan
Rheumatology, University of Alabama di Birmingham, Birmingham,

Alabama, Amerika Serikat

Abstrak

Latar Belakang: Pengukuran aktivitas Penyakit adalah komponen kunci dari rheumatoid arthritis
(RA) manajemen. Biomarker yang

menangkap biologi yang kompleks dan heterogen RA memiliki potensi untuk aktivitas penyakit
klinis

penilaian.
Tujuan: Untuk mengembangkan aktivitas penyakit multi-biomarker (MBDA) tes untuk
rheumatoid arthritis.

Metode: Calon serum protein biomarker dipilih dari layar literatur yang luas, database
bioinformatika,

ekspresi mRNA dan protein microarray data. Tes kuantitatif diidentifikasi dan dioptimalkan
untuk calon mengukur

biomarker di RA sera pasien. Biomarker dengan tes kualifikasi yang diprioritaskan dalam
serangkaian studi berdasarkan mereka

korelasi untuk RA aktivitas penyakit klinis (misalnya Penyakit Kegiatan Skor Protein 28-C-
reaktif [DAS28-CRP], divalidasi

metrik yang umum digunakan dalam uji klinis) dan kontribusi mereka untuk model multivariat.
Biomarker diprioritaskan digunakan untuk

melatih algoritma untuk mengukur aktivitas penyakit, dinilai oleh korelasi untuk DAS dan
daerah di bawah penerima operasi

kurva karakteristik untuk klasifikasi rendah vs moderat aktivitas penyakit tinggi /. Pengaruh
komorbiditas pada MBDA

Rata dievaluasi menggunakan model linear dengan penyesuaian untuk pengujian hipotesis
beberapa.

Hasil: 130 kandidat biomarker diuji dalam studi kelayakan dan 25 dipilih untuk pelatihan
algoritma. Multibiomarker

model statistik mengungguli biomarker individu pada memperkirakan aktivitas penyakit. Skor
berbasis biomarker

secara signifikan berkorelasi dengan DAS28-CRP dan bisa membedakan pasien dengan /
penyakit klinis tinggi rendah vs moderat

aktivitas. Skor tersebut juga dapat melacak perubahan DAS28-CRP dan secara signifikan terkait
dengan kedua sendi

peradangan diukur dengan ultrasound dan kerusakan perkembangan diukur dengan radiografi.
The MBDA menggunakan algoritma akhir

12 biomarker untuk menghasilkan skor MBDA antara 1 dan 100. Tidak ada efek yang signifikan
pada skor MBDA ditemukan untuk

komorbiditas umum.
Kesimpulan: Kami mengikuti pendekatan bertahap untuk mengembangkan ukuran berbasis
serum kuantitatif aktivitas penyakit RA, berbasis

pada 12-biomarker, yang secara konsisten dikaitkan dengan tingkat aktivitas penyakit klinis.

Citation: Centola M, Cavet G, Shen Y, Ramanujan S, Knowlton N, et al. (2013) Pengembangan

Test Multi-Biomarker Penyakit Kegiatan untuk Rheumatoid

Arthritis. PLoS ONE 8 (4): e60635. doi: 10.1371 / journal.pone.0060635

Editor: Oliver Frey, Rumah Sakit Universitas Jena, Jerman

Menerima 12 Agustus 2012; Diterima 1 Maret 2013; Diterbitkan April 9, 2013

Copyright:? 2013 Centola dkk. Ini adalah sebuah artikel akses terbuka didistribusikan di bawah
persyaratan Lisensi Creative Commons Attribution, yang memungkinkan

penggunaan tak terbatas, distribusi, dan reproduksi dalam media apapun, asalkan penulis asli dan
sumber dikreditkan.

Pendanaan: Karya ini sebagian didukung oleh Crescendo Bioscience dan Biogen Idec. Crescendo
Bioscience ikut bertanggung jawab untuk desain studi, data

pengumpulan, analisis data dan penyusunan naskah. Tidak ada pendanaan eksternal tambahan
yang diterima untuk penelitian ini.

Bersaing Interests: Para penulis memiliki kepentingan berikut. Karya ini sebagian didukung oleh
Crescendo Bioscience dan Biogen Idec. GC, YS, SR, KS, DS,

DH, LH: karyawan Crescendo Bioscience; MC, NK, CS, DC, PT, MW, JC: konsultan untuk
Crescendo Bioscience; GC, YS, SR, KS, DS, DH, LH, MC, CS, DC: saham

Pilihan di Crescendo Bioscience. GC, MC, NK, YS: penemu dari US permohonan paten #
20110137851 ('' Biomarker dan Metode untuk Mengukur dan Pemantauan

Penyakit radang Kegiatan '') berdasarkan pekerjaan ini. JPC digunakan oleh Biogen Idec.
Makalah ini menjelaskan pengembangan teknologi diagnostik saat ini

dipasarkan oleh Crescendo Bioscience. Tidak ada paten lanjut, produk dalam pembangunan atau
produk yang dipasarkan untuk menyatakan. Ini tidak mengubah penulis '

kepatuhan terhadap semua PLoS ONE kebijakan berbagi data dan bahan, seperti yang dijelaskan
secara online di buku untuk penulis.

* E-mail: glcavet@gmail.com

. Para penulis ini kontribusi sama untuk pekerjaan ini.

PLOS ONE | www.plosone.org 1 April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e60635

Pengantar

RA adalah umum, kronis, penyakit autoimun idiopatik dengan

lebih dari 1,3 juta orang didiagnosis di Amerika Serikat dan lebih dari 4 juta

di seluruh dunia. RA ditandai dengan sinovitis, inflamasi sendi

cairan, degradasi kartilago artikular, erosi marjinal

tulang, dan manifestasi kekebalan tubuh dan inflamasi sistemik.

Meskipun kemajuan terbaru dalam perawatan, termasuk pengenalan

agen biologis ampuh, aktivitas penyakit substansial tetap di banyak

pasien, disertai tulang yang progresif dan jaringan lunak

kerusakan, konsekuensi ekstra-artikular, kecacatan, dan peningkatan

mortalitas.

Beberapa penelitian, seperti TICORA, CAMERA, BeSt, dan

FinRACO, telah menunjukkan hasil yang lebih baik dengan ketat

pengendalian aktivitas penyakit, strategi mempekerjakan penyakit yang sering

pengukuran aktivitas dan penyesuaian pengobatan untuk mencapai tertentu

Target tingkat aktivitas penyakit [1-3]. Perlakukan untuk Target pedoman menyusun

Hasil ini menjadi rekomendasi khusus untuk perawatan optimal

termasuk pemantauan aktivitas penyakit sering untuk semua pasien [4].

Pedoman ACR juga merekomendasikan pengujian aktivitas penyakit biasa

[5]. Namun tidak ada standar emas saat ini untuk aktivitas penyakit

penilaian dalam RA. Beberapa langkah-langkah yang digunakan, masing-masing dengan

berbagai

kekuatan dan kelemahan, sehingga tidak ada satu ukuran 'terbaik' dari

aktivitas penyakit dapat direkomendasikan di AS atau internasional

Pedoman RA.

Indeks aktivitas penyakit saat ini adalah skor biasanya komposit

yang dapat mencakup penilaian dokter gejala, pasien

langkah-langkah dilaporkan, dan pengukuran laboratorium. Penyakit

Kegiatan Score (DAS), yang Sederhana Penyakit aktivitas Index (SDAI)

dan Klinis Penyakit Activity Index (CDAI), misalnya, mengandalkan

pada jumlah sendi, penilaian diri pasien dan (dengan pengecualian

CDAI) tes laboratorium, sedangkan Penilaian Rutin Pasien

Indeks Data-3 hanya didasarkan pada Pro [6-9]. Meskipun dokter

evaluasi dan pelaporan diri pasien adalah komponen penting dari

penilaian pasien dan manajemen, mereka dipengaruhi oleh intraand

variabilitas antar-penilai dan dapat dikacaukan oleh komorbiditas

atau akumulasi kerusakan sendi akibat lama

penyakit [10-13].

Biomarker protein dapat memberikan pelengkap, obyektif, dan

pengukuran terpercaya mencerminkan patofisiologi yang mendasari

proses. Laju endap darah (ESR) dan CRP

pengukuran saat dimasukkan ke dalam penyakit klinis

langkah-langkah kegiatan, termasuk DAS dan SDAI. Namun, ini

biomarker merupakan indikator non-spesifik peradangan yang dapat

meningkat karena usia, anemia dan adanya imunoglobulin,

dan yang bisa tiba-tiba rendah atau bahkan normal pada pasien dengan

penyakit aktif, mungkin karena genetik yang mendasari [14-16].

Oleh karena itu, ESR dan pengukuran CRP mungkin tidak berguna dalam semua

Pasien RA, dan biomarker lainnya dapat memberikan penting

informasi tentang keadaan penyakit. Studi penelitian sebelumnya memiliki

melaporkan bahwa biomarker protein lain yang terlibat dalam

patofisiologi penyakit sendi, seperti endotel vaskular

faktor pertumbuhan-A (VEGF-A) dan matriks metaloproteinase 3

(MMP3), juga berkorelasi dengan aktivitas penyakit [17-20]. Kita

hipotesis bahwa pengukuran protein serum beberapa

biomarker digabungkan menjadi skor tunggal bisa kuantitatif

dan obyektif ciri aktivitas penyakit RA dan meningkatkan

saat penilaian aktivitas penyakit. Pemantauan berkala ini

Rata bisa melengkapi pendekatan yang ada untuk perawatan pasien,

memfasilitasi pelacakan kuantitatif status pasien dan pengobatan

dampak dan manajemen mendukung kasus sulit seperti

pasien dengan komorbiditas atau dokter bertentangan vs pasien

penilaian. Kami menerapkan proses pembangunan multi-langkah menggunakan

beberapa kohort beragam untuk memprioritaskan biomarker aktivitas penyakit

dan mengembangkan aktivitas penyakit multi-biomarker seperti (MBDA) Rata

untuk penilaian aktivitas penyakit RA. Skor ini memiliki

kemudian diuji dan divalidasi pada pasien tambahan

[21,22].

Metode

Pernyataan Etika

Studi klinis digunakan sebagai sumber sampel biomarker yang

disetujui oleh kelembagaan dewan peninjau (Mitra Kelembagaan

Review Board untuk KUNINGAN, Oklahoma Yayasan Penelitian Medis

Kelembagaan Dewan Ulasan untuk kohort Oklahoma City,

dan Kuorum Institutional Review Board untuk menginformasikan) dan semua

pasien memberikan persetujuan tertulis.

Ikhtisar

Pendekatan multi-tahap untuk penemuan biomarker dan algoritma

pengembangan digunakan (Tabel 1). Dalam Tahap 1, Penyaringan, calon

biomarker diidentifikasi dan tes sesuai dipilih

dan dioptimalkan. Tahap 2, Kelayakan, melibatkan dua bagian: tahap 2A

termasuk empat penelitian untuk menilai dan memprioritaskan biomarker berdasarkan

hubungan mereka dengan aktivitas penyakit klinis; Tahap 2B adalah pilot

studi pencitraan untuk memverifikasi bahwa multi-biomarker skor aktivitas penyakit

bisa menangkap aspek penting dari aktivitas penyakit. Tahap 3, Test

Pengembangan, terlibat optimasi pengujian lebih lanjut, biomarker

seleksi, dan pelatihan dan seleksi dari MBDA akhir

algoritma. Setelah algoritma diselesaikan, dampak

komorbiditas pada skor MBDA dinilai.

Pasien Kohort & Sampel

Biomarker yang diuji dari sampel serum disimpan diperoleh

dari pasien dari beberapa studi klinis / kohort. Serum adalah

dikumpulkan dalam standar Serum Separator Tabung sesuai dengan

produsen instruksi dan dibekukan pada 280 Celcius dalam waktu 72

jam. Bahan dipertahankan antara 2 dan 8 derajat Celcius

sampai beku kecuali di kohort KUNINGAN, yang tabung SST

dikirim pada suhu ambien sebelum pemisahan serum

dengan sentrifugasi. Dalam semua studi kecuali Imaging Tahap 2B Percontohan

studi, kohort observasional digunakan. Tujuannya adalah untuk

mengevaluasi penggunaan populasi dimaksudkan untuk tes MBDA: beragam

pasien mewakili populasi RA di Amerika Serikat

dan Eropa Barat, diperlakukan sesuai dengan norma-norma praktek saat ini.

Alasan untuk menggunakan beberapa kohort observasional adalah 1) untuk

memastikan bahwa hanya biomarker yang berperilaku secara konsisten di seluruh

populasi pasien yang berbeda akan dipilih untuk digunakan di final

Algoritma MBDA, dan 2) untuk mengakses nomor yang cukup besar

pasien untuk kekuatan statistik yang memadai. Dalam Tahap 2B Percontohan

Pencitraan studi tujuannya adalah untuk menguji hubungan

antara biomarker aktivitas penyakit dan tindakan penyakit berdasarkan

pada pencitraan sendi, dan kohort terpilih karena

ketersediaan berkualitas tinggi USG dan data citra X-ray. Dalam semua

Studi penentuan aktivitas penyakit klinis dilakukan

menggunakan metode standar (ref) dan penilaian yang dilakukan

tanpa pengetahuan tentang konsentrasi biomarker (yang

ditentukan kemudian).

Semua pasien terpenuhi setidaknya 4 dari 7 dari 1987 direvisi ACR

kriteria untuk RA [23]. Kriteria eksklusi berlaku untuk semua sumber

kohort adalah: oral (0,10 mg / hari) atau parenteral (ada) kortikosteroid

menggunakan dalam 4 minggu terakhir; wanita yang sedang hamil, menyusui, atau

merencanakan kehamilan dalam waktu 6 bulan dari studi pendaftaran; tanda-tanda atau

gejala ginjal berat, progresif atau tidak terkendali, hati,

hematologi, gastrointestinal, endokrin, paru, jantung,

neurologis, atau penyakit otak; diagnosis bersamaan atau sejarah

gagal jantung kongestif; sejarah diketahui demielinasi sebuah

Multi-Biomarker Penyakit Uji Aktivitas untuk RA

PLOS ONE | www.plosone.org 2 April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e60635

Penyakit; setiap keganasan dikenal saat atau dalam sebelumnya 5

tahun (dengan pengecualian sel basal atau karsinoma sel skuamosa

dari kulit yang telah sepenuhnya dipotong dengan tidak ada bukti

kekambuhan); seropositif untuk HIV; infeksi aktif atau aktif

penyalahgunaan zat. Lihat Tabel 2 untuk karakteristik kohort.

Studi kelayakan. Sampel serum diperiksa di Kelayakan

Studi I-IV yang berasal dari kelompok Oklahoma City, sebuah

studi observasional pasien terlihat di klinik masyarakat terletak

di dan sekitar Oklahoma City, OK, dan dari Brigham dan

Wanita Rheumatoid Arthritis Sequential Studi (KUNINGAN)

Registry [24,25], sebuah studi kohort observasional pasien terlihat

di Brigham dan Rumah Sakit Wanita di Boston, MA. Untuk Pelajaran

Aku, sampel kunjungan tunggal diperoleh dari 128 pasien dengan RA

dari kohort Oklahoma City. Untuk Pelajaran II, sampel kunjungan tunggal

diperoleh dari tambahan 140 pasien dari Oklahoma

Kohort kota dan 180 pasien dari KUNINGAN registry. Untuk Pelajaran

III, sampel serum pada awal, 1 tahun, dan 3 tahun diperoleh

dari masing-masing 85 pasien di KUNINGAN registri, untuk

mengevaluasi utilitas data aktivitas penyakit longitudinal. Untuk Pelajaran

IV, sampel kunjungan tunggal dianalisis dari 119 pasien antara

140 pasien kohort Oklahoma City dari Study II untuk siapa

Volume sampel sisa yang cukup tersedia, untuk

memeriksa biomarker calon baru.

Pilot ImagingStudy. Sampel serum di beberapa titik waktu

(0, 6, 18, 52, 110 minggu) diperoleh dari 24 pasien diikuti

dalam 2 tahun buta studi di Inggris membandingkan methotrexate + di-

Tabel 1. Bertahap Pendekatan yang digunakan dalam penemuan biomarker dan prioritas dan
pengembangan algoritma.

Tahap Studi Tujuan Biomarkers Pasien Sampel

SELEKSI 1 - Calon identifikasi penanda;

Optimasi uji awal

130 * 20 20

KELAYAKAN 2A Studi aku Prioritas 113 128 128

KELAYAKAN 2A Studi II Prioritas 75 320 320

KELAYAKAN 2A Studi III Prioritas 65 85 255

KELAYAKAN 2A Studi evaluasi penanda IV Baru

& Prioritas

16 119 {119 {

KELAYAKAN 2B Percontohan Pencitraan Penilaian kemampuan

penyakit berbasis biomarker

skor aktivitas

0,25 {24 107

PENGEMBANGAN validasi 3 Pelatihan Analytical; Pengembangan

& Pengujian algoritma calon

25 708 708

* 130 biomarker harus terukurnya cukup untuk maju ke studi aktivitas penyakit klinis.

{Pasien dan sampel dalam studi IV merupakan bagian dari mereka dievaluasi dalam studi II.

{Selain 25 biomarker yang kemudian maju untuk model pengembangan (Tahap 3), penelitian ini
juga diperiksa biomarker serum lain dari potensi
minat untuk prediksi perkembangan kerusakan struktural, beberapa di antaranya tumpang tindih
dengan biomarker dipertimbangkan untuk prediksi aktivitas penyakit.

doi: 10.1371 / journal.pone.0060635.t001

Tabel 2. Karakteristik pasien di Kelayakan (Tahap 2) studi

fliximab terapi dikombinasikan dengan methotrexate monoterapi di

agresif RA awal [26,27]. Pasien dievaluasi dengan

USG (AS) pada 0, 18, 54 dan 110 minggu dan mencetak gol untuk

penebalan sinovial (ST) dan untuk vaskularisasi oleh kekuatan Doppler

daerah (PDA). Rincian pencitraan dan scoring telah sebelumnya

dijelaskan [26]. Secara singkat, masing-masing MCP itu mencetak gol untuk ST menggunakan

gambar grayscale pada skala 0-5, dan keseluruhan nilai ST adalah

total skor bagi individu sendi. Jumlah piksel

menunjukkan sinyal Doppler yang dijumlahkan di seluruh 10 MCPs untuk memberikan

skor PDA keseluruhan. Radiografi dilakukan pada 0, 54, dan

110 minggu dan digunakan untuk menentukan jumlah van der Heijde-dimodifikasi

Skor tajam (TSS).

Pelatihan algoritma. Sampel tunggal diperoleh dari masing-masing

dari total 703 pasien dari kohort KUNINGAN dan dari

Indeks untuk Rheumatoid Arthritis Pengukuran (menginformasikan) studi

[28], sebuah studi observasional Amerika Utara multicenter dilakukan

oleh Crescendo Bioscience, South San Francisco, SF. Lima

ratus dua belas pasien dari menginformasikan dipilih (dari

, 1300 total) untuk menjadi wakil dari aktivitas penyakit secara keseluruhan

distribusi dalam penelitian dan juga dari luas Amerika Utara

RA populasi dari mana menginformasikan kohort ditarik. Sebuah

tambahan 29 menginformasikan pasien dipilih untuk memperkaya untuk tinggi

dan aktivitas penyakit yang rendah. Seratus enam puluh tujuh pasien

dipilih dari KUNINGAN registri untuk menangkap berbagai

aktivitas penyakit, memperkaya untuk aktivitas penyakit sangat rendah dan tinggi

(meskipun 5 selanjutnya dikeluarkan dari analisis karena

Data klinis tidak lengkap). Representasi penyakit rendah dan tinggi

pasien aktivitas diperkaya untuk meningkatkan kekuatan untuk mendeteksi

hubungan antara biomarker dan aktivitas penyakit klinis, dan

untuk memastikan bahwa algoritma MBDA bekerja di penyakit penuh

berbagai aktivitas. Semua pasien yang digunakan adalah independen dari orang-orang

dinilai dalam studi prioritas dan pilot pencitraan studi yang terdaftar

di atas. 703 sampel digunakan untuk lebih memprioritaskan

biomarker individu berdasarkan asosiasi mereka dengan klinis

langkah-langkah aktivitas penyakit. Sebuah subset dari pasien ini digunakan untuk

pas akhir dari model statistik yang digunakan dalam MBDA

algoritma. Agar sesuai model optimal, itu penting untuk

memiliki variasi substansial dalam tingkat aktivitas penyakit; oleh karena itu,

subset dari 249 sampel terpilih untuk memiliki nomor yang sama dari

pasien dalam aktivitas penyakit rendah, sedang dan tinggi. The

kinerja model yang paling menjanjikan dari pelatihan itu

dievaluasi dalam subset 70-sampel independen dari 703 sampel,

dipilih untuk memiliki komposisi aktivitas penyakit mirip dengan final

249-sampel training set. Model terbaik yang dievaluasi lebih lanjut di

pasien dari manajemen yang dibantu komputer di arthritis awal

arthritis (CAMERA) studi [21].

Komorbiditas studi. Sampel dari perwakilan 512

Menginformasikan pasien yang digunakan dalam pelatihan algoritma dianalisis untuk

mengevaluasi dampak dari komorbiditas umum di MBDA

skor. Ada atau tidak adanya penyakit penyerta direkam oleh

peneliti studi berdasarkan pengetahuan klinis masing-masing.

Bentuk-bentuk laporan kasus tidak menentukan diagnostik atau klasifikasi

kriteria untuk penyakit selain RA.

Calon Biomarker Seleksi

Analisis sastra. Biomarker Calon dilaporkan sebelumnya

terkait dengan aktivitas penyakit RA atau proses yang mendasari

diidentifikasi melalui review manual artikel ilmiah dan

database bioinformatika temuan diambil dari literatur.

Literatur pencarian pengguna dilakukan dengan menggunakan PubMed (http: //

www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). Bioinformatika pendekatan yang digunakan

Iridescent [29] dan Ingenuity Persiapan Analisis

(Ingenuity Systems, Redwood City, CA).

Tes & Optimasi

Deteksi anti-cyclic peptida citrullinated (PKC) dan

faktor rheumatoid (RF) aktivitas antibodi. Untuk Oklahoma

sampel kohort, anti-PKC diukur menggunakan komersial

tersedia ELISA kit (Quanta Lite PKC 3,1 IgG / IgA Kit,

INOVA Diagnostics Inc, San Diego, CA) dan RF diukur

dengan EL-RF / 3 kit (Theratest Laboratories, Lombard IL). Di

yang KUNINGAN dan menginformasikan sampel kohort kedua RF dan anti-CCP

yang diukur dengan menggunakan analisis Cobas (Roche Diagnostics,

Indianapolis, IN) sesuai dengan instruksi produsen.

Tes calon biomarker. Semua tes dijalankan di 96-

baik piring dengan 8 titik kurva standar (7 standar dan kosong).

Kedua standar dan sampel pasien dijalankan dalam rangkap di

sumur yang berdekatan di piring sama di semua studi. Banyak tunggal masing-masing

uji reagen yang digunakan dalam setiap studi sedapat mungkin untuk

meminimalkan piring variasi piring. Kolam yang tersedia secara komersial

sera manusia (Bioreclamation Inc, Nassau, NY) dari arthritis

pasien arthritis, pasien osteoarthritis, lupus eritematosus sistemik

pasien dan kontrol terpengaruh dijalankan sebagai kontrol proses

pada setiap lempeng. Tes Luminex berbasis dijalankan di kedua

Luminex 100 atau Luminex 200 perangkat dan dianalisis menggunakan baik

Kurva fitting Bioplex (Biorad Inc Hercules, CA) dan 4-parameter

logistik (4PL) kurva pas dengan UU Tenaga Variance pembobotan atau

Software Xponent (Luminex Inc Austin TX) dengan 4PLcurve pas

dan 1 / y2 pembobotan. Meso Skala Discovery (MSD) tes yang

dievaluasi menggunakan Imager Sektor 6000 perangkat (Skala Meso

Discovery, Gaithersburg, MD) menggunakan MSD penemuan Workbench

perangkat lunak dengan 4 parameter kurva logistik pas dan 1 / y2

pembobotan. Tes ELISA berbasis dievaluasi menggunakan Biotek

ELx800 piring pembaca (Biotek Inc Winooski, VT) dan TERIS

perangkat lunak dengan 4 parameter kurva logistik pas dan 1 / y pembobotan.

Sampel dan standar / kalibrator pengenceran disesuaikan sehingga

tingkat penanda yang terbaik diposisikan di bagian linear dari

kurva standar. Untuk Tahapan 1 dan 2, serum dari 20 pasien RA

dengan distribusi perwakilan skor DAS digunakan untuk

mengoptimalkan sensitivitas uji dan jangkauan dinamis, untuk memetakan terbaik RA

Pasien pengukuran protein ke bagian linear dari

kurva standar, dan untuk meminimalkan kebutuhan volume serum.

Tes diuji tercantum dalam Tabel S1, yang juga menunjukkan bagaimana

tes yang multiplexing dan pemasok bahan uji

termasuk standar. Pengenceran sampel akhir, presisi uji dan

batas terukurnya dilaporkan dalam Tabel S2. Untuk Tahap 3

(Pembangunan), tes yang dioptimalkan dan ditandai sebagai

dijelaskan sebelumnya sehingga menjadi sangat konsisten di seluruh studi

dan cocok untuk digunakan dalam tes diagnostik klinis [30]. Rincian

assay multiplexing, pengenceran sampel, batas dan sumber

standar diberikan dalam Tabel S3.

Antibodi Heterophilic dan interferensi RF. Tes sensitif

aktivitas antibodi heterophilic diidentifikasi dengan mengevaluasi

apakah memblokir reagen (Heteroblock, Omega Biologicals,

Bozeman, MT) mengurangi sinyal di 5 sampel dengan titer RF tinggi

tapi tidak dalam 5 sampel dengan RF rendah. Jika uji menunjukkan bukti

gangguan, konsentrasi Heteroblock optimal untuk pengujian yang

ditentukan dengan mengidentifikasi konsentrasi minimum yang

ditekan sinyal palsu dalam sampel RF tinggi, seperti sebelumnya

dijelaskan [31]. Heteroblock kemudian ditambahkan ke semua berikutnya

piring untuk pengujian itu.

Biomarker kontrol kualitas data. Kontrol kualitas dari setiap

piring assay dilakukan dengan memantau kinerja

kontrol proses (kolam serum diencerkan samping sampel pada

setiap lempeng) dan, untuk Tahap 3, juga dari run kontrol (terbuat dari

bahan standar). Pada tahap 1 dan 2, konsistensi kontrol

pemulihan dibandingkan dengan piring lain dalam studi dan

di studi untuk mengidentifikasi setiap piring outlier yang dijamin

Multi-Biomarker Penyakit Uji Aktivitas untuk RA

PLOS ONE | www.plosone.org 4 April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e60635

assay ulangi berjalan. Ketika sinyal sampel individu dalam penelitian adalah

terlalu rendah untuk jatuh pada kurva standar, konsentrasi ditetapkan untuk

nilai terendah yang diamati untuk setiap sampel dalam penelitian itu. Sebaliknya

jika sinyal terlalu tinggi untuk jatuh pada kurva standar,

Konsentrasi ditetapkan untuk nilai tertinggi yang diamati. Dalam Tahap 3,

tabel kontrol didirikan untuk sampel kontrol dengan penerimaan

rentang yang didefinisikan sebagai 63 standar deviasi (SD) dari

nilai yang diharapkan. Jika beberapa kontrol run atau kontrol proses pada

piring telah mengamati konsentrasi di luar jangkauan penerimaan

untuk setiap assay yang diberikan, piring ditandai untuk diperiksa dan diulang

jika diperlukan. Untuk piring yang ditandai untuk diperiksa, standar

kurva diperiksa (yaitu% recovery terhadap konsentrasi diharapkan

dan konsistensi antara duplikat sumur) dan diedit jika

diperlukan untuk menghapus sumur outlier. Jika koefisien sinyal

variasi (CV) antara duplikat sumur sampel yang lebih besar

dari 20%, sampel ditandai untuk diperiksa. Jika salah piring atau

sampel ditentukan tidak dapat diterima, tim review data

memutuskan apakah akan baik menghapus data dari analisis atau rerun
jika volume sampel tambahan yang tersedia.

Analisis Statistik & Modeling

Evaluasi biomarker & prioritas. Dalam setiap studi,

biomarker dinilai dan diprioritaskan berdasarkan univariat dan

Asosiasi multivariat dengan 8 langkah klinis (DAS28-CRP4,

DAS28-ESR4, CDAI, SDAI, bengkak sendi count [SJC], lembut

count bersama [TJC], dan penilaian global pasien (PGA)), baik dalam

seluruh penelitian kohort dan dalam subkelompok didefinisikan oleh autoantibodi

status, jenis kelamin, dan terapi. Data untuk setiap studi dianalisis

secara terpisah. Kebutuhan untuk menyesuaikan data untuk piring untuk variasi piring itu

dinilai untuk setiap studi. Asosiasi univariat antara penanda

tingkat dan langkah-langkah klinis dinilai dengan menggunakan Pearson dan

Spearman korelasi. Signifikansi statistik dinilai setelah

koreksi untuk beberapa pengujian (FDR, 20%, [32]). Multivariat

pemodelan dilakukan dengan menggunakan Ordinary Least Squares (OLS)

regresi, Least Absolute penyusutan dan Seleksi Operator

(Lasso) [33], dan bersih [34] pendekatan pemodelan elastis, masing-masing

dengan pilihan bertahap maju biomarker.

Dalam setiap studi, peringkat univariat dihitung untuk setiap

biomarker berdasarkan jumlah kali penanda berlalu

kriteria signifikansi statistik dalam analisis univariat menggunakan berbeda

Penyakit metrik aktivitas dan subkelompok. Untuk analisis multivariat, sebuah

prioritas ditugaskan untuk setiap biomarker untuk setiap multivariat

berdasarkan urutan masuk ke dalam model model (biomarker pertama

termasuk dalam model menerima prioritas 1, dll). Rata-A adalah

dihitung untuk setiap biomarker sebagai jumlah dari kebalikan dari

nilai prioritas biomarker ini di semua model. Peringkat untuk multivariat

analisis ditentukan oleh menyortir biomarker di turun

urutan skor ini. Biomarker tidak termasuk dalam model apapun yang

diberi peringkat terendah umum. Untuk menggabungkan informasi peringkat

dari analisis univariat dan multivariat, skor gabungan adalah

dihitung sebagai jumlah dari peringkat univariat terbalik dan invers

rank multivariat. Jajaran gabungan ditentukan oleh menyortir

biomarker dalam urutan gabungan skor. The

peringkat gabungan digunakan untuk menginformasikan biomarker kemajuan dari

satu studi kelayakan ke yang berikutnya. Pada akhir Tahap 2, terbalik

jajaran gabungan dari semua Tahap 2 studi yang dijumlahkan untuk

menentukan skor keseluruhan. Biomarker diurutkan secara descending

urutan skor keseluruhan untuk menentukan '' peringkat besar '' yang

bukti dirangkum dari beberapa studi. Rank besar ini adalah

digunakan bersama dengan kriteria lain seperti yang dijelaskan di Hasil, untuk
menginformasikan

kemajuan untuk algoritma pelatihan Tahap 3.

Pilot pencitraan analisis. Studi percontohan pencitraan termasuk

evaluasi hubungan antara tingkat aktivitas penyakit diprediksi

oleh model biomarker multivariat dan US sinovitis, Power

Daerah Doppler, dan perubahan berikutnya dalam TSS, serta

hubungan antara perubahan aktivitas penyakit berbasis biomarker

skor dan perubahan DAS28-CRP. Tinggalkan satu cross-validasi

[35] digunakan untuk menghasilkan berbasis biomarker skor aktivitas penyakit,

dimana skor untuk setiap pasien dibuat menggunakan model

dilatih menggunakan data DAS28-CRP dari semua pasien lain.

Asosiasi dengan langkah-langkah lain dinilai dengan Spearman

korelasi. Korelasi cross-sectional untuk USG ditentukan

di semua waktu-poin yang dipasangkan biomarker / US

pengukuran yang tersedia. Korelasi longitudinal untuk kerusakan

perkembangan dievaluasi untuk penyakit berbasis biomarker dasar

skor aktivitas vs perubahan TSS dari awal sampai tahun 1, dan untuk

tahun kegiatan 1 penyakit skor vs perubahan TSS dari tahun ke tahun 1

2. Korelasi antara perubahan dalam aktivitas penyakit berbasis biomarker

skor dan perubahan DAS28-CRP dievaluasi untuk perubahan dari

dasar untuk tahun 1 dan dari tahun 1 ke tahun 2.

Pelatihan algoritma. Metode multivariat dipertimbangkan dalam

pengembangan algoritma termasuk OLS, Lasso, bersih elastis, dan

juga pendekatan menggabungkan dadih & Whey (CW) multivariat

Metode respon [36] dengan OLS atau Lasso (CW-OLS dan CWLASSO

masing-masing). Kinerja algoritma diukur dengan

Korelasi Pearson untuk DAS28-CRP dan daerah di bawah

penerima operasi kurva karakteristik (AUROC) untuk mengklasifikasikan

pasien ke vs rendah moderat untuk aktivitas penyakit tinggi menggunakan

DAS28-CRP cutoff dari 2,67. Untuk meminimalkan variabilitas kinerja

perkiraan karena jumlah yang tidak seimbang pasien di rendah dan

moderat tinggi kelompok aktivitas penyakit /, AUROC itu juga

dinilai dengan menggunakan ambang alternatif sama dengan median studi

DAS28-CRP. Kinerja metode regresi adalah

dibandingkan di 70/30 cross-validasi (berulang kali melatih di

dipilih secara acak 70% dari data dan pengujian di sisa

30%). Jumlah biomarker di masing-masing model regresi adalah

memilih menggunakan bersarang 10 kali lipat lintas validasi: dalam satu set pelatihan,

Sampel dibagi menjadi 10 kelompok yang sama, model yang dibangun

menggunakan data dari 9 kelompok, dan kinerja diuji di salah satu

kelompok yang tidak digunakan untuk membangun model. Proses ini adalah

diulang, setiap kali dengan kelompok yang berbeda disisihkan untuk

pengujian independen, dan kemudian kinerja itu rata-rata

di semua model. Prosedur ini digunakan untuk model dengan semua

mungkin jumlah variabel, dan jumlah variabel dengan

kinerja terbaik dipilih. Dalam pendekatan CW, bersarang

10-fold cross-validasi digunakan untuk masing-masing sub-model yang sesuai

untuk masing-masing komponen dari DAS untuk mengidentifikasi jumlah optimal

variabel untuk itu sub-model yang. Kinerja MBDA

algoritma diidentifikasi dalam pelatihan dievaluasi oleh Pearson

korelasi untuk DAS28-CRP dalam kumpulan data 70-pasien tes, dan

model melakukan top dipilih.

Komorbiditas analisis. Komorbiditas yang ditandai

menurut tanggapan dokter 'pada menginformasikan bentuk laporan kasus.

Median skor MBDA, CRP, CDAI, dan DAS28-CRP yang

dibandingkan di subkelompok subjek RA dengan dan tanpa berbagai

kondisi komorbiditas, menggunakan rasio nilai median di

dua kelompok. Sebuah rasio 1,0 menunjukkan bahwa nilai skor adalah

tidak terpengaruh oleh komorbiditas tersebut; rasio bermakna lebih tinggi atau
lebih rendah dari 1,0 menunjukkan bahwa komorbiditas yang mungkin tidak tepat

menaikkan atau menurunkan skor, masing-masing. Regresi linier berganda

digunakan untuk mengontrol usia dan jenis kelamin. Pengaruh beberapa pengujian

dikontrol menggunakan metode suku penemuan palsu dari Benjamini

dan Hochberg [32].

Analisis statistik dilakukan dengan pemrograman R

bahasa (http://www.r-project.org) kecuali dinyatakan lain.

Multi-Biomarker Penyakit Uji Aktivitas untuk RA

PLOS ONE | www.plosone.org 5 April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e60635

Hasil

Tahap 1: Screening

Tujuan dari tahap Screening adalah untuk mengidentifikasi protein

yang dapat diukur dalam serum dan yang memiliki potensi untuk menunjukkan

asosiasi untuk aktivitas penyakit RA. Kami fokus pada pengujian serum

karena penggunaan standar serum dalam pengujian klinis Pra

serta literatur menunjukkan asosiasi beberapa ada

protein serum dengan aktivitas penyakit RA [17,20,37-41]; Lihat juga

Tabel S1. Sebanyak 130 calon biomarker didasarkan dipilih

pada komprehensif literatur review, percobaan sebelumnya,

ketersediaan komponen immunoassay, dan evaluasi

terukurnya dalam serum (lihat Metode). Kandidat biomarker ini

kemudian dievaluasi dengan memeriksa hubungan mereka dengan klinis

langkah-langkah aktivitas penyakit dalam serangkaian studi kelayakan.

Tahap 2: Kelayakan

Karakteristik pasien untuk studi kelayakan 4 disediakan

pada Tabel 2.

Kelayakan tahap 2A - biomarker prioritas. Dalam tahap

2A, empat penelitian berturut-turut digunakan untuk memprioritaskan dan mengurangi

daftar biomarker kandidat untuk satu set akhir biomarker untuk algoritma

pembangunan. Tabel S4 menyediakan daftar biomarker dievaluasi dalam

setiap studi, bersama dengan contoh hasil korelasi univariat

dan peringkat biomarker.

Penelitian saya adalah penilaian awal utilitas calon

biomarker untuk memprediksi aktivitas penyakit, untuk memprioritaskan

kira-kira 50 biomarker untuk pengujian lebih lanjut. Pengujian dilakukan dengan

113 biomarker dengan kinerja uji yang memuaskan di

Skrining tahap. Sembilan puluh satu tes yang berbeda untuk 72 unik

biomarker menerima peringkat mencerminkan kontribusi mereka

multivariat model aktivitas penyakit. Lima puluh dua biomarker ini

dipilih untuk kemajuan berdasarkan peringkat mereka gabungan dari

univariat dan multivariat analisis.

Studi II, III, dan IV yang digunakan untuk penyempurnaan lebih lanjut dari

biomarker set. Tujuh puluh lima biomarker dinilai dalam studi II:

selain 52 penanda yang dipilih berdasarkan

dikombinasikan peringkat di Studi I, 23 lain dimasukkan karena kuat

hubungan univariat untuk aktivitas penyakit di Studi I atau karena

tes dimasukkan pada uji multipleks sama lain

diprioritaskan biomarker. Dari 75 biomarker diuji dalam studi II, 65

juga dianalisis dalam studi III (10 tersingkir karena rendah

kinerja). Dalam studi IV, kita kemudian dinilai 16 biomarker baru

bahwa kita tidak diuji sebelumnya, baik karena mereka baru

diidentifikasi sebagai kandidat biomarker atau karena tes baru-baru ini

menjadi tersedia.

Dalam studi II, kami menggunakan hasil dari analisis multivariat untuk meninjau

nilai potensi prototipe model multi-biomarker untuk

aktivitas penyakit. Dalam cross-validasi, model multi-biomarker memiliki

berarti korelasi Pearson dengan DAS28-CRP r = 0,60, dibandingkan

dengan korelasi tertinggi dari setiap individu untuk biomarker

DAS28-CRP r = 0,38, yang diamati dalam penelitian ini untuk CRP. Dalam sebuah

Analisis AUROC memeriksa kemampuan model untuk mengklasifikasikan

pasien menjadi baik aktivitas penyakit rendah atau sedang penyakit / tinggi

Kegiatan kategori menggunakan cutoff klinis 2,67 [42], rata-rata

AUROC adalah 0.89 (Gambar 1). Menggunakan median DAS28-CRP sebagai

ambang batas AUROC rata-rata adalah 0,77.

Dikombinasikan univariat / jajaran biomarker multivariat ditentukan

di masing-masing 4 studi prioritas dan dipandu

keputusan penanda kemajuan antara studi. Karena studi

4 dilakukan dalam subset dari pasien yang sebelumnya dianalisis di

Penelitian II, data pada 16 biomarker baru yang dikombinasikan dengan

pengukuran sebelumnya 75 biomarker untuk menentukan

peringkat dalam penelitian ini.

Hasil studi prioritas 4 biomarker kemudian

dianalisis bersama-sama untuk menentukan satu set biomarker akhir untuk

kemajuan pelatihan algoritma. Jajaran besar dihitung

dari hasil yang terintegrasi dari 4 studi (lihat Metode) adalah

pada Tabel S4. Biomarker dengan peringkat besar # 24 yang

diprioritaskan untuk kemajuan ke pelatihan, dengan mengikuti

pengecualian: apolipoprotein-B dieliminasi karena uji miskin

kinerja, BAFF tersingkir karena bukti bahwa

-Sel B depleting terapi rituximab dipimpin langsung kepada peningkatan besar dalam

tingkat penanda [43], dan CXCL10 dan GM-CSF tersingkir

karena peringkat tinggi mengakibatkan seluruhnya dari kinerja yang baik

dalam studi tunggal. Selanjutnya, empat berpangkat rendah

biomarker dipilih karena representasi mereka kunci

fungsi biologis atau jalur di RA, terutama yang terlibat

oleh biomarker diprioritaskan lainnya: VCAM1 dimasukkan sebagai

melengkapi ICAM1 (molekul adhesi), IL1b adalah

termasuk untuk hubungannya dengan IL1Ra (IL-1 jalur), MMP1 adalah

termasuk untuk kesamaannya dengan MMP3 (baik MMPs) dan CCL22

(MDC) termasuk untuk mewakili monosit / makrofag biologi.

Dengan demikian urutan prioritas penelitian menghasilkan satu set 24

biomarker.

Tahap kelayakan 2B - studi pencitraan percontohan. Secara paralel dengan

tahap selanjutnya dari biomarker prioritas, kami menilai apakah

model prototipe multivariat aktivitas penyakit berdasarkan serum

biomarker menunjukkan berbagai aspek kritis yang efektif

Penyakit ukuran aktivitas, khususnya: sebuah asosiasi dengan clinicallyassessed

aktivitas penyakit dan perubahan di dalamnya; asosiasi dengan

penilaian berbasis pencitraan peradangan sendi; dan asosiasi

dengan perkembangan kerusakan radiografi dinilai berikutnya.

24 diprioritaskan penyakit biomarker aktivitas dinilai

bersama biomarker lain sedang dievaluasi untuk prediksi

perkembangan kerusakan struktural dalam sampel dari studi 2 tahun

klinis, USG, dan hasil radiografi pada awal agresif

RA [26,27]. Menggunakan data untuk semua biomarker diuji, multivariat

model dilatih untuk memperkirakan aktivitas penyakit yang diukur dengan

Gambar 1. Receiver operasi kurva karakteristik untuk biomarker-

berdasarkan model multivariat aktivitas penyakit di Studi II.

Kurva menunjukkan rata-rata tingkat positif benar di 100 lipatan lintas

validasi. Dalam setiap kali lipat model dilatih pada dipilih secara acak

70% dari data dan kinerja diuji pada 30% sisanya.

doi: 10.1371 / journal.pone.0060635.g001

Multi-Biomarker Penyakit Uji Aktivitas untuk RA

PLOS ONE | www.plosone.org 6 April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e60635

DAS28-CRP, dan mengakibatkan skor berbasis biomarker dievaluasi

untuk hubungan ke USG dan radiografi pengukuran

status sendi dan perkembangan kerusakan. Dalam cuti satu crossvalidation,

skor aktivitas penyakit berbasis biomarker yang

signifikan berkorelasi dengan DAS28-CRP (Spearman

rho = 0,82, P, 0,001, Gambar 2a). Penyakit berbasis biomarker

skor aktivitas juga signifikan berkorelasi dengan kedua sinovial

penebalan (rho = 0,46, P, 0,001) dan vaskularisasi bersama (rho = 0,47,

P, 0,001) diukur dengan daya Doppler USG. Selanjutnya,

skor aktivitas penyakit berbasis biomarker secara signifikan

terkait dengan perubahan berikutnya dalam skor total Sharp. Untuk

Misalnya, skor berbasis biomarker dihitung pada awal dan tahun 1

memiliki korelasi Spearman dengan perubahan 12 bulan total Tajam

Rata (baseline untuk tahun 1, tahun 1 ke tahun 2, masing-masing) 0,52

(P, 0,001, Gambar 2b) dibandingkan dengan korelasi 0,43 (P = 0,006)

antara DAS28-CRP dan perubahan total Skor Sharp.

Penyakit skor aktivitas berbasis biomarker dan selanjutnya 12 bulan

perubahan skor Tajam juga berkorelasi bila dihitung

secara terpisah selama dua tahun penelitian (skor dasar vs pertama

korelasi perubahan tahun = 0,44, P = 0,05; tahun 1 skor vs kedua

perubahan korelasi tahun = 0.61, P = 0,005). Karena penelitian ini

termasuk pengukuran serial aktivitas penyakit dengan DAS28-CRP

di setiap pasien, kami mampu mengevaluasi apakah biomarkerbased

skor aktivitas penyakit juga bisa melacak perubahan klinis

aktivitas penyakit. Memang, perubahan dalam skor berbasis biomarker

secara signifikan berkorelasi dengan perubahan DAS28-CRP, dengan

Korelasi Spearman 0,62 (P, 0,001, Gambar 2c).

Akhirnya, dalam proses mengevaluasi hubungan antara

biomarker yang berbeda dengan aktivitas penyakit, menjadi jelas bahwa

pyridinoline, salah satu biomarker sedang diselidiki untuk

prediksi kerusakan struktural dalam sebuah studi terpisah, adalah sangat

berkorelasi dengan DAS28-CRP (rho = 0,47, P, 0,001). Dengan demikian, pyridinoline

ditambahkan ke set penanda untuk Tahap 3 studi, menghasilkan set

dari 25 biomarker diprioritaskan.

Pengembangan: Tahap 3

Optimasi assay. Untuk memastikan bahwa biomarker diprioritaskan

tes yang cukup tepat dan spesifik untuk digunakan dalam klinis

tes diagnostik, kami mengoptimalkan tes biomarker individu untuk

fungsi di lingkungan multipleks dengan presisi di waktu,

instrumen, operator, dan banyak reagen [44]. Dari 25

biomarker memasuki upaya pembangunan di Tahap 3, tujuh orang

dieliminasi pada berbagai titik dalam Tahap 3 karena praktis

pertimbangan: interleukin 8 (IL-8) adalah sangat sensitif terhadap variasi

dalam kondisi koleksi sampel (misalnya pengiriman pada suhu kamar

sebelum serum pemisahan); interleukin 1 beta (IL-1b) tingkat

berada di bawah batas deteksi dalam banyak sampel pasien;

interleukin 6 receptor (IL-6R) telah dieliminasi karena tingkat perusahaan adalah

dramatis dipengaruhi oleh pengobatan dengan tocilizumab (anti-IL-6R

antibodi); dan pyridinoline, calprotectin, dan apolipoprotein AI

dan CIII tersingkir karena tes mereka tidak memenuhi

kriteria kinerja yang diperlukan untuk pengujian klinis.

Pelatihan algoritma. Pada bagian pertama dari pelatihan algoritma,

Data seluruh set 703 pasien digunakan untuk mengkarakterisasi

hubungan antara biomarker dan penyakit aktivitas, sementara

Bagian 249-pasien digunakan untuk latihan terakhir. Demografi

kohort digunakan dalam pelatihan algoritma disajikan pada Tabel 3.

Berbagai pendekatan statistik dievaluasi untuk algoritma

pelatihan (lihat Metode). Kombinasi '' dadih dan whey '' [36]

dan Lasso [33] pendekatan (CW-Lasso) menghasilkan yang terbaik

kinerja cross-validasi dalam pelatihan dan algoritma pengujian

(data tidak ditampilkan). Pemodelan Lasso dengan variabel bertahap ke depan

seleksi dan 10 kali lipat cross-validasi digunakan untuk memilih biomarker

dan mengoptimalkan model linear untuk setiap komponen DAS28-CRP

(kecuali CRP). Maka metode dadih dan whey diaplikasikan

memperbaiki prediksi Lasso diturunkan dengan memanfaatkan

korelasi antara komponen, melalui penerapan

penyusutan matriks [36]. Kinerja Pendekatan ditingkatkan ini

Lasso diturunkan prediksi hitung bersama, sedangkan analisis dari

cross-validasi menunjukkan bahwa masuknya PGA diprediksi atau CRP

dalam matriks penyusutan akan memiliki kinerja gangguan.

Algoritma terakhir adalah model 12-biomarker untuk multibiomarker yang

aktivitas penyakit (MBDA) skor. Dalam algoritma ini, 11

biomarker (tumor necrosis factor receptor I (TNF-RI), interleukin

6 (IL-6), pembuluh darah adhesi sel molekul 1 (VCAM-1), epidermis

faktor pertumbuhan (EGF), VEGF-A, tulang rawan glikoprotein 39 (YKL40),

matriks metaloproteinase 1 (MMP1), MMP3, serum amyloid A

(SAA), leptin, dan resistin) digunakan untuk prediksi TJC28,

SJC28 dan PGA, dengan biomarker yang berbeda dan bobot yang digunakan untuk

memprediksi setiap komponen (Gambar 3). Konsentrasi penanda yang

ditransformasikan ke kekuatan 1/10 untuk menghasilkan normalitas perkiraan

dan meningkatkan kekokohan model multivariat. The

prediksi komponen tersebut kemudian dikombinasikan dengan CRP dalam

persamaan analog dengan yang digunakan untuk menghitung DAS28-CRP, dan

Hasil dibulatkan dan skala untuk menghasilkan bilangan bulat-nilai MBDA

skor dalam kisaran 1-100 (Persamaan 1-7). Kontribusi

CRP dengan skor MBDA mirip dengan kontribusinya terhadap

DAS28-CRP. Dalam 512 menginformasikan pasien digunakan dalam Pembangunan,

CRP memberikan kontribusi rata-rata 16% dari nilai keseluruhan (SD 6%),

dan 25% dari porsi non-konstan skor (SD 13%, sedangkan

Bagian yang tersisa ketika kontribusi 0,96 konstan

dari rumus DAS28-CRP dihapus). Ambang batas untuk

MBDA berbasis klasifikasi aktivitas penyakit ditunjukkan pada Tabel 4;

kategori celana ditentukan dari DAS28- sesuai

Nilai CRP [45] menggunakan hubungan yang ditentukan dalam MBDA

Algoritma: MBDA = round (DAS28-CRP * 10,53 + 1).

DAS28-CRP dan MBDA formula:

DAS28 {CRP ~ 0: 56

ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi

TJC28

z0: 28

ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi

SJC28

z0: 14PGz0: 36 ln (CRPz1) z0: 96

MBDA ~ round½max (min ((0:56

ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi

PTJC28

z0: 28

ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi
PSJC28

z0: 14PPGAz0: 36 ln (CRPz1) z0: 96)

| 10: 53z1,100), 1)?

Lasso diturunkan model komponen:

PTJC28 (0) {38: 564z3:? 997½SAA (1 = 10) z17:? 331½IL6 (1 = 10)

z4:? 665½YKL40 (1 = 10) {15: 236½EGF (1 = 10) z2:? 651½TNFRI (1 = 10)

z2:? 641½Leptin (1 = 10) z4:? 026½VEGFA (1 = 10) {1:? 470½VCAM1 (1 = 10)

CW yang diturunkan model ditingkatkan.

PSJC28 ~ max (0: 173 | PTJC28 (0) z0: 784 | PSJC28 (0), 0)

Multi-Biomarker Penyakit Uji Aktivitas untuk RA

PLOS ONE | www.plosone.org 7 April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e60635

PTJC28, diperkirakan 28 lembut count bersama; PSJC28, diprediksi 28

bengkak count bersama; PPGA, diprediksi penilaian global pasien.

Dampak penyakit penyerta pada skor MBDA. Karena

komorbiditas dapat mempengaruhi penyakit klinis dan berbasis biomarker

penilaian aktivitas, kami mengevaluasi dampak berbagai komorbiditas

pada skor MBDA serta pada aktivitas penyakit klinis

langkah-langkah (DAS28-CRP, CDAI dan CRP) dalam subset dari 512

perwakilan menginformasikan pasien yang digunakan dalam algoritma

pembangunan. The komorbiditas berikut hadir di 10%

atau lebih dari subyek dan dinilai dalam penelitian ini:

hipertensi, fraktur osteoporosis, penyakit sendi degeneratif,

diabetes, dan asma. Tidak ada yang signifikan secara statistik

hubungan antara salah satu komorbiditas ini dan salah satu

langkah-langkah aktivitas penyakit ketika disesuaikan usia dan jenis kelamin, dan

akuntansi untuk beberapa perbandingan (Tabel 5).

Diskusi

Kemajuan dalam analisis biomarker dalam beberapa tahun terakhir telah memungkinkan

pengembangan diagnostik multi-biomarker berdasarkan tes yang

berdampak perawatan pasien dan hasil di berbagai wilayah terapi.

Gambar 2. multivariat berbasis biomarker aktivitas penyakit prediksi dalam hubungannya

dengan pengukuran lain di Pilot Imagingstudy.

Skor aktivitas penyakit prototipe biomarker berbasis vs DAS28-CRP (untuk semua waktu-poin
dengan kedua DAS28-CRP dan pengukuran biomarker) (a);

baseline dan tahun 1 nilai aktivitas penyakit biomarker-diprediksi vs perubahan TSS dari awal
sampai tahun 1 dan dari tahun 1 ke tahun 2 (b); dan perubahan

aktivitas penyakit biomarker-diprediksi vs perubahan DAS28-CRP dari awal sampai tahun 1 dan
dari tahun 1 ke tahun 2 (c). Model berbasis biomarker yang

dilatih terhadap DAS28-CRP dan menghasilkan skor pada skala yang sama.

doi: 10.1371 / journal.pone.0060635.g002

Multi-Biomarker Penyakit Uji Aktivitas untuk RA

PLOS ONE | www.plosone.org 8 April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e60635

Tes berdasarkan jaringan dan darah ekspresi gen perifer, dan

tingkat protein serum, misalnya, telah diperkenalkan untuk

aplikasi pada kanker payudara, transplantasi jantung, dan diabetes tipe 2,

masing-masing [46-48]. Dalam rangka mengembangkan tes klinis berguna untuk

lain aplikasi klinis penting untuk menggunakan memadai

Studi bertenaga dari kohort klinis beragam, secara teknis dioptimalkan

dan divalidasi tes protein, analisis statistik yang ketat dan

beberapa studi berurutan. Kami telah menerapkan pendekatan ini untuk

mengembangkan aktivitas penyakit multi-biomarker (MBDA) tes untuk membantu dalam

penilaian pasien RA.

Pengujian di beberapa kohort klinis beragam adalah aspek penting

dari proses pembangunan. Kinerja biomarker dapat bervariasi

antara kohort karena berbagai faktor termasuk etnis,

bias rekrutmen, pola latihan dan perbedaan teknis.

Pasien dipilih dari beberapa Amerika Utara dan

Situs dan penelitian di Eropa untuk menangkap keragaman dalam aktivitas penyakit,

durasi penyakit, pendekatan pengobatan, jenis kelamin, status serologis dan

karakteristik pasien lainnya. Keragaman ini diperlukan untuk memastikan bahwa

algoritma yang dihasilkan akan berlaku untuk pasien RA yang beragam

meskipun heterogenitas klinis yang luas terlihat di RA.

Optimasi uji teknis dan validasi yang penting untuk

memastikan bahwa hasil uji konsisten dan direproduksi dari waktu ke waktu.

Pada pasien RA itu juga diperlukan untuk memastikan bahwa tidak ada

campur tangan langsung karena interaksi dari RA obat, heterophilic

antibodi seperti RF, atau zat lain. Hanya tes dengan

Tabel 3. Karakteristik awal dari pasien digunakan untuk Pelatihan

dan studi komorbiditas.

Latihan

(pas akhir)

Komorbiditas

(INFORM 512)

Jumlah sampel (n = 249) (n = 512)

% Perempuan 75 76

% RF + 61a 77b
% Anti-PKC + 58c 65d

Usia rata-rata (IQR) 58 (49-67) 59 (50-68)

Median DAS28-CRP (IQR) 3,8 (1,6-6,4) 3,3 (2,3-4,7)

Median TJC (IQR) 5 (0-18) 2 (0-8)

Median SJC (IQR) 4 (0-17) 2 (0-6)

CRP median, mg / L (IQR) 3,8 (1.3 20.5) 4.3 (1,9-12)

Berarti PG (IQR) 3,9 (1-7) 3,5 (1-5,5)

Berarti MBDA (IQR) 42 (33-50) 40 (30-59)

RF dan status anti-PKC tidak tersedia untuk semua pasien, pasien yang dievaluasi

dicatat:

sebuah = 198;

bn = 505;

cn = 232;

dn = 511.

IQR, rentang antar-kuartil.

doi: 10.1371 / journal.pone.0060635.t003

Gambar 3. MBDA algoritma skor. The MBDA algoritma Rata menggunakan persamaan analog
dengan bahwa untuk DAS28-CRP, dengan biomarker digunakan untuk

memprediksi Hitungan bengkak Bersama (SJC28), tender Joint Hitungan (TJC28), dan Pasien
Global Assessment (PG) komponen dari persamaan. The Venn

diagram daftar nilai biomarker MBDA digunakan untuk memprediksi setiap skor MBDA
komponen. YKL-40, tulang rawan manusia glikoprotein-39; IL-6, interleukin-6;

SAA, serum amyloid A; EGF, faktor pertumbuhan epidermal; TNF-RI, tumor necrosis factor
receptor 1; VEGF-A, vaskular pertumbuhan endotel faktor-A; MMP,

matriks metaloproteinase.

doi: 10.1371 / journal.pone.0060635.g003

Tabel 4. Penyakit kategori aktivitas definisi untuk DAS28-CRP

dan MBDA.

Aktivitas penyakit

kategori

DAS28-CRP

definisi definisi MBDA

Remisi, 2.3 # 25

Rendah # 2.7 # 29

.2.7 Moderat & # 4,1 0,29 & # 44

Tinggi .4.1 0,44

doi: 10.1371 / journal.pone.0060635.t004

Multi-Biomarker Penyakit Uji Aktivitas untuk RA

PLOS ONE | www.plosone.org 9 April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e60635

kinerja yang dapat diterima dilakukan maju ke studi klinis

dan akhirnya, pengembangan algoritma.

Penanda yang dievaluasi berdasarkan hubungan aktivitas penyakit

dan kontribusi untuk model daripadanya di biomarker seri

studi prioritas. Selanjutnya, kedua univariat dan multivariat

analisis statistik dari aktivitas penyakit berbasis biomarker

prediksi digunakan untuk biomarker prioritas, sehingga tidak

biomarker rindu yang menambah nilai dalam model multivariat meskipun

hubungan individu lemah. Pemodelan statistik beberapa

metodologi juga diterapkan dalam rangka untuk mengidentifikasi orang-orang yang

dilakukan terbaik untuk masalah ini. Peringkat biomarker adalah

berdasarkan kedua analisis univariat dan multivariat dan kisaran

penyakit metrik kegiatan, dalam rangka untuk mengurangi disengaja

penghapusan biomarker potensial berguna. Penilaian dalam

beberapa, studi berurutan digunakan untuk mengurangi palsu keseluruhan

Tingkat penemuan dan untuk menguji kekokohan temuan di studi.

Meskipun hubungan antara biomarker dan berbagai penyakit

langkah-langkah kegiatan yang dinilai selama proses pembangunan,

yang DAS28-CRP terpilih sebagai referensi untuk algoritma akhir

pelatihan karena validasi didirikan terhadap DAS28- yang

ESR [6], ukuran aktivitas penyakit ditampilkan untuk memprediksi hasil RA

dalam uji klinis [49], dan karena pengukuran CRP lebih

mudah distandarisasi dari ESR dalam sampel membelok dari beberapa

studi dan situs. Kami menemukan bahwa model multi-biomarker berdasarkan

mengungguli biomarker individu pada prediksi DAS28-CRP.

Pilot pencitraan analisis menunjukkan bahwa nilai aktivitas penyakit dari

model multivariat dilatih untuk memprediksi DAS28-CRP juga

terkait dengan sinovitis dan vaskularisasi, dinilai oleh kekuatan

USG Doppler, dan dengan bersama radiografi ditentukan

Tabel 5. Rasio median langkah aktivitas penyakit *

antara pasien RA dengan dan tanpa umum

komorbiditas.

Komorbiditas n (%) CRP CDAI

DAS28-

CRP

MBDA

Skor

Hipertensi 223 (44) 0,98 1,32 1,14 {{1,05

Osteoarthritis {172 (34) 0,88 1,17 1,13 1,05

Tulang osteoporosis

fraktur

131 (26) 0,91 1,05 1,02 1,05

Sendi degeneratif

Penyakit {

113 (22) 1,20 1,18 1,11 1,07 {

Diabetes 73 (14) 1,01 1,09 1,04 1,07 {

Asma 50 (10) 1,28 1,11 1,05 1,05

* Nilai dekat dengan 1,0 menunjukkan bahwa pengukuran atau tes tidak terpengaruh oleh

komorbiditas.

{P Nominal, 0,05 disesuaikan dengan usia dan jenis kelamin; ketika disesuaikan dengan
beberapa

perbandingan, tidak signifikan secara statistik.

{Osteoarthritis dan penyakit sendi degeneratif yang terdaftar sebagai terpisah

kondisi pada formulir laporan kasus.

doi: 10.1371 / journal.pone.0060635.t005

Gambar 4. Jaringan peta MBDA peran biomarker dalam komunikasi selular di RA.

doi: 10.1371 / journal.pone.0060635.g004

Multi-Biomarker Penyakit Uji Aktivitas untuk RA

PLOS ONE | www.plosone.org 10 April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e60635

perkembangan kerusakan. Hasil ini menunjukkan bahwa multibiomarker sebuah

algoritma dilatih secara khusus terhadap DAS28-CRP

tetap dapat memberikan informasi lebih luas tentang penyakit

aktivitas dan, kritis, pada hasil penyakit. Klinis dinilai

langkah-langkah aktivitas penyakit menunjukkan signifikan antar-penilai dan

inter-subjek variabilitas [10,13], sedangkan koefisien median

variasi skor MBDA di ulangi berjalan dari sampel yang sama adalah

, 2% [44]. Langkah-langkah klinis, sementara jelas berharga, yang

standar tetap sempurna untuk perbandingan, dan independen

langkah-langkah seperti USG dan pencitraan radiografi yang

indikator penting dari aktivitas penyakit mendasar

proses.

Karena komorbiditas dibayangkan dapat mempengaruhi penilaian klinis

dan tingkat biomarker, kami menilai dampak dari beberapa

komorbiditas umum pada skor MBDA dan mengamati tidak ada

efek pembaur. Penelitian yang lebih besar diperlukan untuk mengkonfirmasi dan

selanjutnya menentukan pengamatan ini. Hal ini terutama penting untuk

memeriksa komorbiditas lain dengan komponen inflamasi yang

tidak dapat dianalisis dalam data kami, seperti infeksi dan

keganasan. Infeksi khususnya yang berhubungan dengan cepat

elevasi sitokin dan reaktan fase akut, sehingga skor MBDA

Hasil harus ditafsirkan dengan hati-hati pada pasien dengan aktif

infeksi. Selain itu, efek dari pemeriksaan jasa vaksinasi

karena dapat menyebabkan peradangan akut.

Meskipun mereka dipilih terutama melalui statistik-driven

proses, biomarker diprioritaskan mencerminkan jalur biologis kunci,

sel, dan fitur dari RA. Gambar 4 merangkum peran diketahui dari

12 biomarker termasuk dalam algoritma final seluler

interaksi dan proses penting untuk penyakit ini. Diagram

menggambarkan premis kritis mengemudi pembangunan multi-biomarker ini

Upaya: yang satu set biologis beragam kuantitatif

biomarker mungkin bisa memberikan informasi lebih lanjut tentang

biologi penyakit yang mendasari daripada biomarker tunggal.

Meskipun ruang lingkup dan kekakuan pekerjaan dijelaskan, beberapa

keterbatasan penting harus diperhatikan. Untuk pertimbangan praktis,

kami membatasi evaluasi kami untuk biomarker serum yang

terukur di RA serum pasien menggunakan tersedia secara komersial

tes. Akibatnya, sitokin dan mediator yang mungkin sangat

menyatakan dalam sendi arthritis, tetapi yang sulit

mendeteksi dalam serum baik karena tingkat rendah atau tes tidak memadai, yang

tidak dianggap. Selain itu, studi klinis yang membentuk

dasar untuk pekerjaan ini dikeluarkan beberapa pasien untuk kombinasi

alasan etis dan praktis (misalnya sekitar penggunaan steroid, kehamilan

dan kondisi medis yang serius). Akibatnya, perkembangan ini

Program tidak dapat dipertimbangkan untuk membentuk penerapan yang

temuan biomarker dan uji MBDA untuk ini jenis pasien,

dan studi lebih lanjut diperlukan. Akhirnya, tes MBDA adalah dengan

merancang penilaian secara eksklusif-biomarker berbasis. Sementara ini

memungkinkan untuk keuntungan tertentu, termasuk efisiensi dan objektivitas,

tidak termasuk pemeriksaan fisik dan tidak harus dilihat sebagai

pengganti dokter atau penilaian pasien, melainkan sebagai

tambahan, alat pelengkap untuk memberikan objektif, kuantitatif

Data untuk menginformasikan pengambilan keputusan klinis.

Algoritma MBDA dikembangkan seperti yang dijelaskan di sini memiliki

kemudian dievaluasi dan divalidasi dalam kohort independen

[21,22]. Studi tambahan yang dilakukan untuk mengevaluasi lebih lanjut

hubungan antara skor MBDA dan langkah-langkah lain

aktivitas penyakit, dan kemampuan skor untuk menunjukkan risiko

hasil pasien kritis seperti perkembangan kerusakan sendi.

Pada akhirnya, studi prospektif menggabungkan skor MBDA

akan diminta untuk sepenuhnya menjelaskan utilitas klinis dan yang

penggunaan yang tepat bersama pendekatan lain untuk penilaian pasien

dalam praktek rutin.

informasi pendukung

Tabel S1 biomarker Calon dan tes yang digunakan.

(XLS)

Tabel S2 Rincian Tes digunakan dalam studi kelayakan.

Semua ringkasan statistik disajikan sebagai nilai rata-rata di

piring studi. 'pengenceran sampel' adalah pengenceran serum ditambahkan ke

assay setelah optimasi apapun. 'Avg sampel CV' adalah berarti%

koefisien variasi, dihitung dengan menggunakan duplikat pengukuran

dari semua sampel pada setiap lempeng. Bawah Terukurnya Batas

(LML) adalah standar konsentrasi terendah yang semua

bereplikasi memiliki hasil yang lebih tinggi daripada semua ulangan dari kosong dan semua

standar konsentrasi yang lebih rendah. Standar berturut-turut atas

LML berhak mewakili Terukurnya Batas Tinggi

(HML) asalkan semua ulangan mereka memiliki hasil yang lebih tinggi daripada semua

ulangan untuk standar konsentrasi yang lebih rendah. The HML adalah

tertinggi dari standar yang layak yang semua ulangan memiliki

Hasil lebih rendah dari semua standar dari konsentrasi yang lebih tinggi.

(XLS)

Tabel S3 Rincian tes yang digunakan dalam Pembangunan

studi.

(XLS)

Tabel S4 Hasil untuk biomarker individu dalam Kelayakan

(Tahap 2) studi.

(XLS)

Penulis Kontribusi

Disusun dan dirancang percobaan: MC GC MT CS DS DC LH J.

Carulli PT NS MW J. Curtis. Melakukan percobaan: MC MT CS DS

PT J. Curtis MW KS. Menganalisis data: MC GC YS SR NK DH PT KS.

Menulis kertas: MC GC YS SR NK MT CS DS DH DC LH J. Carulli

PT NS MW J. Curtis KS.

Referensi.

1. Bakker MF, Jacobs JW, Verstappen SM, Bijlsma JW (2007) kontrol ketat di

pengobatan rheumatoid arthritis: khasiat dan kelayakan. Ann Rheum Dis 66

Suppl 3: iii56-60. Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.

FCGI? cmd = Ambil & db = PubMed & DoPT = Citation & list_uids = 17.934.098.

2. Verstappen SMM, Jacobs JWG, van der Veen MJ, Heurkens AH, Schenk Y, et

al. (2007) pengobatan intensif dengan methotrexate di rheumatoid arthritis awal:

bertujuan untuk remisi. Computer Assisted Manajemen di Awal Rheumatoid

Arthritis (CAMERA, strategi sidang label terbuka). Annals of rematik yang

Penyakit 66: 1443-1449. Tersedia: http: //www.pubmedcentral.nih.gov/

articlerender.fcgi? artid = 2111604 & alat = pmcentrez & rendertype = abstrak. Diakses
22 Juli 2011.

3. Mease PJ (2010) Meningkatkan manajemen rutin rheumatoid arthritis: yang

nilai kontrol ketat. Journal of Pra 37: 1570-1578.

Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20595287. Diakses 23 Juli

2012.

4. Smolen JS, Aletaha D, Bijlsma JWJ, Breedveld FC, Boumpas D, dkk. (2010) Mengobati

rheumatoid arthritis menargetkan: rekomendasi dari satuan tugas internasional. Sejarah

penyakit rematik 69: 631-637. Tersedia: http: //www.pubmedcentral.nih.

gov / articlerender.fcgi? artid = 3015099 & alat = pmcentrez & rendertype = abstrak. Diakses

24 Juni 2011.

5. Singh JA, Furst DE, Bharat A, Curtis JR, Kavanaugh AF, dkk. (2012) 2012

update dari 2008 American College of Rheumatology rekomendasi untuk

penggunaan obat antirematik penyakit-memodifikasi dan agen biologis dalam

pengobatan rheumatoid arthritis. Perawatan Arthritis & penelitian 64: 625-639.

Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22473917. Diakses 15 Juli

2012.

6. Wells G, Becker JC, Teng J, Dougados M, Schiff M, et al. (2009) Validasi

28-sendi Penyakit Kegiatan Score (DAS28) dan Eropa Liga Melawan

Kriteria respon rematik berdasarkan protein C-reaktif terhadap penyakit

perkembangan pada pasien dengan rheumatoid arthritis, dan perbandingan dengan

DAS28 berdasarkan tingkat sedimentasi eritrosit. Annals of rematik yang

Multi-Biomarker Penyakit Uji Aktivitas untuk RA

PLOS ONE | www.plosone.org 11 April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e60635

Penyakit 68: 954-960. Tersedia: http: //www.pubmedcentral.nih.gov/

articlerender.fcgi? artid = 2674547 & alat = pmcentrez & rendertype = abstrak. Diakses
18 Juli 2011.

7. Fransen J, van Riel PLCM (nd) Penyakit Kegiatan Skor dan EULAR

Kriteria respon. Klinis dan eksperimental Pra 23: S93-9. Tersedia:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16273792. Diakses 22 Oktober

2012.

8. Zatarain E, Strand V aktivitas penyakit (2006) Pemantauan rheumatoid arthritis

dalam praktek klinis: kontribusi dari uji klinis. Nature praktek klinis

Rheumatology 2: 611-618. Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

17075600. Diakses 25 Januari 2012.

9. Pincus T, Swearingen CJ, Bergman M, Yazici Y (2008) RAPID3 (Rutin

Penilaian Pasien Indeks data 3), indeks rheumatoid arthritis tanpa resmi

jumlah bersama untuk perawatan rutin: diusulkan kategori keparahan dibandingkan dengan
penyakit

skor aktivitas dan klinis kategori indeks aktivitas penyakit. The Journal of

Pra 35: 2136-2147. Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/

PubMed / 18793006. Diakses November 2012 7.

10. Uhlig T, Kvien TK, Pincus T (2009) reliabilitas Uji-tes ulang dari inti aktivitas penyakit

Tindakan set dan indeks di rheumatoid arthritis. Annals of rematik yang

Penyakit 68: 972-975. Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

18957489. Diakses 22 Juli 2011.

11. Ranzolin A, Brenol JCT, Bredemeier M, Guarienti J, Rizzatti M, et al. (2009)

Asosiasi fibromyalgia bersamaan dengan aktivitas penyakit parah mencetak gol dalam 28

sendi, kuesioner penilaian kesehatan, dan bentuk pendek 36 skor pada pasien dengan

radang sendi. Arthritis dan rematik 61: 794-800. Tersedia: http: //

www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19479706. Diakses 23 Agustus 2011.

12. Leeb BF, Andel saya, Sautner J, Nothnagl T, Rintelen B (2004) The DAS28 di

arthritis arthritis dan fibromyalgia pasien. Rheumatology (Oxford,

Inggris) 43: 1504-1507. Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

15252215. Diakses 25 Januari 2012.

13. Marhadour T, Jousse-Joulin S, Chale`s G, Grange L, Hacquard C, et al. (2010)

Reproduksibilitas penilaian pembengkakan sendi pada rheumatoid arthritis tahan lama:

pengaruh pada Disease Activity Score-28 nilai (SEA-Repro studi bagian I). The

Jurnal Pra 37: 932-937. Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/

PubMed / 20360184. Diakses 25 Januari 2012.

14. Sokka T, T Pincus (2009) Laju endap, protein C-reaktif, atau

Faktor reumatoid adalah normal pada presentasi di 35% -45% dari pasien dengan

rheumatoid arthritis dilihat antara tahun 1980 dan 2004: analisis dari Finlandia dan

Amerika Serikat. J Rheumatol 36: 1387-1390. Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.

gov / entrez / query.fcgi? cmd = Ambil & db = PubMed & DoPT = Citation & list_

UID = 19.411.389.

15. Rhodes B, Merriman ME, Harrison A, Nissen MJ, Smith M, et al. (2010) A

studi hubungan genetik dari tingkat protein serum akut-fase C-reaktif dalam

rheumatoid arthritis: implikasi untuk interpretasi klinis. PLoS Med 7:

e1000341. Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.

FCGI? cmd = Ambil & db = PubMed & DoPT = Citation & list_uids = 20.877.716.

16. Keenan RT, Swearingen CJ, Yazici Y laju sedimentasi (2008) eritrosit dan

Tingkat protein C-reaktif yang buruk berkorelasi dengan langkah-langkah klinis penyakit

aktivitas di rheumatoid arthritis, lupus eritematosus sistemik dan osteoarthritis

pasien. Clin Exp Rheumatol 26: 814-819. Tersedia: http: //www.ncbi.nlm.nih.

gov / entrez / query.fcgi? cmd = Ambil & db = PubMed & DoPT = Citation & list_
UID = 19.032.813.

17. Mease PJ (1998) Peran potensi biomarker novel dalam rheumatoid arthritis

penilaian. Klinis dan eksperimental Pra 29: 567-574. Tersedia:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21640052. Diakses 18 Juli 2012.

18. Chambers RE, MacFarlane DG, Whicher JT, Dieppe P a (1983) Serum

amyloid-A konsentrasi protein dalam rheumatoid arthritis dan perannya dalam

pemantauan aktivitas penyakit. Annals dari penyakit rematik 42: 665-667.

A vailable: http: //www.pubmedc entral .nih. g ov / art i c le r ender.

FCGI? artid = 1001325 & alat = pmcentrez & rendertype = abstrak. Diakses 18 Juli

2012.