Hepatotoksisitas tes

1.8.1 Kegiatan Antihepatotoxic Menggunakan karbon tetraklorida-Induced

Sitotoksisitas

Sejumlah ekstrak tanaman dan bahan alami lainnya memiliki aktivitas hepatoprotektif.
Beberapa simplisia yang digunakan dalam sistem adat kedokteran juga diyakini efektif terhadap
hepatitis

Berbagai tes telah dirancang untuk menguji obat mentah dan murni alami produk untuk
aktivitas hepatoprotektif. Karbon tetraklorida (CCl4) adalah sangat hepatotoksik agen dan oleh
karena itu digunakan untuk menginduksi sitotoksisitas di SD berbudaya hepatosit untuk memonitor
efek pelindung hati dari berbagai alam zat (Kiso et al., 1983).

Bahan

1. Tikus (20-25 g, ddY)

2. Tikus Wistar (200-250 g)

3. Bovine albumin serum Fr. V

4. Calf serum

5. Karbon tetraklorida (CCl4)

6. Kolagenase tipe I (125-250 IU / mg,)

7. Deksametason (Sigma)

8. Elang media minimum esensial (Elang MEM, Nissui)

9. Ethylene glycol-bis-(β-amino ethylether) N, N'-tetraacetic acid (EGTA), (Dotite)

10. Fase kontras microphage

11. Insulin (Novo Penelitian)

12. Kalium penisilin G

13. Streptomisin sulfat

14. Etanol

15. DMSO

16. Plastik piring (Falcon)

17. Dilembabkan inkubator

18. Trypanblue

19. Hank penyangga (Ca + gratis)

20. Autoanalyser

21. Teflon kateter

22. Gunting tang

23. Alat pemutar

24. Eter

25. Uji sampel (ekstrak kasar, produk alami murni atau senyawa sintetis)

Langkah-langkah berikut terlibat dalam kegiatan tes antihepatotoxic:

Metode Isolasi dan Membudidayakan dari hepatosit

1. Perut mouse atau tikus dibuka di bawah anestesi ether. Insisi midline

dibuat dan vena portal cannulated dengan jarum dilengkapi dengan kateter teflon.

2. Kateter teflon terikat di tempat dan jarum akan dihapus. Inferior vena cava adalah

dipotong di bawah vena ginjal.

3. Hati ini perfusi menggunakan buffer Ca2 + bebas Hank mengandung serum bovine 1%

albumin Fr. V dan 0,5 EGTA mM. Aerasi dilakukan dengan O2 95% / 5% CO2 pada

tingkat aliran 30 ml / menit. pH 7,4 pada 37 ° C.

4. Bagian thorix dari vena kava superior cannulated, dan inferior vena cava

yang diikat di atas vena ginjal.

5. Setelah perfusi dari hati selama 10 menit, buffer Ca2 + bebas Hank (100 ml).

(Mengandung tambahan kolagenase 0,075% dan 4 mM CaCl2) diresirkulasi.

6. Setelah 10-15 menit. perfusi, hati dipindahkan ke gelas yang mengandung Ca2 + bebas

Penyangga Hank (50 ml) dan dengan lembut tersebar dengan dua forsep.

7. Suspensi sel mentah kemudian diputar di rotator di bawah oksigen-karbon dioksida

pada 37 ° C selama 10 menit.

8. Suspensi sel kemudian didinginkan dalam es dan disaring lembut melalui kasa kapas menjadi

centrifuge tabung.
9. Persiapan ini disentrifugasi pada 50 g selama 1 menit. Supernatan dihapus dan

pelet longgar dikemas sel yang lembut resuspended dalam buffer + Ca2 bebas Hank.

10. Prosedur pencucian diulang 3 sampai 5 kali.

11. Kelangsungan hidup sel untuk mengecualikan biru tripan ditentukan dengan menginkubasi sel

suspensi (0,1 ml) dengan 0,4% biru tripan (0,9 ml) dan kemudian menghitung sel-sel yang

inti yang bernoda serta mereka yang dikecualikan pewarna.

12. 1-30 mM CCl4/ethanol (konsentrasi 1%) dilarutkan dalam medium kultur # (1.0

ml) mengandung DMSO (0,01 ml).

13. Sel-sel yang preincubeted (1,5 atau 24 jam.) Dan kemudian terkena media atas

mengandung CC14 dan sampel uji.

14. The glutamat-piruvat transaminase (GPT) aktivitas di media diukur setelah

setiap 15 menit selama 90 menit. periode menggunakan metode Karmen, AF et al (1955),

mempekerjakan autoanalyser, dan sel-sel hati diperiksa menggunakan fase kontras

mikroskop.

15. Nilai-nilai GPT (IU / 1 × 10-2) diplot terhadap dosis yang diberikan dan melawan

waktu untuk menentukan ketergantungan dosis dan waktu CCl4-induced sitotoksisitas di

utama budaya hepatosit.

# Media kultur terdiri dari suplemen MEM Eagle dengan sirup betis 10% (yang memiliki telah
dilemahkan oleh pemanasan sampai 56 ° C selama 30 menit),. penisilin (100 IU / ml), streptomisin
(100 pg / ml), 10-6 M dextramethasone dan 10-8 M insulin. Inokulum dari 5 × 104 sel 0,1 ml/cm2
disegel ke piring plastik (Plastik Falcon) dan dipreinkubasi dalam inkubator dilembabkan pada 36 °
C di bawah 5% CO2 di udara selama 1,5 atau 24 jam. (Ketika dipreinkubasi untuk 24 jam., Medium
diganti setelah 6 jam.) (1.0 ml).

1.8.2 Dalam Assay hepatoprotektif Vivo

Uji berikut dapat digunakan untuk mengevaluasi efektivitas dari produk alam atau mentah
ekstrak dalam mencegah kerusakan yang disebabkan oleh CCl4 dengan bantuan morfologi, biokimia
dan fungsional parameter (Rana et al, 1992).

bahan

1. Albino tikus dari kedua jenis kelamin (60-80 g)

2. parafin cair
3. Karboksimetilselulosa (CMC)

4. Alat suntik dengan jarum

5. air suling

6. Karbon tetraklorida (CCl4)

7. pentobarbiton natrium

8. beratnya keseimbangan

9. heparin natrium

10. Uji sampel (tanaman ekstrak, produk alami murni atau senyawa sintetis)

Langkah-langkah yang terlibat dalam uji aktivitas hepatoprotektif adalah sebagai berikut:

1. Tikus-tikus dibagi menjadi tiga kelompok, masing-masing kelompok memiliki enam hewan:

2. Kerusakan hati atau keracunan dalam kelompok B diproduksi dengan menyuntikkan CCl4 (1 ml /
kg dengan sama volume parafin cair) dua kali seminggu selama delapan minggu. Grup B
menerima kendaraan (suspensi CMC) dan sub-kutan injeksi CCl4.

Grup A = Animais normal

Grup B = CCl4 hewan kontrol mabuk

Grup C = Tanaman ekstrak (sampel uji) diperlakukan hewan

3. Sebuah suspensi 5% dari sampel uji disiapkan dengan CMC 1% dalam air suling.

4. Hewan-hewan dari kelompok "C" diperlakukan dua kali seminggu dengan suspensi sampel uji
(300

mg / kg) selama delapan minggu. Hewan-hewan juga sekaligus menerima CCl4

dua kali seminggu selama delapan minggu suspensi.

5. Semua hewan yang disuntik dengan 100 unit natrium heparin. Setelah 30 menit

hewan dibius dengan eter. 4 porsi ml darah dikumpulkan dengan

jarum suntik dalam tabung pencucian oleh tusukan hati langsung. Sampel yang segera

digunakan untuk estimasi biokimia.

6. Hati dari masing-masing kelompok hewan dikeluarkan dan diamati dengan hati-hati untuk setiap

perubahan mis penampilan nekrosis dan berat. Volume mereka diukur oleh Metode perpindahan
air.

7. CCl4 kerusakan dan kemanjuran sampel uji dievaluasi dengan bantuan berikut tiga parameter:
Parameter morfologi: Bobot hewan, dan berat dan volume dari hati hewan diskarifikasi setelah
delapan minggu dicatat. Jika sampel uji hepatoprotektif, hati dari hewan group C akan tidak
memiliki tanda-tanda toksisitas seperti nekrosis. Demikian pula perubahan persen dalam kelompok
A dan C dari bobot hewan, serta mereka hati bobot dan volume hati harus signifikan.

Parameter Fungsional: pentobarbiton tidur waktu ujian dilakukan. Tes ini digunakan untuk menilai
efektivitas dari sel hati fungsional. Pentobarbiton natrium (50 mg / kg) diberikan kepada hewan dari
setiap kelompok interperitoneally. Waktu tidur (interval waktu antara kerugian dan keuntungan dari
refleks menggeliat) ditentukan. Jika sampel uji hepatoprotektif waktu tidur (min.) hewan dari
kelompok A dan C harus sama, sedangkan untuk CCl4 tersebut. Grup B mabuk itu akan secara
signifikan lagi. Peningkatan waktu tidur adalah tanda kerusakan hati.

Biokimia Parameter: Tingkat enzim serum transferase alanin (SGPT) dan fosfatase alkali (AP) harus
diukur #. Peningkatan kadar SGPT dan AP di kelompok kontrol CCl4 menunjukkan tingkat
kerusakan hati. Jika sampel uji hepatoprotektif yang SGPT dan tingkat aktivitas AP (setelah delapan
minggu) dalam kelompok A dan C akan hampir sama, sedangkan SGPT dan tingkat AP pada
kelompok kontrol CCl4 B adalah dibangkitkan secara signifikan.

1.8.3 Antihepatotoxic Kegiatan Menggunakan galactosamine Induced Sitotoksisitas

Hal ini dalam metode uji in vitro yang digunakan untuk skrining utama dari kegiatan antihepatotoxic
dari ekstrak menggunakan D-galactosamine-diproduksi cedera di SD-berbudaya mouse dan hati
tikus sel. Ini model sistem bioassay kini diakui menyerupai efek viral hepatitis pada manusia baik
dari titik morfologi dan fungsional pandang. Sekarang Oleh karena itu dianggap sebagai layar
bioassay sangat berguna untuk menilai pencegahan hati kerusakan dan sebanding dengan dalam
metode uji in vivo.

Bahan

1. Pria Std: dd Y tikus (20-25 g) / Std Pria: Wistar tikus (200-250 g)

2. Bovine albumin serum Fr. V 1%

3. Calf serum 10% (Lab Arus.)

4. Kolagenase tipe I (125-250 IU / mg) 0,075%

5. Deksametason 10-6M

6. Ethylene glycol-bis-(-amino ethylether) N, N'-tetraacetic acid (EGTA) 0,5 mM

7. Insulin 10-8M (Novo Penelitian)

8. Kalium penisilin G (100 IU / ml)

9. Streptomisin sulfat (100 mg / ml)

10. D-galactosamine 0,1-0,5 mM (GAIN)

11. CaCl2 4mm

# Periksa literatur untuk metode tertentu.

12. Biru tripan 0,4%

13. Penyangga Ca2 + bebas Hank Berisi Fr.V 1% albumin bovine serum dan 0,5 mM EGTA dan
diangin-anginkan dengan 95% O2 / 5% CO2 ke pH 4,7 pada 37 °.

14.Eagle 's media pokok minimum (Eagle MEM) (Nissui) MEM Elang adalah ditambah dengan
10% serum anak sapi tidak aktif (56 ° selama 30 menit), penisilin (100 IU / ml), streptomisin
(100 mg / ml), 10-6 M deksametason, dan 10-8 M insulin.

15. Hati produk alami pelindung (LPNP) seperti:

a. cynarin

b. glycyrrhetinic asam

c. glycyrrhizin

d. metionin

e. Picroside I

f. Picroside II

g. silybin

h. Desoxypodophyllotoxin (terisolasi dari hexandrum Podopyllum, E.Merck)

16. peralatan

a. Jarum dilengkapi dengan kateter teflon

b. Gunting, tang

c. gelas

d. alat pemutar

e. kapas kasa

f. centrifuge tabung

g. Centrifuge (upto 30 g nilai)

h. Dilembabkan CO2 inkubator

i. plastik piring

j. Auto analyzer (Raba super)

17. Uji sampel (ekstrak kasar, produk alami murni atau senyawa sintetik).

Uji ini dilakukan dalam tiga langkah berikut (A-H):

A. Isolasi hepatosit
Sel-sel hati yang terisolasi oleh prosedur yang dimodifikasi dari Seglen (1976).

1. Perut mouse atau tikus yang dibuka di bawah anestesi eter.

2. Sebuah insisi garis tengah dibuat, dan vena portal cannulated dengan jarum dilengkapi dengan
teflon kateter.

3. Setelah kateter teflon terikat di tempat dan jarum dihapus, inferior vena cava dipotong di bawah
vena ginjal.

4. Perfusi hati dimulai dengan Ca2 + - bebas buffer Hank (Hanks et al, 1949.). itu laju alir 30 ml /
menit.

5. Bagian thoraks vena kava superior cannulated, dan interior vena cava terikat di atas vena ginjal.

6. Setelah hati telah perfusi selama 10 menit, resirkulasi buffer Ca2 + bebas Hank

(100 ml), yang juga mengandung kolagenase 0,075% dan 4 mM CaCl2, dimulai.

Harap dicatat: Dalam kasus tikus, buffer yang sama dituangkan ke dalam vena cava inferior dan
dikeringkan dari vena hepatik portal di laju alir 10 ml / menit.

7. Setelah 10-15 menit perfusi, hati ditransfer ke dalam gelas yang mengandung Ca2 + - bebas buffer
Hank (50 ml) dan dengan lembut tersebar dengan dua forsep.

8. Selanjutnya, suspensi sel hati mentah diputar pada rotator di bawah oksigen-karbon dioksida pada
37 ° C selama 10 menit.

9. Suspensi sel kemudian didinginkan pada es dan lembut disaring melalui kasa kapas menjadi
centrifuge tabung.

10. Persiapan ini disentrifugasi pada 50 g selama 1 menit. (Untuk tikus, 30 g, 1 menit).

11. Supernatan yang disedot off dan pelet longgar dikemas sel yang lembut resuspended dalam Ca2
+ - bebas buffer Hank.

12. Prosedur cuci diulang tiga sampai lima kali.

B. Penentuan Viabilitas Sel Terisolasi

Viabilitas sel ditentukan dengan menginkubasi suspensi sel (0,1 ml) dengan tripan 0,4% biru
(0,9 ml) dan kemudian menghitung jumlah sel-sel yang dikecualikan pewarna dan nomor sel
yang inti berwarna biru.

C. Pembuatan Kebudayaan hepatosit

Media kultur terdiri dari MEM Eagle. Inokulum dari 5 × 104 cells/0.1 ml/cm2 adalah
unggulan ke piring plastik dan dipreinkubasi dalam inkubator dilembabkan pada 36,5 ° di bawah
5% CO2 di udara selama 1,5 atau 24 jam. Ketika dipreinkubasi selama 24 jam, medium diganti
setelah 6 jam.

D. Penentuan Viabilitas Sel budidaya

 Viabilitas sel kultur yang diuji dengan pengecualian tripan biru. Setelah penambahan
langsung 0,4% biru tripan, jumlah sel, bernoda dan tak bercacat dihitung.

E. Penentuan Sitotoksisitas Diinduksi oleh galactosamine (GALN)

1.Preparation Media GalN Mengandung Dalam media (1,0 ml), larutan 0,1-0,5 GalN mM dilarutkan
dalam DMSO (0,01 ml) ditambahkan.

2. Setelah preincubation (1,5 atau 24 jam), sel-sel yang terkena disebutkan di atas medium yang
mengandung GalN.

3. Pada waktu yang ditunjukkan setelah tantangan GalN, glutamat-piruvat transaminase (GPT)
aktivitas di media diukur dengan metode (Karmen et al., 1955) menggunakan autoanalyzer (Raba
Super, Chugai Pharmaceutical).

F. Penentuan dari Sitotoksisitas yang Diinduksi oleh Natural Hati Perlindungan Produk (LPNP)

Sebagai referensi, percobaan serupa dilakukan untuk menentukan antihepatotoxic tindakan

dari produk alami yang dikenal untuk mengerahkan hati-pelindung efek in vivo, memanfaatkan
GalN-mabuk hepatosit in vitro

G. Penentuan dari Sitotoksisitas yang Diinduksi oleh Sample Uji

Sebuah percobaan yang sama dilakukan, kecuali bahwa sampel uji digunakan di tempat
GalN untukmemeriksa tindakan hepatotoksik pada hepatosit dan aktivitas GPT diukur.

H. Penentuan Hepatoprotectivity Diinduksi oleh Contoh Uji

Setelah preincubation hepatosit tikus terisolasi selama 1,5 jam, sampel uji ditambahkan
pada dosis dari 0,01, 0,1 dan 1,0 mg, dengan atau tanpa 0,5 mM GalN, pada media kultur (1,0
ml). GPT aktivitas diukur pada 30 jam setelah perawatan. Jika sampel uji hepatoprotektif tingkat
aktivitas GPT dengan atau tanpa GalN akan hampir sama. *

* Untuk rincian lebih lanjut dari semua tes yang disebutkan di atas melihat Kiso et al, 1983; Seglen,
1976; Hanks et al, 1949. dan Karmen et al, 1955..