ABSTRAK

Percobaan aktivitas spesifik enzim α-amilase bertujuan untuk

menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal.
Prinsip percobaan ini adalah Penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase melalui
pengukuran konsentrasi menggunakan spektrofotometer. Metode pada percobaan
ini yaitu Sentrifugasi (yaitu teknik pemisahan yang dilakukan berdasarkan partikel
dalam medan gaya sentrifugal), dan metode spektrofotometer (suatu metode
analisis yang digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel secara kuantitatif,
berdasarkan interaksi materi dengan cahaya). Penentuan aktivitas spesifik enzim
α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal akan didapatkan hubungan aktivitas
spesifik enzim α-amilase dengan konsentrasi, dimana konsentrasi larutan ubi ungu
yang semakin besar akan menurunkan aktivitas spesifik enzim α-amilase. Nilai
aktivitas spesifik enzim α-amilase pada enzim fraksi I adalah 0,000000216
unit/mg, fraksi II adalah 0,00000131 unit/mg. Sedangkan nilai aktivitas spesifik
enzim α-amilase pada enzim kasar adalah 0,000001 unit/mg.

Kata kunci : aktivitas spesifik, enzim α-amilase , konsentrasi, fraksi I, fraksi II

ekstrak kasar.
DATA PENGAMATAN
No Perlakuan Hasil
1 Penentuan aktivitas enzim α-amilase
1 ml larutan amilum 1% + 0,1 ml enzim + 3,9 ml Larutan bening
buffer fosfat, inkubasi
2 Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode
Nelson-Soumogyi
-0,1 ml larutan inkubasi + 1,5 ml akuades + 0,2 ml
Ba(OH)2 0,01 M + ZnSO4 0,2 ml 0,01 M,
penggojogan sentrifugasi 10 menit
a. ekstrak kasar Endapan putih
b. fraksi I Endapan putih
c. fraksi II Endapan putih
-1 ml larutan supernatan + 1 ml reagen Nelson-
soumogyi, dipanaskan dalam larutan mendidih
selama 15 menit, didinginkan
a. ekstrak kasar Biru
b. fraksi I Biru makin pekat
c. fraksi II Biru
-Penambahan 1 ml larutan molibdat, pengenceran
a. ekstrak kasar Kuning kehijauan
b. fraksi I Kuning kehijauan
c. fraksi II Kuning kehijauan
-Penentuan konsensentrasi dengan spektra UV
a. λ max 660 nm
b. ekstrak kasar 0,049 A
c. fraksi I 0,061 A
d. fraksi II 0,018 A
3. Penentuan kadar Protein metode Lowry
-Penambahan larutan sampel dengan 1 ml reagen C,
kocok
a. ekstrak kasar -Biru kehijauan
b. fraksi I -Kuning kecoklatan
c. fraksi II -Kuning kecoklatan
 lebih bening dari
fraksi I
-Penambahan 0,1 ml reagen D, kocok
a. ekstrak kasar -Biru tua
b. fraksi I -biru tua makin gelap
c. fraksi II -biru tua
-Pengukuran absorbansi
a. λ max 630 nm
b. ekstrak kasar 0,5 A, 0,4 A, 0,4 A
c. fraksi I 0,6 A, 0,6 A, 0,5 A
d. fraksi II 0,55 A, 0,5 A, 0,5 A
VI. PEMBAHASAN
Percobaan aktivitas spesifik enzim α-amilase bertujuan untuk
menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian
awal. Sampel yang digunakan adalah ubi ungu yang merupakan sumber
karbohidrat. Enzim α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan
amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari
bagian dalam molekul, baik pada amilase maupun amilopektin. Prinsip
percobaan ini adalah Penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase secara
kromatografi. Metode pada percobaan ini yaitu Sentrifugasi (yaitu teknik
pemisahan yang dilakukan berdasarkan partikel dalam medan gaya
sentrifugal), dan metode spektrofotometer (suatu metode analisis yang
digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel secara kuantitatif, berdasarkan
interaksi materi dengan cahaya).

6.1. Penentuan Aktivitas enzim α-amilase

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim
α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal menggunakan metode
inkubasi.penentuan aktivitas enzim a-amilase dilakukan dengan
menambahkan larutan enzim (ekstrak kasar, fraksi I, dan fraksi II) pada
amilum. Digunakan amilum karena berfunsi sebagai substrat yang
mengandung amilosa dan amilopektin, yang akan dihidrolisis oleh enzim
α-amylase. Kemudian dilakukan penambahan buffer PO4 yang berfunsi
untuk mempertahankan kondisi presipitat enzim pada pH tertentu agar
selama penyimpanan tidak mudah terdenaturasi karena adanya perubahan
pH, dimana selama proses penyimpanan, pH cenderung tidak stabil dan
dapat terjadi perubahan suhu. Selain itu umumnya aktivitas enzim terjadi
hanya pada kisaran pH yang sempit, oleh sebab itu media enzim harus
benar- benar dipelihara dengan menggunakan buffer ( larutan penyangga )
( Tranggono & Sutardi, 1990 ). Di mana aktivitas α-amilase berada pada
range pH 5,4 − 6,4, maka digunakan buffer PO4 dengan pH 6,1 (buffer
asam), di mana pH ini merupakan pH optimum aktivitas α-amilase. Jika
pH-nya di atas pH optimum maka enzim akan mengalami deprotonasi
 atau perubahan pH baik di atas maupun di bawah pH optimum akan
menyebabkan enzim terdenaturasi, sehingga aktivitas enzim menurun.
Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 370C yang merupakan
suhu optimum untuk aktivitas enzim α-amilase. Hal ini sebanding dengan
energi aktivasi (Ea) untuk setiap enzim membentuk kompleks enzim-
substrat dan kemudian membentuk produk dan enzim kembali. Jika
inkubasi dilakukan pada suhu yang terlalu rendah, enzim menjadi tidak
aktif, karena tidak terjadi benturan antara molekul enzim dengan substrat.
Sedangkan bila suhu terlalu tinggi, dimana benturan yang terjadi semakin
banyak maka struktur tiga dimensi dari enzim tersebut akan terganggu
sehingga enzim akan mengalami denaturasi, atau dapat dikatakan enzim
akan kehilangan sifat alamiahnya (Sadikin, 2002)

6.2. Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Soumogyi

Percobaan ini betujuan untuk penentuan kadar gula pereduksi
dengan menggunakan metode Nelson-Soumogyi. Penentuan kadar gula
pereduksi merupakan wujud dari uji aktifitas enzim α-amilase. Aktivitas
enzim merupakan unit aktivitas enzim permiligram protein, sedangkan
satu unit aktivitas enzim α-amilase merupakan aktivitas enzim yang
menyebabkan terbentuknya 1µmol produk glukosa dari substrat amilum
persatuan waktu inkubasi pada kondisi temperatur dan PH tertentu. Uji
aktivitas spesifik enzim α-amilase diawali dengan reaksi enzimatis, yaitu
dengan menambahkan larutan amilum 1% dan buffer fosfat ke dalam
enzim kasar dan enzim halus.

E + S ES E + P
Enzim αsubstrat enzim-substrat enzim produk
Pada reaksi enzimatis diperlukan proses inkubasi, dimana pada
proses inkubasi ini terjadi kontak antara enzim α-amilase dengan substrat
dalam membentuk produk yaitu glukosa. Reaksi :
CH 2OH CH2 OH
O

OH
alf a - amilase
O OH O O + Buf f er Fosf at
OH OH
 CH2 OH CH2 OH CH 2OH
O O
OH OH
OH O OH OH
HO HO
OH OH OH

Maltosa Glukosa
Kadar gula pereduksi dapat ditentukan dengan metode Nelson-
Soumogyi. Penambahan larutan Ba(OH)2 bertujuan untuk meminimalisasi
masuknnya oksigen dari luar ke dalam larutan yang dapat mengoksidasi
kupri oksida (Cu2O) dan penambahan ZnSO4 bertujuan untuk
mengendapkan protein. Supernatan yang terbentuk ditambahkan reagen
Nelson-Soumogyi dan dipanaskan (dengan tujuan untuk mempercepat
reaksi). Penambahan reagen Nelson-Soumogyi menyebabkan terbentuknya
kupri oksida. Reagen Cu-tartrat akan direduksi oleh glukosa, hal ini karena
glukosa mempunyai gugus gula pereduksi, yaitu gugus aldehid.
Reaksi reduksi Cu2+ :
Cu2+ + e Cu2+
Ion Cu+ akan mengendap sebagai Cu2O dalam suasana basa :
2 Cu + + 2 OH- Cu2O + H2O
Reaksi terbentuknya kupri oksida :
CHO CHO
H C OH H C OH
OH C H
Cu2+ OH C H
+ Cu2O
H C OH Alkali
H C OH
H C OH H C OH
CH 2OH CH 2OH

Glukosa asam D-glukonat

Metode Nelson-Soumogyi menganalisa secara kuantitatif. Produk
reaksi enzimatis berupa glukosa, akan tetapi metode ini memiliki
kekurangan karena gula non pereduksi (sukrosa) tidak dapat terdeteksi dan
hanya bisa mendeteksi gula pereduksi (glukosa-fruktosa) padahal produk
dari pemecahan amilum oleh enzim α-amilase bukan glukosa melainkan
maltosa, sukrosa dan gula non pereduksi yang lain.
Gula dapat direduksi dengan sinar UV karena memiliki elektron-
elektron yang dapat tereksitasi dari keadaan dasar ketingkat energi yang
 lebih tinggi. Biasanya transisi elektron disebabkan oleh elektron π dimana
dalam molekul glukosa mengandung gugus karbonil yang dibentuk oleh
elektron π.
Penentuan kadar glukosa dilakukan dengan mengukur absorbansi
larutan tersebut dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ
660 nm. Panjang gelombang 660 nm ini merupakan panjang gelombang
maksimum, dimana terjadi serapan maksimum oleh larutan glukosa. Kadar
gula pereduksi ditentukan dengan membandingkan absorbansi larutan
sampel terhadap kurva larutan standar glukosa.
Absorbansi enzim murni pada fraksi I adalah 0,061, fraksi II adalah
0,018. Absorbansi pada ekstrak kasar 0,049. Sehingga kadar gula
pereduksi pada enzim fraksi I adalah 0,01089 mg/ml, fraksi II adalah
0,001911316 mg/ml dan enzim kasar adalah 0,00847 mg/ml.
Kadar enzim murni pada fraksi I lebih besar karena pada enzim kasar
terdapat enzim-enzim lain yang mungkin menimbulkan interferensi dan
pengukuran absorbansi.

6.3. Penentuan kadar Protein dengan Metode Lowry

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein dari larutan
ubi ungu. Metode yang digunakan adalah metode lowry. Penentuan kadar
protein dengan metode lowry didasarkan pada warna kompleks yang yang
dibentuk yang intensitas warnanya bervariasi berasrkan jenis protein atau
jumlah asam amino aromatik pada protein.
Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi
lain (Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan
tryptophan dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang
disebabkan oleh reaksi tembaga alkali dengan protein. Warna ini bisa
dibaca di antara panjang gelombang 500 – 750 nm, tergantung sensitivitas
yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat
digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan
sebuah puncak besar disekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk
menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah. Metode ini sangat
sensitif pada kadar protein yang kecil, limit deteksinya kurang lebih 2 ppm
(Soeharsono, 2006).
Reagen yang digunakan reagen Folin Ciocalteu yang merupakan
campuran natrium tungstat dan natrium molibdat dalam asam. Pada
metode lowry ini, Cu2+ pada suasana basa akan tereduksi menjadi Cu+.
Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks
phosphomolibdat – phosphotungstat, menghasilkan heteropoly-
molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping
asam amino) terkatalis Cu, yang menghasilkan warna biru.Warna biru
yang di hasilkan bergantung pada kandungan residu tryptophan dan
tyrosine-nya. Sehingga pengukuran kadar sampel dapat dilakukan dengan
pengukuran absorbansi sampel pada panjang gelombang.
Struktur kompleks biru :
HN NH
R CH C O
Cu2+
O C HC R
HN NH

(Lehninger, 1998)
Penentuan kuantitatif kadar protein secara lowry didasarkan pada
absorbansi sinar oleh kompleks biru. Absorbansi diukur dengan
menggunakan spektrofotometri UV-VIS. Absorbansi sampel yang
diperoleh yaitu pada fraksi I adalah 0,584, fraksi II adalah 0,552. untuk
enzim kasar absorbansinya adalah 0, 558. Kadar protein enzim murni pada
fraksi I adalah 8838,333 mg/ml, fraksi II adalah 8305 mg/ml. Pada ekstrak
enzim kasar kadar protein nya sebesar 8405 mg/ml.
Nilai aktivitas spesifik enzim α-amilase ekstrak kasar adalah
0,000001 unit/mg. Nilai aktivitas spesifik enzim α-amilase pada enzim
murni fraksi I adalah 0,000000216 unit/mg sedangkan pada fraksi II
adalah 0,00000131 unit/mg
VII. PENUTUP
7.1 Kesimpulan
7.1.1 Penentuan aktivitas enzim α-amilase dapat di lakukan dengan metode
spektro fotometri menggunakan metode Nelson-soumogyi dan Lowry.
7.1.2 Kadar gula pereduksi pada enzim fraksi I adalah 0,01089 mg/ml , fraksi II
adalah 0,001911316 mg/ml dan enzim kasar adalah 0,00847 mg/ml.
7.1.3 Kadar protein enzim murni pada fraksi I adalah 8838,333 mg/ml, fraksi II
adalah 8305 mg/ml dan enzim kasar adalah 8405 mg/ml.
7.1.4 Nilai aktivitas spesifik enzim α-amilase ekstrak kasar adalah ,000001
unit/mg. Pada enzim fraksi I adalah ,000000216 unit/mg dan fraksi II
adalah 0,00000131 unit/mg.
7.1.5 Semakin besar konsen.trasi enzim α-amilase maka akan menurunkan
aktivitas spesifik enzim α-amilase

7.2 Saran
7.2.1 Sebaiknya praktikan lebih hati hati dalam melakukan pemasan terhadap
sampel.
7.2.1 sebaiknya praktikan menggunakan penjepit ketika memanaskan sampel.
 LEMBAR PENGESAHAN

Semarang, 15 September 2017

Mengetahui,
Asisten Praktikan

Fitradhela Rachma Nadhia Ratna Kurniawati

24030114120015 24030115120036
 DAFTAR PUSTAKA

Azmi, 2006, Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi Aspergillus Oryzae

Untuk Isolasi Enzim Amilase Pada Medium Pati Biji Nangka,
Laboratorium Kimia Jurusan PMIPA FKIP Universitas Riau, Pekanbaru
Daintith, 1994, Kamus Lengkap Kimia, Erlangga, Jakarta.
Darmajana And Agustina, 2008, Pengaruh Konsentrasi Enzim α-Amilase
Terhadap Sifat Fisik Dan Organoleptik Filtrat, Balai Besar Teknologi
Tepat Guna – Lipi, Subang
Hardjono, 2001, Spekstroskopi, liberty, Yogyakarta
Lehninger, 1999, Biokimia Dasar, Erlangga, Jakarta
Poedjiadi, 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI Press, Jakarta
Sadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim. Jakarta : Widya Medika.
Soeharsono. 2006. Biokimia 1. Yogyakarta: UGM Press
Tranggono dan Sutardi. (1990). Biokimia dan Teknologi Pasca Panen. Gajah
Mada University Press. Yogyakarta.
LAMPIRAN 1
(PERHITUNGAN)
1. penentuan kada gula pereduksi
Diketahui :
V sampel : 5 ml
V enzim : 0,1 ml
V analit : 1 ml
V total : 5 ml
BM Glukosa : 180
t ( waktu ) : 30 menit
Ditanya : kadar gula pereduksi dari enzim (ekstrak kasar, fraksi I dan
fraksi II ) = ...?
Jawab :
y = ax + b  y : absorbansi x : kadar gula
y = 0,216682 x + 0,008955
y−b 𝑣 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑣 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 1 1
maka, x= × × × 𝐵𝑀 × 𝑡
a 𝑣 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑣 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡

- Ekstrak kasar
Absorbansi : 0,049
y−b 𝑣 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑣 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 1 1
x= × × × 𝐵𝑀 × 𝑡
a 𝑣 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑣 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡
0,049 – 0,008955 5 𝑚𝑙 5 𝑚𝑙 1 1
= × × × 30 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡
0,216682 0,1 𝑚𝑙 1 𝑚𝑙 180

= 0,00847 mg/ml
- Fraksi I
Absorbaansi : 0,061
y−b 𝑣 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑣 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 1 1
x= × × × 𝐵𝑀 × 𝑡
a 𝑣 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑣 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡
0,061 – 0,008955 5 𝑚𝑙 5 𝑚𝑙 1 1
= × × × 30 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡
0,216682 0,1 𝑚𝑙 1 𝑚𝑙 180

= 0,01089 mg/ml
- Fraksi II
Absorbansi : 0,018
y−b 𝑣 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑣 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 1 1
x= × × × 𝐵𝑀 × 𝑡
a 𝑣 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑣 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡
 0,018 – 0,008955 5 𝑚𝑙 5 𝑚𝑙 1 1
= × × × 30 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡
0,216682 0,1 𝑚𝑙 1 𝑚𝑙 180

= 0,001911316 mg/ml

2. penentuan kada protein

Diketahui :
A ekstrak kasar : 0,558
A fraksi I : 0,584
A fraksi II : 0,552
Fp : 10
Ditanya : kadar protein ekstrak kasar, fraksi I dan fraksi II= ...?
jawab :
y = ax + b  y : absorbansi x : kadar protein
y = 0,0006 x + 0,0537
y−b
maka, x= × Fp
a

- Ekstrak kasar
y−b
x= × Fp
a
0,558 – 0,0537
= × 10
0,0006

= 8405 mg/ml
- Fraksi I
y−b
x= × Fp
a
0,584 – 0,0537
= × 10
0,0006

= 8838,333 mg/ml
- Fraksi II
y−b
x= × Fp
a
0,552 – 0,0537
= × 10
0,0006

= 8305 mg/ml
3. Aktivitas spesifik enzim
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎
Aktivitas spesifik enzim = 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛
- Ekstrak kasar
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎
Aktivitas spesifik enzim = 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛
0,00847 mg/ml
= 8405 mg/ml

= 0,000001 unit /mg

- Fraksi I
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎
Aktivitas spesifik enzim = 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛
0,001911316 mg/ml
= 8838,333 mg/ml

= 0,000000216 unit /mg

- Fraksi II
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎
Aktivitas spesifik enzim = 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛
0,01089 mg/ml
= 8305 mg/ml

= 0,00000131 unit /mg