Percobaan 9

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Novia Nur Annisa

10516001, Kelompok 1, Shift Senin, Praktikum KI2221 Cara Pemisahan dan Elektrokimia

Abstrak
Pada percobaan ini dilakukan analisis kafein menggunakan metode kromatografi cair kinerja
tinggi atau HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Kromatografi merupakan salah
satu metode pemisahan komponen-komponen campuran yang berdasarkan distribusi diferensial
dari komponen-komponen sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Teknik
HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk
keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC
didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan area
standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu
konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Kata Kunci: kurva kalibrasi, fasa gerak, fasa diam,pemisahan.

I. Pendahuluan
Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk
memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam
kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu
ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona
campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak
sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang
”diam“ (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari
campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang “diam”
dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen
akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan
dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang

1
berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen
yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen
campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel
diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang
dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT
(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran
komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam
sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa
gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah
RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa
larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini
bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.

II. Metoda
a. Alat
1. Instrumen HPLC
2. Spatula
3. Labu ukur 10 mL
4. Corong pendek
5. Pipet tetes
6. Gelas kimia 20 mL
7. Gelas ukur 500 mL
8. Ultrasonic vibrator
9. Pipet seukuran (1,2,3,4,5 mL)
10. Kertas saring Whattmann

2
 b. Bahan
1. Kafein standar 500 mL
2. Larutan 5% asam fosfat
3. Larutan 5% methanol
4. Air bidestilasi
5. Sampel minuman mengandung kafein

c. Cara Kerja
a) Pembuatan fasa gerak (eluen)
Buat fasa mobil dengan komposisis 140 mL aquabidest, 1,4 mL H3PO4 5%
dan 60 mL methanol. Hilangkan gas terlarut dalam larutan ini dengan
menggunakan ultrasonic bath.
b) Penyiapan larutan standar
Dengan menggunakan larutan standar 500 ppm kafein, buat sederet larutan
standar dengan konsentrasi masing-masing 20, 40, 60, 80 dan 100 ppm
sebanyak 5 mL. Lakukan pengenceran dengan menggunakan eluen yang
telah dibuat di atas.
c) Penyiapan larutan sampel
Khusus untuk minuman jenis cola, hilangkan terlebih dahulu gas terlarut
dengan menggunakan ultrasonic bath. Lakukan pengenceran sebesar 5
(lima) kali dalam sebuah labu takar 10 mL dengan menggunakan eluen.
d) Analisis
Rekam kromatogram masing-masing larutan standar dan sampel yang telah
dipersiapkan. Catat parameter peralatan kromatografi yang digunakan
seperti: laju alir eluen, tekanan, jenis kolom yang digunakan, panjang
gelombang detektor, kecepatan kertas perekam.
III. Hasil dan Dsikusi
Laju alir eluen : 1 mL/menit
Jenis kolom : C-18 fasa terbalik
Lamda detector : 280 nm

3
Waktu Analisa : 7 menit
Tekanan : 275,00 – 360,00 bars
Ukuran kolom : 12,09 x 0,4 cm
Jenis detector : DAD
No. Konsentrasi (ppm) Waktu retensi (s) Luas (mAU2) Tinggi (mAU)
4,69 492,55 18,70
1 40
5,51 1118,11 23,72
4,63 784,66 31,31
2 60
5,49 1406,22 32,83
4,60 1125,16 45,12
3 80
5,49 1830,60 43,05
4,59 1464,3 88,1
4 100
5,50 2284,00 53,29
3,839 2272 103,8
5 120
4,334 3012 78,5
6 sampel 3,214 1047,4 64,8

Kurva Luas terhadap konsentrasi:

kurva luas terhadap konsentrasi

2500

y = 21.193x - 467.68
2000 R² = 0.9486

1500
luas

1000

500

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Konsentrasi

4
Maka konsentrasi sampel kratingdeng:
𝑦 = 21,193𝑥 − 467,68
1047,4 = 21,193𝑥 − 467,68
𝑥 (𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙) = 71,48 × 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛
10
𝑥 (𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙) = 71,48 ×
2
Konsentrasi sampel = 357,4 ppm

Kurva tinggi terhadap konsentrasi:

kurva tinggi terhadap konsentrasi

120

y = 1.135x - 33.39
100 R² = 0.9498

80

60

40

20

0
0 20 40 60 80 100 120 140

Konsentrasi sampel kratingdeng:

𝑦 = 1,135𝑥 − 33,39
64,8 = 1,135𝑥 − 33,39
𝑥 (𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙) = 93,595 × 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛
10
𝑥 (𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙) = 93,595 ×
2
Konsentrasi sampel = 467,98 ppm

5
 Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom
kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa
gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.
Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom
terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan
keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom
dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil. Selain itu adanya gas dalam fasa gerak juga harus dihilangkan,
sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor
sehingga akan mengacaukan analisis. Pada percobaan ini fasa gerak yang digunakan yaitu
campuran methanol dan air (3:7).
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat
dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan
campuran menjadi komponen-komponen. Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya
bervariasi bergantung pada keperluan, misalnya pada percobaan ini digunakan kolom C-
18. Sedangkan ukuran kolom sebesar 12,05 x 0,4 cm. Kolom pengaman (guard coloumn)
disebut juga pra-kolom karena letaknya sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini
berukuran pendek 5 cm dengan diameter 4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika
berukuran besar dari ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua

6
fungsi yaitu: menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan
fasa gerak dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut.
Pada HPLC, pompa berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom
yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode ini sebagai
akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar mengalir dalam kolom
yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat cair dapat melewati kolom
secara tepat maka dibutuhkan bantuan pompa yang bertekana tinggi. Sampel-sampel cair
dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir dibawah
tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan
karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal. Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom)
kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh, tapi
bila tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil eksperimen dan
ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana si-operator menggunakan penyuntik.
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap
golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka
terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Rekorder adalah alat untuk
mencetak hasil percobaan pada lembar berupa kumpulan puncak (kromatogram)
kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas
peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan
jumlah komponen.
Data konsentrasi yang diperoleh pada percobaan ini yaitu 357,4 ppm dan 467,98 ppm

IV. Kesimpulan
Berdasarkan data, pengolahan data, dan praktikum yang diselesaikan berhasil
menganalisis kafein dalam sampel minuman kratingdeng melalui analisis HPLC.
Konsentrasi kafein dalam kratingdeng berdasarkan kurva luas yaitu 357,4 ppm dan
Konsentrasi kafein dalam kratingdeng berdasarkan kurva tinggi 467,98 ppm.

7
V. Referensi
Harvey,David, Modern Analytical Chemistry, McGraw Hill, Inc., New York, 2000,
p.508-509
Skoog, West, Holler. 1994. Analytical Chemistry: An Introduction, 6th ed. Saunders
College Publishing : Philadelphia.