Metode analisis metabolit profil global dan diagnostik ion strategi penyaringan oleh LC-

QTOF MS untuk identifikasi cepat potongan mentah dan olahan dari Rheum palmatum
L.
Food Chemistry 192 (2016) 531-540
*,
Jia-Qi Yao, Peng-Yuan Li, Ding -Rong Yu, Yin-Lian Ma
Institut Cina Materia Medica, Cina Academy of Chinese Medical Sciences, No. 16 Nanxiao Lane, Dongzhimennei, Beijing
100.700, Cina
articleinfo
Pasal sejarah: Diterima 12 Februari 2015 Diterima dalam bentuk direvisi 24 Juni 2015 Diterima 5 Juli 2015 Tersedia online 9 Juli
2015
Keywords: Rheum palmatum L. Rebusan buah otentikasi Metabolomik Diagnostik ion filtering RRLC-QTOF MS
abstrak
karena ragam fungsi, rhubarb telah digunakan selama ribuan tahun di banyak negara. Hal ini monly com- digunakan setelah
pengolahan. Pengolahan biasanya mempengaruhi profil kimia dan isi senyawa aktif dalam herbal, yang menyebabkan perubahan
bioactivities mereka. Di sini, pendekatan dari metabolit profiling dan diagnostik ion strategi penyaringan dengan kromatografi
cair-quadrupole / waktu-of-penerbangan trometry massa spec- didirikan untuk identifikasi cepat dari potongan mentah dan olahan
dari Rheum palmatum L. (RPL). Informasi komprehensif dan objektif dari 30 batch RPL meliputi baku dan dua metode
pengolahan umum yang diberikan oleh profil metabolomika. Menggunakan algoritma ekstraksi fitur molekul, senyawa non-target
dianalisis dalam beberapa menit. Secara total, 73 penanda karakteristik diekstraksi dan diidentifikasi oleh penyaringan ion
diagnostik. Mereka telah dianalisa lebih lanjut oleh setidaknya squares- pengenalan pola dukungan vektor mesin berbasis parsial.
Metode yang komprehensif dan cepat untuk potongan mentah dan olahan klasifikasi RPL menunjukkan baik sensitivitas,
spesifisitas dan kinerja prediksi.
Ó 2015 Elsevier Ltd All rights reserved.
1. Pendahuluan
Rhubarb, termasuk Rheum palmatum L., Rheum tanguticum Maxim. ex Balf dan Rheum officinale Baill, telah digunakan
untuk thou- pasir dari tahun di banyak negara karena ragam fungsi (Huang, Lu, Shen, Chung, & Ong, 2007), seperti pencahar,
anti-inflamasi, antikanker, antioksidan, dan antitumor (Jelassi et al, 2013;. Qin et al, 2011;.. Suboj et al, 2012). Kimia dan
penyelidikan farmakologi mengungkapkan bahwa senyawa fenolik, termasuk antrakuinon, sennosides, stilbenes, dan tanin
bertanggung jawab untuk efek terapi secara keseluruhan (Chen et al, 2009;. Cheng, Wu, Ho, & Yen, 2013; Li, Pan, & Sweet ,
2013). Karena popularitasnya, rhubarb telah resmi terdaftar di Farmakope Cina, United State Pharmacopoeia dan Farmakope
Jepang, dll, yaitu sebagai Radix et Rhizoma Rhei (Farmasi & Food Safety Bureau, 2006; Komite Pharmacopoeia Negara
Republik Rakyat Cina, 2010 ; Amerika Serikat Pharmacopeial Konvensi, 2010).
Pengolahan dapat mempengaruhi profil kimia dan isi senyawa aktif dalam herbal, yang menyebabkan perubahan bioactivities
(Cheng, Liu, Peng, Qi, & Li, 2011). Misalnya, akar ginseng, konversi sive extension ginsenosides kutub asli dalamdiproses
ginsenguntuk, kurang polar, senyawa degradasi baru di mengukus ginseng diproses diamati (Chan et al., 2007). Pengobatan
mengepul ini meningkatkan kemoprevensi kanker ginseng (Qi, Wang, & Yuan, 2010). Oleh karena itu, otentikasi dan kontrol
kualitas bahan herbal yang diproses adalah tugas yang menantang bagi para analis.
Rhubarb umumnya digunakan setelah pengolahan. Potongan rebusan ( '' Zhipian '' dalam bahasa Cina) yang diterapkan
dengan cara cessing pro membedakan di negara-negara yang berbeda mengenai tujuan bervariasi. Berbagai metode analisis telah
dikembangkan untuk characteriz- ing komposisi kimia dari rhubarb dalam bentuk yang berbeda, misalnya, segar atau kering, atau
dari sumber-sumber spesies bervariasi (Wang et al, 2011;. Ye, Han, Chen, Zheng, & Guo 2007). Sebagian besar peneliti sedikit
perhatian untuk bahan olahan, khususnya untuk perbedaan antara bahan baku dan yang diproses yang mungkin memiliki pola
kimia berbeda- ent. Akibatnya, sangat menarik untuk mengembangkan metode untuk mengklasifikasikan berbagai jenis sampel
rhubarb, dan untuk mengidentifikasi perbedaan yang tepat dari beragam rhubarb diproses juga.
Metode utama yang digunakan dalam otentikasi berbagai jenis sampel rhubarb yang metode sidik jari kromatografi dan analisis
profil kimia. Metode ini berguna untuk mengidentifikasi rhubarb mentah dan olahan. Namun, strategi tersebut terdiri dari
beberapa langkah berturut-turut yang mengidentifikasi metabolit dan kemudian Star Excursion Balance Test *
Penulis Sesuai.
makan informasi kualitatif komposisi fitokimia menggunakan
alamat e-mail: x.heqi@163.com (Y.-Q. Xiao).
kromatografi cair (LC) atau spektrometri massa (MS) (Ni, Lagu,
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.07.013 0308-8146 / Ó 2015 Elsevier Ltd All rights reserved.
Ying Liu , Li Li, Yong-Qing Xiao
Isi daftar tersedia di ScienceDirect

Food Chemistry
jurnal www.elsevier.com/locate/foodchem
homepage:.& Kokot, 2012; Wang et al, 2014). Kelengkapan dari metode ini tergantung pada jumlah metabolit diidentifikasi atau
senyawa referensi yang tersedia dibandingkan pada sampel. Seluruh analisis terbatas pada subset metabolit dan banyak perbedaan
yang bermakna dapat diabaikan.
Tren otentikasi adalah penerapan metode profiling metabolomika oleh MS, memberikan analisis informasi yang komprehensif
dan berisi dan memiliki sensitivitas, spesifisitas, dan fleksibilitas (Dunn & Ellis, 2005). Profil metabolomika sangat kuat dalam
menggambarkan persamaan dan perbedaan sistem biologis dengan profil lengkap metabolit dalam suatu organisme, yang telah
digunakan untuk menyelidiki perbedaan metabolisme antara spesifik jaringan tanaman (Chen et al., 2014), keamanan pangan
(Chen et al. 2012; Liu et al, 2014) dan diagnostik penyakit (Wagner, Scholz, Sieber, Kellert, & Voelkel, 2007) baru-baru ini..
Strategi ini mengadopsi auto dikawinkan algoritma ekstraksi senyawa ke profil sampel pada tingkat fragmen molekul individu
tanpa canggih puncak tugas. Ini adalah analisis yang komprehensif dari semua bagian metabolit dan perbedaan metabolik
mungkin.
Dalam studi ini, metabolit profiling dan diagnostik ion strategi penyaringan dengan waktu-of-flight spektrometri massa LC-
quadrupole (LC-QTOF-MS) diusulkan (Gambar. 1) untuk klasifikasi cepat sampel rhubarb mentah dan olahan. Untuk
memvalidasi kepraktisan metode yang diusulkan, R. palmatum L., yang specie bersifat obat yang paling populer dari Radix et
Rhizoma Rhei digunakan sebagai studi kasus ilustratif. Pertama, profil metabolik penuh dari kedua rial mate- mentah dan olahan
diperoleh melalui LC-QTOF-MS, diikuti oleh multivari- sebuah makan analisis statistik. Sebuah analisis statistik multivariat
digunakan untuk mendapatkan model prediktif untuk klasifikasi bahan baku dan yang diproses. Setelah itu, ion diagnostik utama
dan jalur tion fragmentasi dari kelas yang berbeda dari senyawa dalam QTOF-MS dirangkum dengan senyawa referensi yang
tersedia. Menggunakan penyaringan ion diagnostik, identifikasi cepat dari senyawa penanda dicapai.
2. Eksperimental
2.1. Bahan kimia dan reagen
Standar acuan terdiri dari 12 antrakuinon, 3 stilbenes, 5 phenylbutanones, asam 1 fenolik dan 2 tanin. Physcion- 8-ob-
D
-glucopyranoside, chrysophanol-8-ob-
D
-glucopy-ranoside, aloe-emodin-8-ob-
D
-glucopyranoside,Rhein-8-ob-
D
sisi-glucopyrano-, emodin-8- ob-
D
-glucophyranoside, aloe-emodin-3-CH
2
-Ob-
D
-
532 Y. Liu et al. / Food Chemistry 192 (2016) 531-540
Gambar. 1. Skema diagram profil metabolit dan diagnostik ion strategi penyaringan.
-glucophyranoside, glucophyranoside, emodin-1-ob-
D
 Rhein, emodin, aloe emodin, trans-3,30,50-trihidroksi-4-metoksi-stilbene-
30-ob-
D
-glucopyranoside, trans-3,5,40 -trihydroxystilbene-40-ob-
D
-gluco- pyranoside, trans-3,5,40-trihydroxystil-bene-40-ob-
D
- (600-O-gallo- yl) -glucopyranoside, 4- (40-hidroksifenil) -2-butanone-
4- (40-hydr oxyphenyl) -2-butanone-40-ob-
D
- (600-O-sinamoil) ide -glucopyranos-, 4- (40-hidroksifenil) -2-butanone-40- ob-
D
- (600-Op-coumaroyl) -glucopyranoside, 4- (40-hidroksifenil) -2-butanone-40-
ob-
D
- (200-O-galloyl-600-Op-coumaroyl) -glucopyranoside, 4-
(40-hydroxyp henyl) -2-butanone-40-ob-
D
- (600-O-galloyl) - glucopyranoside; asam galat, catechin, epicatechin diisolasi sebelumnya dari akar kering dari R. palmatum L.
di laboratorium kami. Sennoside A dan sennoside B dibeli dari Institut Nasional untuk Pengawasan Obat dan Makanan (Beijing,
Cina). Struktur mereka yang lanjut dijelaskan di laboratorium penulis oleh 13C Data NMR dan MS (ditunjukkan pada Gambar
S1.) (Kashiwada, Nonaka, & Nishioka, 1984, 1986; Nonaka, Minami, & Nishioka, 1977; Nonaka, Nishioka, Nagasawa, & Oura,
1981; Okabe, Matsuo, & Nishioka, 1973). Kemurnian masing-masing senyawa standar bertekad untuk menjadi lebih dari 95%
dengan normalisasi daerah puncak terdeteksi oleh HPLC-dioda detektor array (DAD) -quadruple / MS. HPLC kelas ACN,
metanol dan MS kelas asam asetat diperoleh adalah dari Dikma (California, AS). Air deionisasi (18 MX cmÀ1) disusun oleh air
suling melalui Arium 61.316 / 611VF sistem (Göttingen, Jerman). Semua bahan kimia yang digunakan dari sumber-sumber
komersial adalah kelas analitis atau lebih tinggi.
2.2. Persiapan sampel
kering sampel R. palmatum L. (benar-benar 30 batch) yang kumpulkan lected dari Yushu di Qinghai, Cina. Semua sampel
voucher yang disahkan oleh Pro. Shi-Lin Hu dan disimpan di Institut Materia Medica Cina di China Academy of Chinese
Medical Sciences (Beijing, Cina). Di antara mereka, 20 batch diproses menjadi potongan-potongan rebusan, termasuk potongan
kukus ( '' Shupian '' dalam bahasa Cina, 10 batch) dan hangus potongan ( '' Tanpian '' dalam bahasa Cina, 10 batch). Mereka
diproduksi oleh Renwei pengobatan Cina bahan pabrik pengolahan (Beijing, Cina) menurut China Pharmacopeia (edisi 2010)
(Negara Komite Farmakope Republik Rakyat Cina, 2010). The menggenangi tersisa digunakan sebagai bahan baku ( '' Shengpian
'' dalam bahasa Cina).
Sampel rhubarb yang berbeda bubuk untuk ukuran homogen dan disaring melalui No. 40 mesh. Sebuah aliquot dari 0,5 g
bubuk dari setiap batch sampel disonikasi di 25 mL dari 70%
metanol (v / v) selama 10 menit pada suhu kamar, diikuti oleh ing penyaring- dan kemudian pemusingan pada 12.000 rpm selama
5 menit. The natant super- akhir dipindahkan ke botol auto sampler untuk analisis.
2.3.RRLC-QTOF-MS analisis
Analisiskromatografi dilakukan pada Agilent 1200 Series (Agilent, Jerman) sistem LC yang dilengkapi dengan pompa biner,
degasser mikro, auto piring-sampler, dan apartemen kolom termostatik dikendalikan. Pemisahan kromatografi dilakukan pada 30
± 0,1 ° C pada (4,6 mm  50 mm, 1,8 lm). The Agilent XDB-Cmobile
18
fasekolom terdiri dari (A) air (0,2% asam asetat, v / v) dan (B) asetonitril (0,2% asam asetat, v / v) menggunakan elusi gradien
dari 13-13% B di 0-1.4min, 13-15% B di 1,4-1,5 menit, 15-16% B di 1,5-3,5 menit, 16-20% B di 3,5-6 menit, 20-24% B di 6-7
menit , 24-30% B di 7-8,7 menit, 30-31% B di 8.7-11.4min, 31-41% B di 11.4-12.9min, 41-54% B di 12,9-13 menit, 54-60% B
di 13-14 menit, 60-100% B di 14-16 menit, 100-100 B% pada 16-18min. Volume injeksi adalah 2 lL dan laju aliran adalah 0,5
mL / menit. Dua puluh tiga senyawa referensi yang tersedia yang membaur sebagai '' kontrol kualitas '' (QC) sampel untuk
menjaga kondisi berperan stabil selama proses analisis keseluruhan. QC sampel dianalisis sebelumnya, antar dan setelah analisis
sampel setiap hari. Kosong 70% metanol (2 lL) disuntikkan antara sampel untuk memvalidasi antar-sampel efek lintas-berbicara.
 Pendeteksian kualitatif dilakukan oleh 6520 massa spektrometer QTOF (Agilent Technologies, Jerman) dilengkapi dengan
electrospray ionisasi (ESI) interface. Parameter operasi adalah sebagai berikut: pengeringan gas (N
2)
tingkat dan suhu mengalir pada 10,0 L / menit dan 350 ° C; nebulizer, 45 psig; Tingkat
selubung aliran gas dan suhu di 12 L / menit dan 400 ° C; kapiler, 3500 V; mer skim-, 65 V; Oktober RFV, 750 V dan tegangan
fragmentor, 120 V. Untuk percobaan MS / MS, energi tabrakan disesuaikan dari 15 sampai 35 V untuk mengoptimalkan sinyal
dan mendapatkan maksimal tion INFORMATION struktural dari ion yang menarik. Setiap sampel dianalisis dalam mode negatif
dan dalam rangkap tiga. Rentang massa diatur pada m / z 100-1000. Pengukuran massa akurat (error <5 ppm untuk analit)
diperoleh dengan cara sistem pengiriman calibrant otomatis menggunakan dual-nebulizer ESI sumber. Sumber ESI
memperkenalkan tingkat rendah aliran (100 lL / min) dari solusi kalibrasi (calibrant solusi A, Agilent Technologies), yang berisi
massa referensi internal pada m / z 112,9856, 980,0164 dalam mode ion negatif.
2.4. Analisis data
Data RRLC-ESI / QTOF MS awalnya dianalisis menggunakan ekstraksi fitur molekul (MFE) algoritma perangkat lunak
MassHunter Workstation (versi B 05.00 Kualitatif Analisis, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Ion, rekening
melebihi 500 jumlah dengan biaya negara sama dengan satu, diekstraksi sebagai fitur molekul (MFS) dari penanganan sampel
yang representatif untuk evaluasi statistik dan chemometric dari set data yang diperoleh. Mereka yang ditandai dengan waktu
retensi (RT), kelimpahan, dan massa akurat. Ambang batas jumlah ion senyawa ditetapkan sebagai dua atau lebih ion. Model
isotop didasarkan pada Cules mole- umum organik. Semua fitur diekstrak dalam berjalan kosong (70% metanol) adalah sub
tracted dari fitur sampel untuk mengurangi kebisingan kimia. File yang dihasilkan dalam format pertukaran senyawa (file .cef) di
ciptakan untuk setiap sampel dan diekspor ke dalam paket Mass Profiler Profesional (MPP) software (versi B.12.05, Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, USA) untuk diproses lebih lanjut .
Analisis statistik multivariat dilakukan dengan menggunakan MPP soft ware. Penyelarasan RT dilakukan di seluruh sampel
set menggunakan jendela toleransi 0,2 menit. MFS dari sampel yang berbeda yang selaras dengan menggunakan algoritma
pergeseran normalisasi persentil dan dasar
Y. Liu et al. / Food Chemistry 192 (2016) 531-540 533
ke median dari semua pilihan sampel. Pengurangan bertahap dari jumlah MFS dilakukan berdasarkan frekuensi kejadian,
perubahan kali lipat dan hasil analisis satu arah varians (ANOVA). Akhirnya, data diekspor dan dianalisis dengan kuadrat parsial
(PLS) dan support vector machine (SVM).
PLS merupakan metode pengenalan pola tanpa pengawasan tanpa informasi ori pri dari kumpulan data dan mempertahankan
varians maksimum data multi-dimensi sekaligus mengurangi dimensi nya (Boulesteix & strimmer, 2007). Oleh karena itu, PLS
digunakan untuk memilih fitur penting sebelum classifier pelatihan, untuk menentukan model klasifikasi tanpa mengurangi
kinerjanya. PLS classifier memutuskan: median dari nilai tertimbang (MWV) digunakan untuk mengukur pentingnya fitur. Titik
cutoff ditetapkan sebagai 0,40. Jika Mwv P 0,40, fitur yang sesuai diidentifikasi sebagai variabel kunci yang dapat
mempengaruhi kinerja model klasifikasi.
SVM, awalnya diperkenalkan oleh Cortes dan Vapnik (1995), telah diindikasikan sebagai alat klasifikasi kuat yang dapat
mengatasi kasus umum klasifikasi nonlinear dan non-dipisahkan secara efisien. Tujuan dari SVM adalah untuk menemukan
hyperplane yang memaksimalkan lebar margin antara kelas dan pada saat yang sama meminimalkan kesalahan empiris (Chen,
Xuan, Riggins, Clarke, & Wang, 2011). Di sini, kami memilih radial basis function (RBF) seperti yang dijelaskan dalam
penelitian kami sebelumnya (Jiang et al., 2013).
Kinerja keseluruhan rhubarb classifier dievaluasi dengan 5 kali lipat uji cross-validasi. Keseluruhan prediksi akurasi (ACC),
penerima operasi karakteristik (ROC) dan daerah di bawah kurva (AUC) yang digunakan untuk mengukur kinerja prediksi
model. Kurva ROC dapat menunjukkan kemanjuran satu tes dengan menghadirkan kedua sensitivitas dan spesifisitas untuk poin
cutoff yang berbeda (Baldi, Brunak, Chauvin, Andersen, & Nielsen, 2000). Sensitivitas dan ficity speci- sangat cocok untuk
mewakili kemampuan tes untuk mengidentifikasi positif benar dan yang salah dalam dataset. Kurva ROC yang plot- ted dan
dihaluskan oleh software SPSS dengan sensitivitas pada sumbu y dan spesifisitas pada sumbu x. The 5-kali lipat cross-validasi
prosedur uji: kelas dalam input data secara acak dibagi menjadi lima bagian yang sama, empat bagian yang digunakan untuk
pelatihan model, dan sampel yang tersisa (test set) diklasifikasikan dengan menggunakan model structed con. Seluruh proses
diulang (n = 5) sebelum sensitifitas sen- dan spesifisitas terhadap parameter yang berbeda di lima dataset uji dihitung untuk kurva
ROC.
3. Hasil dan diskusi
3.1. Sistem RRLC ekonomi dengan ukuran partikel kecil kolom
analisis kecepatan tinggi dicapai sebagai benar-benar kurang dari 20 menit untuk pemisahan ekstrak rhubarb mentah dan
diproses melalui sistem RRLC dikemas dengan partikel berpori 1,8-lm di kolom pendek (ditunjukkan pada Gambar. 2 dan S2).
Ini adalah sekitar 2-4 kali lebih cepat daripada yang menggunakan kolom konvensional dikemas dengan partikel 5.0-lm (Li et al,
2009;.. Ye et al, 2007). Sementara itu, waktu yang dibutuhkan untuk pengembangan metode dan kolom imbang jauh lebih
pendek. Selain itu, waktu analisis singkat kontribusi terhadap penurunan yang signifikan dari konsumsi pelarut dan biaya kurang.
Dalam KASIH pengalaman-, konsumsi pelarut berkurang 75-85%. Di bawah laju aliran rendah 0,5 mL / menit, sampling rate
yang dibutuhkan untuk MS memenuhi persyaratan. Penggantian pipa koneksi singkat ditingkatkan resolusi. Sistem RRLC dengan
kolom ukuran partikel kecil adalah metode yang sangat berguna dan ekonomi untuk analisis sampel rhubarb yang berbeda.
3.2. Global metabolit profiling oleh QTOF-MS
Seluruh analisis metabolit bagian dan banyak perbedaan metabolik mungkin tergantung pada berisi metabolit profiling.
Mengingat kompleksitas metabolit tanaman (ondary primer dan sek-) yang terdiri beragam jenis dan isi yang berbeda dari bahan
kimia, analisis yang komprehensif dari metabolit dalam herbal adalah ficult dif-. Namun demikian, QTOF MS menawarkan
selektivitas tinggi di bawah modus full-scan, resolusi tinggi, akurasi massa yang besar dan beberapa mentations-fragmen untuk
informasi struktural, sehingga memungkinkan untuk analisi sis metabolit non-target. Dalam karya ini, analisis metabolit non-
target di 30 batch rhubarbs sampel meliputi baku dan dua yang diproses dilakukan secara langsung. The cross-talk antara sampel
ditemukan menjadi diabaikan oleh memvalidasi solusi kosong setelah analisis dari ekstrak rhubarb. Modus ion negatif dipilih
untuk analisis karena intensitas relatif lebih tinggi dari kebanyakan metabolit dibandingkan dengan mereka dalam mode positif.
3.3. Imparsial filtering fitur dan data perlakuan pendahuluan
Hal ini agak menantang untuk menemukan fitur karakterisasi dari puncak terlihat atau senyawa target yang diekstraksi dengan
pekerjaan manual. Ini adalah waktu menuntut, dan banyak senyawa tingkat rendah mungkin akan terjawab. Algoritma MFE
adalah metode senyawa-menemukan berguna yang bisa menggabungkan isotop dan hubungan kimia mungkin, seperti adduct dan
dimmer, menjadi senyawa tunggal. Semua senyawa akan ditandai dengan massa akurat dikombinasikan dengan kelimpahan dan
retensi waktu mereka. Seluruh prosedur itu com- pleted di menit lebih cepat dari analisis manual yang akan menghabiskan
minggu. Kemudian, untuk meminimalkan data yang kompleks, penyaringan lebih lanjut prosedur-prosedur berdasarkan ANOVA
satu arah (p = 0,05) dan lipat perubahan (nilai FC, FC P 2.0) analisis. Jumlah MFS adalah 1482 dari seluruh suntikan, dan secara
signifikan dikurangi menjadi 73 setelah langkah penyaringan. Sebanyak 73 penanda karakteristik akhirnya digunakan untuk
melakukan analisis statistik multivariat yang lebih komprehensif dan berisi, dibandingkan dengan yang dipilih beberapa
komponen (18 atau 8) sebagai penanda karakteristik dalam metode dilaporkan sebelumnya (Ni et al, 2012;. Wang et al. 2014).
Informasi identifikasi mereka dirangkum dalam Tabel 1. Karakteristik dari metode yang diusulkan dan sastra melaporkan metode
yang diringkas dalam Tabel S1.
3.4. Analisis statistik multivariat
Dalam sistem pembelajaran mesin, langkah yang paling memakan waktu adalah pelatihan kembali dari classifier. Pendekatan
alternatif adalah untuk memilih fitur penting sebelum pelatihan classifier. Oleh karena itu, PLS digunakan
534 Y. Liu et al. / Food Chemistry 192 (2016) 531-540
Gambar. 2. Total kromatogram ion khas bahan baku dari Rheum palmatum L. oleh LC-QTOF-MS dalam mode ion negatif.
Angka-angka puncak yang sesuai dengan nomor senyawa dalam Tabel 1.
untuk memilih variabel karakteristik kunci. The Mwv dari 73 variabel ditunjukkan pada Tabel S2. Akibatnya, sepuluh fitur,
MWV dari yang lebih besar dari 0,40, dipilih sebagai variabel karakteristik kunci untuk pelatihan classifier.
SVM digunakan sebagai metode klasifikasi untuk memodelkan diskriminasi dalam sampel rhubarb yang berbeda. Di sini,
sepuluh variabel karakteristik kunci disaring oleh PLS digunakan untuk membangun model yang berbasis SVM untuk klasifikasi
bahan baku dan yang diproses. Daerah puncak dari sepuluh komponen pembuat kemudian subisidi sebagai masukan untuk
membangun dataset 10-dimensi, yang repre- sents 10 vektor. Tiga jenis sampel rhubarb yang diterapkan sebagai vektor output. A
5-kali lipat cross-validasi dilakukan untuk meningkatkan akurasi klasifikasi dan menghindari data melalui pas. Dalam
pemodelan, 30 batch sampel secara acak dipisahkan ke dalam pelatihan dan uji dataset untuk 100 kali. Kelembak classifier dilatih
oleh dataset pelatihan, dan ACC prediksi dan nilai AUC dievaluasi oleh dataset uji (ditunjukkan pada Gambar. 3). ACC dan AUC
nilai untuk tes yang berbeda itu dijumlahkan untuk menghitung error rata-rata dan standar seperti yang ditunjukkan pada Tabel
S3. Hasil tion recogni- dari sebagian besar 24 sampel konsisten dengan hasil aktual, dan ini sampel yang dipilih mewakili sampel
yang sesuai berhasil diklasifikasikan ke dalam tiga kelompok. Selanjutnya, 6 batch sampel uncontained digunakan sebagai
prediksi mengatur untuk menguji metode validasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa akurasi prediksi secara keseluruhan
mencapai 94,67 ± 7,71%, dan nilai-nilai AUC adalah 0,98 ± 0,01-1,00 (Konieczk, & Namiesnik, 2010; Szterk, Roszko, &
Cybulski, 2012; Szterk, Roszko, Malek, Czerwonka, & Waszkiewicz-Robak, 2012;. Szterk et al, 2012). Nilai AUC merupakan
indikator efektivitas sistem penilaian. Semakin dekat ke 1,00 AUC dari tes adalah, semakin tinggi efektivitas keseluruhan tes
akan. Kami menemukan bahwa rhubarb classifier memiliki area sekitar 1.00, menunjukkan bahwa itu efisiensi tinggi untuk
mengidentifikasi bahan baku dan dua jenis buah terhadap dataset tes independen yang berbeda. Semua hasil ini menunjukkan
bahwa metode pengenalan yang diusulkan berbasis SVM pola mungkin menjadi alat yang potensial untuk klasifikasi bahan
herbal yang beragam olahan.
3.5. Identifikasi cepat penanda kimia
Meskipun sejumlah laporan telah ditandai spektrum massa senyawa beragam rhubarb, beberapa dari mereka telah
mengidentifikasi
Tabel 1 LC-QTOF-MS pengukuran massa akurat dan distribusi dari 73 penanda kimia.
Senyawa tidak ada.
t
R
[mah] À (m / z) Kesalahan (min)
(ppm)
Rumus Molekul
Karakteristik ion fragmen Identifikasi RP SP CP
Experimental Teoritis
A1 * 7,129 445,0773 445,0776 À0.75 C
21
H
17
O
11
283.0233,239.0327 Rhein-8- ob-
D
-
glucopyranoside + + + A2 * 7,261 431,0969 431,0984 À3.40 C
21
H
19
O
10
269.0448,240.0417 Aloe-emodin-8-ob-
D
-
glucopyranoside + + À A3 * 7,278 861,1874 861,1884 À1.12 C
42
H
37
O
20
386.098,224.0432 SennosideB + + À A4 8,648 861,1834
861,1884 À1.76 C
42
H
37
O
20
386.0995,224.0468 Sennoside C atau D + À À A5 9,251
699,1319 699,1355 À1.20 C
36
H
27
O
15
386.1017,224.0470 Anthranone + À À A6 * 9,264 861,1876
861,1884 À0.89 C
42
H
37
O
20
386.1003,224.0468 Sennoside A + + À A7 9,272 431,0940
431,0984 À3.11 C
21
H
19
O
10
386.1004,224.0477 Anthranone + À À A8 9,548 597,1851
597,0886 A1 0,84 C
28
H
21
O
15
283.0241,239.0357 Rhein-8-ob-
D
-
(60-galloyl) glukosida + + À A9 9,866 431,0977 431,0984 À1.55 C
21
H
19
O
10
269.043,240.041,225.0557 Emodin-3- O-glukosida + À À
A10 9,899 433,1108 433,1140 À2.42 C
21
H
21
O
10
386.0963,224.0452 Anthranone À À + A11 10,576 831,2126
831,2142 À1.91 C
42
H
39
O
18
386.0996,224.0461 Anthranone + À À A12 * 10,601
431,0977 431,0984 À1.55 C
21
H
19
O
10
269.0449,240.0421,225.0547 Emodin-1-ob-
D
-
glucophyranoside + + À A13 11,034 831,2159 831,2142 2,06 C
42
H
39
O
18
386.0997,224.0507 Anthranone + À À A14 11,113 487,0845
487,0882 À2.58 C
23
H
19
O
12
283.0223,239.0344 Rhein turunan A + A A15 12,24
417,1155 417,1191 À2.62 C
21
H
21
O
9
253.0505,225.0552 Chrysophanol turunan + À À A16 *
12,364 415,1027 415,1035 À1.82 C
21
H
19
O
9
253.0505,225.0545 Chrysophanol- 8-ob-
D
-
glucopyranoside + + À A17 * 12,421 431,0975 431,0984 À2.01 C
21
H
19
O
10
269.0443,268.0363 Aloe-emodin-3-CH
2
-Ob-
D
-
glucophyranoside + + + A18 12,496 473,1107 473,1089 3,72 C
23
H
21
O
11
269.0462,225.0524 Emodin-8-O- (60-O-asetil) -
glucopyranoside + À À A19 * 12,582 431,0974 431,0984 À2.25 C
21
H
19
O
10
269.0456,240.0425,225.055 2 Emodin-8-ob-
D
-
glucophyranoside + + À A20 12,747 415,1027 415,1035 À1.82 C
21
H
19
O
9
253.0499,225.0547 Chrysophanol-O-glucopyranoside + + À
A21 13,499 517,1974 517,0988 À2.63 C
24
H
21
O
13
269.0435,225.0508 Emodin-8-O- (60-O-Malonyl) -
glucopyranoside + + À A22 13,994 567,1165 567,1144 3,67 C
28
H
23
O
13
253,0502, Chrysophanol-8-O- (60-O-galloyl) -glucoside + +
À A23 14,609 431,0977 431,0984 À1.55 C
21
H
19
O
10
283.0612,240.0433 Physcion-O-glukosida + + À A24 *
14,683 445,1099 445,1140 À3.24 C
22
H
21
O
10
283.0605,240.0423 Physcion-8-ob-
D
-
glucopyranoside + À À A25 * 16,372 269,0454 269,0455 À0.54 C
15
H
9
O
5
225,0556 Emodin A26 * 16,442 283,0242 283,0248 À2.15 C
15
H
7
O
6
239,0355 Rhein + + + A27 * 17,556 269,0460 269,0455
1,68 C
15
H
9
O
239.0347
5Aloe-emodin + + + S1 5,065 389,1233 389,1242 À2.28 C
20
H
21
O
8
227.0695,185.0594,143.0483 Piceid (Resveratrol-3-ob-
D
-
glucopyranoside) + + À S2 5,072 425,1047 425,1025 À1.14 C
26
H
17
O
6
227.0734,185.0451 stilbene + + À S3 5,074 449,1428
449,1453 À1.60 C
22
H
25
O
10
227.07,185.0599,143.0497 stilbene + + À S4 7,571 417,1169
417,1191 À1.28 C
21
H
21
O
9
255.0638,227.0677 stilbene + À À S5 7,685 541,1406
541,1405 0,23 C
20
H
29
O
17
227.0742,185.0532,143.0491 stilbene + À À S6 8,533
417,1179 417,1191 À2.88 C
21
H
21
O
9
255.0642,227.0686 stilbene + À À S7 * 8,541 419,1335
419,1348 À2.99 C
21
H
23
O
9
255.0651,227.0731 , 185.0597,145.0662 Rhaponticin (3,50,30-trihidroksi-4-methoxystilbene-30-ob-
D
- glukosida)
++À
S8 8.87 541,1334 541,1351 À2.22 C
27
H
25
O
12
227.0870,185.0594 Stillbene + + + S9 * 8,97 541,1343
541,1351 À1.57 C
27
H
25
O
12
227.0703,185.0602,143.0455 Resveratrol-40-ob-
D
-
(600-O-galloyl) -glucopyranoside + + + S10 * 9,08 389,1233 389,1242 À2.88 C
20
H
21
O
8
227.0713,185.0608,143.0496 Resveratrol-40-ob-
D
-
glucopyranoside + À À S11 9,912 487,0883 487,0882 0,21 C
23
H
19
O
12
255.064,227.0705 stilbene + À À S12 10,432 555,1470
555,1508 À2.83 C
28
H
27
O
12
 255.0632,227. 0731 Desoxyrhaponticin-600-O-gallate + À À
S13 10,801 541,1343 541,1351 À1.57 C
27
H
25
O
12
227.0715,185.0616,, 143,053 Resveratrol-40-ob-
D
-
(200-O-galloyl) -glucopyranoside + À À S14 11,286 227,0712 227,0714 À0.74 C
14
H
11
O
3
185.0557,159.0834,143.0483 Resveratrol + + À S15 12,099
535,1625 535,1610 2,85 C
29
H
27
O
10
227.0713,143.0499 stilbene + À À S16 15,662 671,1796
671,177 3,85 C
36
H
31
O
13
227.0705,185.0597,143.0477 stilbene + À À P1 3,922
325,1268 325,1293 À2.59 C
16
H
21
O
7
161,0582 (325-164) 4- (40-hidroksifenil) -2-butanone-40-ob-
D

glucoside + À + P2 * 7,658 477,1413 477,1402 2,23 C

23
H
25
O
11
163.0763,313.0561 (477-164), 169.0139,125.0240 4- (40-hidroksifenil) -2-butanone-40-ob-
D
- (600-O-galloyl) -
+ + + glucopyranoside P3 7,678 479,1475 479,1559 À1.46 C
23
H
27
O
11
163.0754,315.0653 (479-164), 169.0134,125.0233 (S) -4- (40-hidroksifenil) -2-butanol 2-O- ( 6-O-galloyl) -B-
D
- glucopyranoside
À++
P4 8,347 477,1378 477,1402 À1.09 C
23
H
25
O
11
313,058 (477-164) I solindleyin + + + P5 8,347 479,1448
479,1559 À3.09 C
23
H
27
O
11
163.0708,315.0616 (479-164), 169.0139,125.0237 (S) -4- (40-hidroksifenil) -2-butanol 2-O- (O -galloyl) -B-
D
- glucopyranoside
+ÀÀ
P6 * 9,548 163,0755 163,0765 À1.81 C
10
H
11
O
2
163,0755 4- (40-hidroksifenil) -2-butanone À + +
(bersambung ke halaman berikutnya)
Tabel 1 ( lanjutan)
Compound tidak ada.
t
R
[mah] À (m / z) Kesalahan
Molekuler
ion fragmen Karakteristik Identifikasi RP SP CP (min)
Eksperimental Teoritis
(ppm)
rumus
P7 * 12,19 471,1640 471,1661 À4.35 C
25
H
27
O
9
307,0823 (471-163), 163.0389,119.0497 4- (40-hidroksifenil) -2-butanone-40-ob-
D
- (600-Op-coumaroyl) -
+ À + glucopyranoside P8 * 14,349 623,1746 623,1770 À3.87 C
32
H
31
O
13
459,0923 (623 -
4- (40-hidroksifenil) -2-butanone-40-ob-
D
- (200-O-galloyl-600-Op
+ + + 164),
163.0394,119.0499,169.0134,125.0236
coumaroyl) -
glucopyranoside P9 * 15,715 455.1675 455.1711 À2.98 C
25
H
27
O
163.076,103.0546
84- (40-hidroksifenil) -2-butanone-40-ob-
D
- (600-O-sinamoil) -
+ À À glucopyranoside P10 16,025 607,1811 607,1821 A1. 64 C
32
H
31
O
443,0981
12(607-(40-hidroksifenil)
4- -2-butanone-40-ob-
D
- (200-O-galloyl-600-Op
+ + + 164),
163.0747,147.0453, 103.0554,169.0134,125.0248
sinamoil)
glucopyranoside P11 16,045 609,1949 609,1972 À3.78 C
32
H
31
O
12
443,1045 (607-164), 163,0770 phenylbutanone + + + O1
1,061 331,0663 331,0671 À2.32 C
13
H
15
O
10
331,0663 Galloylglucose + + + O2 1,291 331,0666 331,0671
À1.42 C
13
H
15
O
11
331,0666 Galloylglucose + À + O3 1,35 331,0651 331,0671
À1.93 C
13
331,0651 Galloylglucose + + + O4 * 1,387 169,0135
169.0142 À4.39 C
7
H
15
O
12 H
5
O
5
169,0135 asam Galia + + + O5 1,942 483,0769 483,0780
À2.33 C
20
H
19
O
14
483,0769 turunan asam Galia + À À O6 2,481 483,0776
483,0780 À0.89 C
20
H
19
O
14
483,0776 asam Galia turunan À + + O7 2,787 289,0704
289,0712 À2.81 C
15
H
13
O
6
289,0704 Catechin + + À O8 7,976 441,0825 441,0822 0,74
C
22
H
17
O
10
441,0822 Epicatechin-3-O-gallate + + À O9 9,433 479,1565
479,1559 À1.82 C
23
H
27
O
11
479,1565 asam Galia turunan A + A O10 9,887 473,1070
473,1089 À4.08 C
23
H
21
O
11
473,1070 Catechin turunan + + À O11 10,843 473,1042
473,1089 À3.99 C
23
H
21
O
473.1042
21Catechin turunan A + A O12 11,1 431,0957 431,0984
À2.18 C
21
H
19
O
10
431,0957 Catechin turunan + + À O13 11,472 431,0978
431,0984 À 1,32 C
21
H
19
O
10
431,0978 Catechin turunan + + À O14 11,761 473,1062
473,1089 À5.77 C
23
H
21
O
11
473,1062 Catechin turunan + + À O15 12,584 473,1102
473,1089 2,67 C
23
H
21
O
11
473,1102 Catechin turunan + + À O16 13,888 473,1077
473,1089 À2.61 C
23
H
21
O
11
473,1077 Catechin turunan + À À O17 14,25 457,1132
457,1140 À1.79 C
23
H
21
O
10
457,1132 Catechin turunan + + À O18 14,659 457,1122
457,1140 À3.97 C
23
H
21
O
10
457.1122 Catechin turunan + + À O19 15,546 487,1237
487,1246 À1.81 C
24
487,1237 Catechin turunan + + À
RP singkatan dari bahan baku; SP adalah singkatan dari potongan kukus; CP singkatan hangus potongan. + Terdeteksi; À Not
detected.
* Identified with reference compounds.
H
23
O
11
536
diagnostic ion to rapid classify and differentiate compounds. In this study, a diagnostic ion filtering strategy was established for
rapid characterization of different types of constituents in R. palmatum L., as shown in Fig. 4. Generally, major constituents of
rhubarb can be divided into several groups, including anthraquinones (anthranones), stilbenes, and phenylbutanones.
So far, anthraquinones reported from rhubarbs mainly include emodin, aloe-emodin, rhein, physcion, chrysophanol and their
derivatives. These anthraquinones shared a common parent nucleus 1,8-dihydroxy-9,10-anthraquinone. Chrysophanol deriva-
tives could be readily differentiated by the [MÀH]À ion at m/z 253.05, and ion at m/z 225.05 with further loss of a molecule of
CO. Rhein derivatives could be distinguished by the [MÀH]À ion at m/z 283.02 and ion at m/z 239.03 which was generated from
loss of a neutral molecule CO
2
. Physcion could be differentiated by the ions at m/z 283.06 and m/z 240.04, referring [MÀH]À and
[MÀHÀC
2
H
3
O]À. Emodin and aloe-emodin were isomers, both owning the [MÀH]À ions at m/z 269.04. Their derivatives could
be differentiated by the MS2 spectra, as m/z 225.05 for emodin only due to continuous loss of CO and a hydroxyl group. It is
worth not- ing that the fragmentation pattern of aloe-emodin derivatives was different from others when there was a substituent
attached to C-3. Ion at m/z 268.04 was observed as the base peak, as shown in Fig. 4. Except for anthraquinones, several
anthranones were con- tained in rhubarb. Anthranone could be further divided into two types, anthranone and dianthrone,
according to molecular size. The molecular weight of anthranone was less than 610 Da, while dianthrone was more than that.
Ions at m/z 386.10 and 224.04 were two diagnostic ions of anthranone. As shown in Fig. S3, sen- noside A gave the [MÀH]Àion
at m/z 861.19, which first produced ions at m/z 699.13 and 537.08 by successive losses of terminal glucose unit. Ion at m/z
699.13 further generated ion at m/z 655.15 due to the elimination of a carboxyl group, followed by
Y. Liu et al. / Food Chemistry 192 (2016) 531–540 537
Fig. 3. ROCs for 5-fold cross validation. No statistical differences in AUC values were found among five rounds validations (P >
0.05).
the cleavage of C-10 and C-100 and loss of a terminal glucose unit forming ions at m/z 386.10 and 224.05.
Five aglycones of stilbenes had been reported from rhubarb so far, including resveratrol, piceatannol, rhapontigenin,
isorhaponti- genin and deoxyrhapontigenin. Due to the limitation of reference substance, only diagnostic ion of resveratrol and
rhapontigenin were identified to rapid classify. Resveratrol and rhapontigenin could be classified into two groups based on
fragment ion at m/z 227.07, the [MÀH]À ion of 3,5,40-trihydroxy-stilbene. If ion at m/z 255.06, two hydrogen atoms lost from
rhapontigenin in the MS2 spectra, the compounds could be termed as rhapontigenin. If not, the compounds could be identified as
resveratrol with ions at m/z 185.06 and/or 143.05. In the (À)MS scan of resveratrol-40-Ob-
D
-glucopyranoside, the [MÀH]À ion was observed at m/z 389.12, which was selected as the precursor ion in
the subsequent MS2 experiment to give fragmentation informa- tion. As presented in Fig. S4, MS2 produced fragment ion at m/z
227.07 by typical loss of the terminal glucose unit, which was observed as the base peak. The successive losses of C
2
H
2
O from m/z 227.07 generated ions at m/z 185.06 and 143.05.
Phenyl butanone could be identified based on [MÀH]À ion of 4-(40-hydroxyphenyl)-2-butanone at m/z 163.07 and/or
[MÀH]À-164. If ion at m/z 169.01 was observed, the compounds could be termed as containing a galloyl group. The presence of
cou- maroyl group was characterized by the abundant ions at m/z 163.04 and/or 119.05. Similarly, ions at m/z 147.04 and/or
103.05 could be easily observed when there was a cinnamoyl group. Since 4-(40-hydroxyphenyl)-2-butanone, the mother nucleus
of phenylbutanone, was structurally unstable, sometimes the [MÀH]À ion of 4-(40-hydroxyphenyl)-2-butanone at m/z 163.07
could not be found in MS2 spectrum. However, the [MÀH]À-164 ion of phenyl butanone was easily observed. These compounds
usually obtained a variety of substituents including galloyl group,
coumaroyl group and cinnamoyl group, which owned information-rich fragmentation and were easily recognized. As shown in
Fig. S5, 4-(40-hydroxyphenyl)-2-butanone-40-Ob-
D
-(200- O-galloyl-600-Ob- coumaroyl)-glucopyranoside
presented the [MÀH]À ion at m/z 623.18. The loss of 4-(40-hydroxyphenyl)-2-bu tanone molecule from the [MÀH]À ion formed
ion at m/z 459.09, which showed two fragmentation pathways. Loss of coumaroyl group from m/z 459.09 generated ion at m/z
295.05, which further produced ions at m/z 169.01 and 125.02 by losing a glucose unit and a molecule of CO
2
. Similarly, ions at m/z 289.07, 163.04 and 119.05 were observed owing to continued losses of molecules
of coumaroyl group, glucose unit and CO
2
. By searching characteristic fragment ions and comparing accu- rate retention times,
molecular ions, with those of the reference compounds, target compounds of rhubarb extracts could be unam- biguously
identified. For the untargeted compounds, the accurate molecular ions of chromatographic peaks were collected in nega- tive ion
mode. The molecular formula of each peak was calculated and applied to match various chemical data base. After that, the
diagnostic ions were used to filter and differentiate the untargeted compounds.
For example, peak A8 (t
R
= 9.548 min) gave a fragment ion at m/z 283.03, which was in accordance with anthraquinone. Ion
at m/z 239.04 was also observed indicating that the compound was a rhein derivative. The presence of product ions at m/z 169.01
and 125.02 suggested that there was a galloyl group. Another pro- duct ion at m/z 313.06 was also observed corresponding to a
galloyl glucose residue. With the addition of reference, peak A8 was tenta- tively identified as rhein-8-Ob-
D
-(60-O-galloyl)-glucoside. Peak S13 (t
R
=10.801min) obtained the [MÀH]À ion at m/z 541.13. Product ion at m/z 227.07 indicated the compound belonged to
stilbene. Fragments at m/z 185.06 and 143.05 were found instead of m/z 255.05, suggesting it was a resveratrol. In addition, ions
at m/z 169.01, 125.02 indicated the presence of galloyl group. Therefore, peak S13 was assigned as resveratrol-40-Ob-
D
- (200-O-galloyl)-glucopyranoside. Peak P10 (t
R
 = 16.025 min) gave the [MÀH]À ion at m/z 607.18. Fragments at m/z 433.10
([MÀH]À-164) and 163.07 indicated the compound belonged to phenyl butanone. Furthermore, ions at m/z 313.06, 169.01,
538 Y. Liu et al. / Food Chemistry 192 (2016) 531–540
Fig. 4. A diagram for rapid classification and identification of different constituents in R. palmatum L. by LC–QTOF-MS.
125.02 indicated the presence of galloyl group and ions at m/z 295.05, 147.05, 103.06 showed the presence of cinnamoyl group.
With the addition of reference, peak P10 was tentatively identified as 4-(40-hydroxyphenyl)-2-butanone-40-Ob-
D
-(200-O-galloyl-600- Op-cinnamoyl)- glucopyranoside.
3.6. Difference of raw and processed rhubarb
By comparing the diagnostic ions with available standards, 73 marker compounds filtered from raw materials and two
processed ones were quickly classified into anthraquinones (27), stilbenes (16), phenylbutanones (11) and other compounds (19)
(as shown in Table 1). Ten key characteristic compounds accounted primarily for the difference between the raw and processed
rhubarbs screened by PLS were identified as rhein-8-Ob-
D
- glucopyranoside (A1), resveratrol-3-Ob-
D
-glucopyranoside (S1), resveratrol-40-Ob-
D
-(600-O- galloyl)-glucopyranoside (S9), isolind- leyin (P4), 4-(40-hydroxyphenyl)-2-butanone-40-Ob-
D
-(600-Op-co- umaroyl)-glucopyranoside (P7), four stilbene (S2, S3, S5
and S8) and one phenylbutanone (P11).
Two processed materials, including steamed pieces and char- ring pieces were tested and compared with raw materials.
Processing by steaming and charring can affect the chemical profile of rhubarb compound and change its bioactivities. As shown
in Fig. 5, the chemical composition of steamed and charring pieces is considerably different from its untreated counterparts. 66
mar- ker compounds were identified in 10 batches of raw materials at most, 47 in steamed pieces and 22 in charring pieces. After
pro- cessing, components in decoction pieces had decreased a lot, espe- cially in charring pieces. For anthraquinone, there were
24 in 10 batches of raw materials averagely, 15 in steamed pieces and 5 in charring pieces. During the process of heating,
anthraquinone glycosides would decompose into aglycones and glucoses. The higher the temperature, the more anthraquinone
glycosides decomposed. Considering charring of rhubarb, part of compounds would break down resulting in fewer compounds
observed in char- ring pieces. For stilbenes, there were 15 in 10 batches of raw mate- rials averagely, 7 in steamed pieces and 2 in
charring pieces. The situation was similar to anthraquinone. Phenylbutanone was
different. Glycosides usually present in the form of terminal glu- cose units in the anthraquinone glycosides and stilbene
glycosides while glucose molecule showed multiple substituents in the phenylbutanone glycosides. There were 9
phenylbutanones in 10 batches of raw materials averagely, 7 in steamed pieces and 9 in charring pieces suggesting that inside
part of charring pieces may not be charred completely in accordance with the demand for carbonizing process.
4. Conclusions
Processing to suit their different pharmacological effects and clinical applications is the characteristic of herbal materials.
Hence, authentication of decoction pieces is important to ensure their safety and efficacy. In this study, metabolite profiling and
diag- nostic ion filtering strategy with LC–QTOF-MS followed by MFE, PLS–SVM analysis was developed for rapid
identification of raw and processed pieces. The comprehensive and unbiased informa- tion of 30 batches of R. palmatum L. were
given by metabolomic pro- files. Using MFE algorithm, automated compound extraction, data mining and processing, the
characteristic markers in complex mix- tures were extracted in minutes, much faster than manual analysis that would spend
weeks. A total of 73 statistically different compo- nents were obtained by the strategy without time consuming. PLS– SVM-based
pattern recognition for classification of raw materials and processed ones showed good sensitivity, specificity and predic- tion
performance. Using diagnostic ion filtering, marker compounds were identified rapidly, of which 66, 47 and 22 were identified in
raw materials, steamed pieces and charring pieces at most, respec- tively. Among these compounds, rhein-8-Ob-
D
-glucopyranoside (A1), resveratrol-3-Ob-
D
-glucopyranoside (S1), resveratrol- 40-Ob-
D
-(600-O- galloyl)-glucopyranoside (S9), Isolindleyin (P4), 4-(40-hydroxyphenyl)-2-butanone-40-Ob-
D
- (600-Op-coumaroyl)- glucopyranoside (P7), and other four stilbenes (S2, S3, S5
and S8) and one phenylbutanone (P11) accounted primarily for the differ- ence between raw and processed materials, which is
important for quality control of decoction pieces. This strategy was proved to be a powerful tool for the classification of diverse
processed herbal materials. Further studies will be conducted to compare the pharmacological activities of these processed
rhubarb pieces in our laboratory.
Y. Liu et al. / Food Chemistry 192 (2016) 531–540 539
Fig. 5. Line graph of the different constituents of the marker compounds from raw materials and two processed pieces of Rheum
palmatum L. RP stands for raw materials; SP stands for steamed pieces; CP stands for charring pieces. A stands for
anthraquinone; S stands for stilbene; P stands for phenylbutanone; O stands for others.
Acknowledgement
This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 30730111, 81274087 and
81403107).
Appendix A. Supplementary data
Chemical structures of the 23 standards of reference; The typi- cal total ion chromatograms of steamed pieces and charring
pieces; (À)ESI-MS/MS mass spectra of three compounds and their pro- posed fragmentation pathways; Tables listing the
characteristics of proposed method and literature reported method, median of weighted values of 73 variables and the
performance of raw and processed pieces of R. palmatum L. classifiers for 5-fold cross-validations on different independent test
datasets.
Supplementary data associated with this article can be found, in the online version, at
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015. 07.013.
References
Baldi, P., Brunak, S., Chauvin, Y., Andersen, CAF, & Nielsen, H. (2000). Assessing the accuracy of prediction algorithms for
classification: An overview. Bioinformatics, 16, 412–424. Boulesteix, AL, & Strimmer, K. (2007). Partial least squares: A
versatile tool for the analysis of high-dimensional genomic data. Briefings in Bioinformatics, 8, 32–44. Chan, ECY, Yap, SL,
Lau, AJ, Leow, PC, Toh, DF, & Koh, HL (2007). Ultra- performance liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry
based metabolomics of raw and steamed Panax notoginseng. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 21, 519–528. Chen,
YJ, Liang, ZT, Zhu, Y., Xie, GY, Tian, M., Zhao, ZZ, et al. (2014). Tissue- specific metabolites profiling and quantitative
analyses of flavonoids in the rhizome of Belamcanda chinensis by combining laser-microdissection with UHPLC-Q/TOF-MS
and UHPLC-QqQ-MS. Talanta, 130, 589–597. Chen, JL, Ma, MM, Lu, YW, Wang, LS, Wu, CT, & Duan, HF (2009).
Rhaponticin from Rhubarb Rhizomes alleviates liver steatosis and improves blood glucose and lipid profiles in KK/Ay diabetic
mice. Planta Medica, 75, 472–477. Chen, R., Mias, GI, Li-Pook-Than, J., Jiang, LH, Lam, HYK, Chen, R., et al. (2012). Personal
omics profiling reveals dynamic molecular and medical phenotypes. Cell, 148, 1293–1307. Chen, L., Xuan, J., Riggins, RB,
Clarke, R., & Wang, Y. (2011). Identifying cancer biomarkers by network-constrained support vector machines. BMC Systems
Biology, 5, 161. Cheng, XL, Liu, Q., Peng, YB, Qi, LW, & Li, P. (2011). Steamed ginger (Zingiber officinale): Changed
chemical profile and increased anticancer potential. Food Chemistry, 129, 1785–1792. Cheng, YT, Wu, CH, Ho, CY, & Yen, GC
(2013). Catechin protects against ketoprofen-induced oxidative damage of the gastric mucosa by up-regulating Nrf2 in vitro and
in vivo. The Journal of Nutritional Biochemistry, 24, 475–483. Cortes, C., & Vapnik, VN (1995). Support-vector networks.
Machine Learning, 20,
273–297. Dunn, WB, & Ellis, DI (2005). Metabolomics: Current analytical platforms and
methodologies. Trends in Analytical Chemistry, 24, 285–294. Huang, Q., Lu, GD, Shen, HM, Chung, MCM, & Ong, CN
(2007). Anti-cancer properties of anthraquinones from rhubarb. Medicinal Research Review, 27, 609–630. Jelassi, B., Anchelin,
M., Chamouton, J., Cayuela, ML, Clarysse, L., Li, JY, et al. (2013). Anthraquinone emodin inhibits human cancer cell
invasiveness by antagonizing P2X7 receptors. Carcinogenesis, 34, 1487–1496. Jiang, FN, He, HC, Zhang, YQ, Yang, DL,
Huang, JH, Zhu, YX, et al. (2013). An Integrative proteomics and interaction network-based classifier for prostate cancer
diagnosis. PLoS One, 8, e63941. Kashiwada, Y., Nonaka, G., & Nishioka, I. (1984). Studies on Rhubarb (Rhei Rhizoma). VI.
Isolation and Characterization of Stilbenes. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 32, 3501–3517. Kashiwada, Y., Nonaka, GI, &
Nishioka, I. (1986). Tannins and related compounds. XLVII Rhubarb. 6 Isolation and characterization of new p-
hydroxyphenylbutanones, stilbenes and gallic acid glucosides. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 34, 3237–3243. Konieczk,
P., & Namiesnik, J. (2010). Estimating uncertainty in analytical procedures based on chromatographic techniques. Journal of
Chromatography A, 1217, 882–891. Li, W., Pan, XL, & Sweet, DH (2013). The anthraquinone drug rhein potently interferes with
organic anion transporter-mediated renal elimination. Biochemical Pharmacology, 86, 991–996. Li, L., Zhang, C., Xiao, YQ, Lin,
N., Liu, CF, Liu, LG, et al. (2009). Change laws of chemical constituents of 5 kinds of Dahuang (Radix et Rhizoma Rhei)
540 Y. Liu et al. / Food Chemistry 192 (2016) 531–540
decoction pieces. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine, 32, 839–841. Liu, PZ, Lindstedt, A.,
Markkinen, N., Sinkkonen, J., Suomela, JP, & Yang, BR (2014). Characterization of metabolite profiles of leaves of bilberry
(Vaccinium myrtillus L.) and lingonberry (Vaccinium vitis-idaea L.). Journal of Agriculture and Food Chemistry, 62, 12015–
12026. Ni, YN, Song, RM, & Kokot, S. (2012). Analysis of HPLC fingerprints: Discrimination of raw and processed Rhubarb
samples with the aid of chemometrics. Analytical Methods, 4, 171–176. Nonaka, G., Minami, M., & Nishioka, I. (1977). Studies
on rhubarb (Rhei rhizoma). AKU AKU AKU.
Stilbene glycosides. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 25, 2300–2305. Nonaka, G., Nishioka, I., Nagasawa, T., & Oura, H.
(1981). Tannins and Related Compounds. I. Rhubarb (1). Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 29, 2862–2870. Okabe, H.,
Matsuo, K., & Nishioka, I. (1973). Studies on Rhubarb (Rhei Rhizoma). II. Anthraquinone Glycosides. Chemical &
Pharmaceutical Bulletin, 21, 1254–1260. Pharmaceutical and Food Safety Bureau (2006). Japanese Pharmacopoeia. Tokyo:
Ministry of Health, Labour and Welfare. Qi, LW, Wang, CZ, & Yuan, CS (2010). American ginseng: Potential structure–
function relationship in cancer chemoprevention. Biochemical Pharmacology, 80, 947–954. Qin, Y., Wang, JB, Kong, WJ, Zhao,
YL, Yang, HY, Dai, CM, et al. (2011). The diarrhoeogenic and antidiarrhoeal bidirectional effects of rhubarb and its potential
mechanism. Journal of Ethnopharmacology, 133, 1096–1102. Suboj, P., Babykutty, S., Gopi, DRV, Nair, RS, Srinivas, P., &
Gopala, S. (2012). Aloe emodin inhibits colon cancer cell migration/angiogenesis by downregulating MMP-2/9, RhoB and
VEGF via reduced DNA binding activity of NF-jB. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 45, 581–591. Szterk, A.,
Roszko, M., & Cybulski, A. (2012). Determination of azaarenes in oils using the LC-APCI-MS/MS technique: New
environmental toxicant in food oils. Journal of Separation Science, 35, 2858–2865.
Szterk, A., Roszko, M., Małek, K., Czerwonka, M., & Waszkiewicz-Robak, B. (2012). Application of the SPE reversed phase
HPLC/MS technique to determine vitamin B12 bio-active forms in beef. Meat Science, 91, 408–413. Szterk, A., Roszko, M.,
Małek, K., Kurek, M., Zbiec, M., & Waszkiewicz-Robak, B. (2012). Profiles and concentrations of heterocyclic aromatic amines
formed in beef during various heat treatments depend on the time of ripening and muscle type. Meat Science, 92, 587–595. The
State Pharmacopoeia Committee of People's Republic of China (2010). Pharmacopoeia of People's Republic of China (Vol. 1).
Beijing: China Medical Science Press. The United States Pharmacopeial Convention (2010). The United States
Pharmacopoeia, dietary supplements chapter. Baltimore: United Book Press Inc. Wagner, S., Scholz, K., Sieber, M., Kellert,
M., & Voelkel, W. (2007). Tools in metabolomics: An integrated validation approach for LC–MS metabolic profiling of
mercapturic acids in human urine. Analytical Chemistry, 79, 2918–2926. Wang, JB, Qin, Y., Kong, WJ, Wang, ZW, Zeng, LN,
Fang, F., et al. (2011). Identification of the antidiarrhoeal components in official rhubarb using liquid chromatography-tandem
mass spectrometry. Food Chemistry, 129, 1737–1743. Wang, ZH, Wang, DM, Zheng, SH, Wu, LB, Huang, LF, & Chen, SL
(2014). Ultra-performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry with multivariate statistical
analysis for exploring potential chemical markers to distinguish between raw and processed Rheum palmatum. BMC
Complementary and Alternative Medicine, 14, 302–309. Ye, M., Han, J., Chen, HB, Zheng, JH, & Guo, DA (2007). Analysis of
phenolic compounds in rhubarbs using liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry. Journal of
the American Society for Mass Spectrometry, 18, 82–91.