PETUNJUK PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

Oleh :
Prof. Drs. Agus Irianto, MSc.,PhD
Dra. Dini Ryandini, M.Si

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

FAKULTAS ILMU-ILMU KESEHATAN
JURUSAN FARMASI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
2017

0
 KATA PENGANTAR

Buku/Diktat petunjuk praktikum Mikrobiologi ini disusun dengan maksud dan

tujuan membantu mahasiswa dalam melaksanakan praktikum Mikrobiologi di Jurusan
Farmasi. Keahlian dan keterampilan kerja di laboratorium sangat membantu dalam
memahami teori yang telah diperoleh di kuliah sehingga dapat tercipta korelasi yang
saling membangun antara teori dengan kenyataan.
Diktat praktikum ini disusun rinci dan sistematis, dilengkapi dengan gambar
sehingga memudahkan praktikan memahami dan mempersiapkan diri sebelum
melakukan kegiatan praktikum. Materi yang disajikan dalam diktat ini mencakup teknik
dasar yang lazim dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi pada umumnya.
Harapan kami, buku ini dapat bermanfaat bagi praktikan Mikrobiologi di Jurusan
Farmasi serta bagi mahasiswa yang memerlukannya. Segala kritik dan saran yang bersifat
membangun tentang isi buku ini sangat dihargai demi perbaikan kualitas lebih lanjut.

Purwokerto, Oktober 2016

Tim Penyusun

1
 TATA TERTIB PRAKTIKUM

1. Praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium sebelum memasuki laboratorium

dan dilepas di luar laboratorium.
2. Praktikan wajib memakai sepatu tertutup pada saat praktikum.
3. Praktikan dilarang berbicara yang tidak perlu dan membuat gaduh.
4. Praktikan wajib datang 15 menit sebelum acara praktikum dimulai.
5. Praktikan berambut panjang harus mengikat rambutnya.
6. Praktikan memakai pakaian yang sopan pada saat praktikum (baju berkerah).
7. Praktikan yang datang terlambat dan saat itu mendapati kuis sedang berlangsung,
maka praktikan tersebut diperbolehkan mengikuti praktikum dan wajib mengikuti
inhal kuis di akhir acara.
8. Apabila praktikan datang terlambat disaat praktikum sudah dimulai, praktikan
diwajibkan untuk tidak mengikuti acara praktikum pada hari itu.
9. Praktikan yang memecahkan atau merusak peralatan laboratorium wajib melapor
kepada asisten dan wajib menggantinya dengan kualitas dan merk yang sama.
10. Dilarang keras makan, merokok, dan minum pada saat praktikum.
11. Dilarang keras mengoperasikan handphone pada saat praktikum, kecuali untuk
kepentingan praktikum.
12. Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa di sembarang
tempat.
13. Laporkan segera kepada asisten jika terjadi kecelakaan seperti kebakaran dan biakan
tumpah.
14. Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan.
15. Laporan praktikum dikumpulkan selambat-lambatnya satu minggu setelah
pengamatan acara praktikum sebagai syarat masuk pengamatan acara praktikum
selanjutnya.
16. Kuis akan dilaksanakan pada awal acara sebelum memulai praktikum untuk
mengetahui sejauh mana kompetensi yang dicapai.
17. Inhal kuis akan diadakan satu kali. Apabila nilai inhal diatas nilai batas inhal maka
yang diambil nilai batas inhal dan apabila nilai inhal dibawah nilai awal maka yang
diambil adalah niai terbaik (batas inhal = 66).
18. Bagi praktikan yang akan berpindah jadwal praktikum harus seizin koordinator
praktikum mikrobiologi farmasi dengan menyerahkan surat izin dengan alasan yang
dapat dipertanggungjawabkan.
19. Aturan-aturan atau tata tertib yang belum tercantum akan diputuskan kemudian.

2
 DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR ……….……………………………………………….... 1
TATA TERTIB PRAKTIKUM .……………………………………………...... 2
DAFTAR ISI ………………………………………………………………....... 3
MATERI PRAKTIKUM :
I. Pengenalan Alat, Pembuatan Media Pertumbuhan, dan Sterilisasi............. 4
II. Isolasi dan Karakterisasi Morfologi Mikroorganisme ................................ 20
III. Uji Biokimiawi Mikroorganisme ................................................................ 31
IV. Daya Kerja Zat Antimikroba ...................................................................... 35
V. Uji Mikrobiologi Produk ............................................................................ 41

3
 I. PENGENALAN ALAT, MEDIA PERTUMBUHAN, DAN
STERILISASI

1.1 Pengenalan Alat

Kompetensi : mahasiswa mengenal dan mengetahui alat-alat yang lazim digunakan dalam
kerja mikrobiologi dan fungsinya.

Berikut daftar alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal :

Alat-alat elektrik Alat-alat gelas dan Alat-alat non gelas

keramik
Mikroskop cahaya Cawan Petri Jarum inokulum / ose
Autoklaf elektrik Pipet ukur Pinset
Incubator dan oven Tabung reaksi Mikropipet
Hot plate & stirrer Labu Erlenmeyer Rak tabung
Colony counter Beaker glass Filler
Biological Safety Cabinet Pembakar spirtus
pH meter Gelas ukur
Batang L / Drugalsky
Tabung Durham
Mortar & pestle

Berikut fungsi alat-alat tersebut diatas:

 Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope)
Salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme adalah mikroskop cahaya. Dengan
mikroskop kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata
telanjang. Pada umumnya mata tidak mampu membedakan benda dengan diameter lebih
kecil dari 0,1 mm. Berikut merupakan uraian tentang cara penggunaan bagian-bagiandan
spesifikasi mikroskop cahaya merk Olympus CH20 yang dimiliki Laboratorium
Mikrobiologi.

Bagian-bagian Mikroskop:
1. Eyepiece / oculars (lensa okuler)
Untuk memperbesar bayangan yang dibentuk lensa objektif
2. Revolving nosepiece (pemutar lensa objektif)
Untuk memutar lensa objektif sehingga mengubah
perbesaran
3. Observation tube (tabung pengamatan / tabung okuler)
4. Stage (meja benda)
Tempat untuk meletakan spesimen
5. Condenser (condenser)
Untuk mengumpulkan cahaya supaya tertuju ke lensa
objektif

4
 6. Objective lense (lensa objektif)
Memperbesar kenampakan spesimen
7. Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu)
Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu
8. Main switch (tombol on-off)
9. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter)
Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri
10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar)
11. Specimen holder (penjepit spesimen)
12. Illuminator (sumber cahaya)
13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal)
Untuk menaikkan atau menurunkan object glass
14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal)
Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas
15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar)
Menaikturunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat
16. Fine focus knob (sekrup fokus halus)
Menaikturunkan meja benda secara halus dan lambat
17. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler)
18. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser)
Untuk menaikturunkan condenser.

Prosedur Operasi
1. Menyalakan lampu
a. tekan tombol on (8)
b. atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7)
2. Menempatkan spesimen pada meja benda
a. letakkan object glass di atas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11). Jika meja
benda belum turun, diturunkan dengan sekrup kasar (15)
b. cari bagian dari object glass yang terdapat preparat ulas (dicari gambar yang jelas)
dengan memutar sekrup vertikal dan horizontal (13) dan (14)
3. Memfokuskan
a. putar revolving nosepiece (2) pada perbesaran objectif 4x lalu putar sekrup kasar (15)
sehingga meja benda bergerak ke atas untuk mencari fokus
b. setelah fokus perbesaran 4x10 didapatkan, maka putar (2) pada perbesaran
selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x. Kemudian putar sekrup halus (16) untuk
mendapatkan fokusnya
c. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih besar

Berikut adalah tabel yang menunjukkan jarak antara spesimen dengan lensa
objektif jika fokus telah didapatkan :
Perbesaran objektif 4x 10x 40x 60x

5
 Jarak A (mm) 29 6,3 0,53 0,29

Catatan : setelah mendapatkan fokus pada perbesaran tertentu, misal 40x, dan ingin
memutar objektif ke perbesaran 100x, maka meja benda tidak perlu diturunkan dan tidak
perlu khawatir bahwa lensa akan menggesek cover glass karena terdapat sisa jarak A yang
lebih kecil antara cover glass dengan lensa objektif.
a. jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10) dapat digeser, hal ini akan
mengubah dua bayangan yang akan diterima oleh 2 mata menjadi gambar yang
tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi kelelahan mata
b. jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur untuk memperoleh bayangan fokus
yang seimbang antara mata kanan dan kiri
c. pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan yang tampak dengan
mensetting pada posisi tertinggi (cahaya penuh)

Perbesaran Total
Ukuran spesimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan perbesaran
lensa okuler dengan lensa objektif. Misal = Okuler (10x) x Objektif (40x) = 400x

Penggunaan minyak imersi

Semakin kecil nilai daya pisah akan semakin kuat kemampuan lensa untuk
memisahkan dua titik yang berdekatan pada preparat sehingga struktur benda terlihat
lebih jelas. Daya pisah dapat diperkuat dengan membesarkan indeks bias atau
menggunakan cahaya yang memiliki panjang gelombang pendek. Biasanya dapat
digunakan minyak imersi untuk meningkatkan indeks bias pada perbesaran 10x100
a. jika fokus pada perbesaran 10x40 telah didapatkan maka putar ke perbesaran
objektif 100x
b. tetesi minyak imersi 1-2 tetes diantara sisi lensa objektif dengan cover glass
c. jika telah selesai menggunakan mikroskop, bersihkan lensa objektif 100x dengan
kertas lensa yang dibasahi xylol

 Autoklaf (Autoclave)
Diagram autoklaf vertical
1. Tombol pengatur waktu mundur (timer)
2. Katup pengeluaran uap
3. Pengukur tekanan
4. Kelep pengaman
5. Tombol on-off
6. Termometer
7. Lempeng sumber panas
8. Aquades (dH2O)
9. Sekrup pengaman
10. Batas penambahan air
Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan
berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap

6
air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm
dan dengan suhu 121°C (250°F). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda
adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang
dilakukan biasanya 15 menit untuk 121°C

Cara penggunaan
1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air
kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tertentu.
Gunakan air hasil destilasi untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.
2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir, maka tutup
botol harus dikendorkan
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan skrup pengaman agar tidak ada uap yang
keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu
4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan minimal 15 menit pada suhu 121°C
5. Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan
terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup
(dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Perhitungan waktu 15 menit dimulai sejak
tekanan mencpai 2atm
6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun
hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge
menunjukkan angka nol). Kemudian skrup pengaman dibuka dan keluarkan isi
autoklaf dengan hati-hati.

 Inkubator (Incubator)
Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram
mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat ini dilengkapi dengan
pengatur suhu dan pengatur waktu. Kisaran suhu untuk inkubator
produksi Heraeus B5042 misalnya adalah 10-70oC..

 Hot plate stirrer

Hot plate stirrer berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan
dengan pengadukan oleh magnetic stirer. Pelat (plate) yang terdapat
pada alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses
homogenisasi. Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan
magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS® misalnya mampu
menghomogenkan sampai 10 L, dengan kecepatan sangat lambat sampai
1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC.

 Colony counter

7
 Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni
mikroba (bakteri) yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam
cawankarena adanya kaca pembesar. Selain itu alat tersebut dilengkapi
dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk pengamatan
pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah koloni pada cawan Petri
dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset.

 Biological Safety Cabinet

Biological Safety Cabinet atau dapat juga disebut Laminar Air
Flow adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis
karena BSC mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran
udara sehingga menjadi steril dan aplikasi sinar UV beberapa
jam sebelum digunakan. Prosedur penggunaan BSC seri 36212.
PurifierTM Biological Safety Cabinet dari LABCONCO yang
dimiliki laboratorium mikrobiologi adalah sebagai berikut:
1. Hidupkan lampu UV selama 2 jam, selanjutnya matikan
segera sebelum memulai bekerja.
2. Pastikan kaca penutup terkunci
dan pada posisi terendah
3. Nyalakan lampu neon dan blower
4. Biarkan selama 5 menit
5. Cuci tangan dan lengan dengan sabun
germisidal/alkohol 70%
6. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 7% atau desinfektan yang cocok
dan biarkan menguap
7. Masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan, jangan terlalu penuh karena akan
memperbesar resiko kontaminasi
8. Atur alat dan bahan yang telah dimasukkan ke BSC sedemikian rupa sehingga
efektif dalam bekerja dan tercipta area yang benar-benar steril
9. Jangan menggunakan pembakar bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi gunakan
yang berbahan bakar gas
10. Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas
kerja
11. Setelah selesai bekerja, biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari
BSC
12. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70% dan biarkan menguap lalu
tangan dibasuh dengan desinfektan
13. Matikan lampu neon dan blower

 Mikropipet (Micropippete) dan Tip

Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil,
biasanya kurang dari 1000 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya
mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara
1µl sampai 20 µl, atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya tersedia satu
8
pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 µl. dalam penggunaannya,
mikropipet memerlukan tip.

Mikropipet tip
Cara Penggunaan :
1. Sebelum digunakan thumb knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan
lancarnya mikropipet
2. Memasukkan tip bersih ke nozzle/ ujung pipet
3. Tekan thumb knob sampai hambatan pertama /first stop, jangan ditekan lebih ke
dalam lagi
4. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4mm
5. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekan dari thumb knob maka
cairan akan masuk ke tip
6. Pindahkan ujung tip ke tempat penampungan yang diinginkan
7. Tekan thumb knob dampai hambatan kedua/second stop atau tekan semaksimal
mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip
8. Jika ingin melepas tip putar thumb knob searah jarum jam dan ditekan maka tip
akan terdorong keluar dengan sendirinya, atau menggunakan alat tambahan yang
berfungsi mendorong tip keluar

 Cawan Petri (Petri Dish)

Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi)
mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan
cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam
berbagai macam ukuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15
cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan
berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml.

 Pipet Ukur (Measuring Pippete)

9
 Pipet ukur merupakan alat untuk memindahkan larutan dengan
volume yang diketahui. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas
pipet ukur, diantaranya pipet berukuran 1 ml, 5 ml dan 10 ml.

 Pipet tetes (Pasteur Pippete)

Fungsinya sama dengan pipet ukur, namun volume yang
dipindahkan tidak diketahui. Salah satu penerapannya adalah dalam
menambahkan HCl / NaOH saat mengatur pH media, penambahan
reagen ada uji biokimia, dll.

 Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)

Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-
uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba.Tabung reaksi dapat
diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa
kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil.

 Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)

Berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan yang. Labu
Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan
komposisi media, menampung akuades, kultivasi mikroba dalam kultur cair, dll.
Terdapat beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya
yaitu 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb.

 Gelas ukur (Graduated Cylinder)

Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer,
gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada saat
mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan
meniskus cekung larutan.

 Batang L (L Rod)
Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar
supaya bakteri yang tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Alat
ini juga disebut spreader.

 Mortar dan Pestle

Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan untuk menumbuk atau
menghancurkan materi cuplikan, misal daging, roti atau tanah sebelum
diproses lebih lanjut.

10
 Beaker Glass
Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Di dalam
mikrobiologi, dapat digunakan untuk preparasi media media, menampung akuades
dll..

 Pembakar Bunsen
Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar
bunsen. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari
bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran tersebut. Untuk
sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya
adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas). Perubahan Bunsen dapat
menggunakan bahan baker gas atau methanol.

 Glass beads
Glass beads adalah manik-manik gelas kecil yang digunakan untuk meratakan
suspensi biakan dengan menyebarkan beberapa butir di atas permukaan agar dan
digoyang merata. Glass beads digunakan pada teknik spread plate yang fungsinya sama
dengan batang L atau Spreader

 Tabung Durham
Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya lebih kecil
dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas yang terbentuk akibat metabolisme pada
bakteri yang diujikan. Penempatannya terbalik dalam tabung reaksi dan harus terendam
sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara).

 Jarum Inokulum
Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk
ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat
dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena
panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut
ose atau inoculating loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut
inoculating needle/Transfer needle. Inoculating loop cocok untuk
melakukan streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle
cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab
inoculating). Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat membelah
agar untuk preprasi Heinrich’s Slide Culture.

 Pinset
Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk mengambil
benda dengan menjepit misalnya saat memindahkan cakram antibiotik.

11
 Pipet Filler / Bulb
Filler adalah alat untuk menyedot larutan yang dapat dipasang pada
pangkal pipet ukur. Karet sebagai bahan filler merupakan karet yang
resisten bahan kimia. Filler memiliki 3 saluran yang masing-masing
saluran memiliki katup. Katup yang bersimbol A (aspirate) berguna untuk
mengeluarkan udara dari gelembung. S (suction) merupakan katup yang
jika ditekan maka cairan dari ujung pipet akan tersedot ke atas. Kemudian
katup E (exhaust) berfungsi untuk mengeluarkan cairan dari pipet ukur.
 pH meter
Berguna untuk mengukur atau mengetahui pH suatu larutan. Hal ini sangat penting
dalam pembuatan media karena pH pada media berpengaruh terhadap pertumbuhan
mikroba. Kertas ph indicator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian
strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan.

1.2 Pembuatan Media Pertumbuhan

Kompetensi : Mahasiswa mengetahui cara pembuatan media pertumbuhan dan
memahami manfaat media pertumbuhan mikroorganisme

Medium pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari

campuran zat-zat makanan (nutrien) yang diperlukan oleh mikroorganisme untuk
pertumbuhannya. Dengan menggunakan medium pertumbuhan, dapat dipelajari aktivitas
mikroorganisme dari perubahan yang terjadi pada medium dan dapat dilakukan isolasi
mikroorganisme menjadi kultur murni.
Bahan-bahan untuk pembuatan medium dapat berupa bahan yang siap pakai dan
bahan asli atau alami. Pada dasarnya, bahan-bahan untuk pembuatan medium dapat
dikelompokkan menjadi 3 kelompok, yaitu:
1. Bahan dasar
a. Air
b. Agar (dari Alga) yang bersifat tidak dapat diurai oleh mikroorganisme,
membeku pada suhu 15-20 ºC dan mencair pada suhu relatif rendah (45 ºC)
c. Gelatin yaitu protein yang dapat diurai oleh mikroorganisme dan sifatnya
seperti agar
d. Silika gel yaitu bahan yang mengandung Natrium silikat khusus untuk
menumbuhkan mikroorganisme yang bersifat autotrof obligat.
2. Unsur-unsur zat makanan
a. Sumber karbon dan energi yang meliputi karbohidrat, lemak dan asam-asam
organik
b. Sumber nitrogen yang meliputi protein, pepton
c. Garam-garam mineral dari K, Na, Fe, dan Mg
d. Vitamin-vitamin.
e. Sari buah, ekstrak sayuran, susu
3. Bahan tambahan, yaitu bahan yang sengaja ditambahkan ke dalam medium dengan
tujuan tertentu. Sebagai contoh adalah indikator dan antibiotik.

12
Macam-macam medium:
Banyak macam medium yang dipergunakan untuk menumbuhkan
mikroorganisme, meskipun demikian pada dasarnya medium dibedakan berdasarkan
kriteria tertentu seperti : fase (sifat fisik), komposisi, fungsi, dan bentuknya.
1. Medium berdasarkan fase (sifat fisik)
a. Medium padat, yaitu medium yang mengandung agar 12-15 gram per liter air
(satu resep medium), contoh: media Nutrient Agar (NA), Glucose Agar (GA).
b. Medium setengah padat atau semi solid, yaitu medium yang mengandung agar
kurang dari 0,5 % per liter air
c. Medium cair, yaitu medium yang tidak mengandung agar, contoh media
Nutrient Broth (NB), , Lactose Broth (LB).
2. Medium berdasarkan komposisi
a. Medium sintetis, yaitu medium yang komposisi kimianya diketahui secara
pasti, Contoh medium GA.
b. Medium semi sintesis, yaitu medium yang sebagian komposisi kimianya
diketahui, Contoh medium Potato Dextrose Agar (PDA).
c. Medium non-sintetis, yaitu medium yang komposisi kimianya tidak
diketahuoi secara pasti. Contoh medium alami seperti kaldu daging sapi,
ekstrak wortel.
3. Medium berdasarkan fungsi
a. Medium umum, yaitu medium yang dapat untuk menumbuhkan banyak jenis
mikroorganisme. Contoh medium Plate Count Agar (PCA)
b. Medium selektif, yaitu medium yang di dalamnya ditambahkan zat tertentu
maka bersifat selektif bagi pertumbuhan mikroorganisme tertentu dan tidak
bagi yang lain. Contoh medium yang diberi kristal ungu unutk merangsang
pertumbuhan bakteri Gram negatif, sedangkan bakteri Gram positif
terhambat.
c. Medium diferensial yaitu medium yang mengandung senyawa yang akan
menyebabkan pertumbuhan mikroorganisme tertentu pada medium dapat
dibedakan dari pertumbuhan mikroorganisme lain. Contoh adalah medium
yang ditambah indikator warna dalam suasana asam akibat aktivitas
mikroorganisme yang ditumbuhkan pada mediun.
d. Medium uji (Assay- medium) yaitu medium dengan komposisi tertentu untuk
mengetahui atau menguji adanya zat tertentu didalam medium itu misal
adanya vitamin, antibiotik atau yang lain, dengan mengunakan
mikroorganisme.
e. Medium diperkaya yaitu medium yang mengandung komponen sangat
komplek seperti darah, serum, kuning telur untuk menumbuhkan
mikroorganisme yang bersifat heterotrof. Contoh adalah Loefller-serum
untuk menumbuhkan basil difteri.

Cara Kerja
1. Pembuatan Mannitol Salt Agar

13
 a. Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk
volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
 Lab Lemco Powder 1 g
 Peptone 10 g
 Mannitol 10 g
 Sodium Chloride 75 g
 Phenol Red 0,0025 g
 Agar 15 g
 Akuades s.d 1000 ml
b. Akuades sebanyak 1000 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk melarutkan Lab
lemco powder, peptone, mannitol, sodium chloride, dan phenol red dan sebagian
lagi untuk melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak
c. Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan
diberi panas. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan
sampai overheat, karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah).
d. Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan Lab lemco powder,
peptone, mannitol, sodium chloride, dan phenol red, cukup dengan pengadukan.
e. Setelah keduanya larut, larutan dicampur hingga homogen. Kemudian pH media
diukur menggunakan pH meter. Nilai pH media diatur hingga 7,4 ± 0,2. Jika pH
tidak sesuai maka dapat ditambahkan HCl/NaOH.
f. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi dan
disterilisasi dengan autoklaf.
g. Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika diinginkan media
tegak atau miring pada point ke 6, media langsung dituang ke tabung kemudian
disterilisasi.

2. Pembuatan Nutrient Agar

a. Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan
analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi
berikut:
- Beef extract 3g
- Peptone 5g
- Agar 15 g
- Akuades s.d 1000 ml
b. Akuades sebanyak 1000 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk
melarutkan Beef extract dan peptone dan sebagian lagi untuk
melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak.

14
 c. Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan
diberi panas. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate
stirrer (jangan sampai overheat, karena akan terbentuk busa dan
memuai sehingga tumpah).
d. Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan
peptone dan beef extract, cukup dengan pengadukan.
e. Setelah keduanya larut, larutan dicampur dan diaduk sampai
homogen. Kemudian pH media diukur dengan pH meter. Nilai pH
media NA diatur hingga 7,4 ± 0,2. Jika pH tidak sesuai maka dapat
ditambahkan HCl/NaOH.
f. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan
disterilisasi dengan autoklaf.
g. Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika
diinginkan media tegak atau miring pada point ke 6, media
langsung dituang ke tabung kemudian disterilisasi.

1.3 Sterilisasi
Kompetensi : Mahasiswa mengenal dan mengetahui cara-cara sterilisasi dan prinsip
kerja sterilisasi serta menguasai teknik kerja aseptis.

Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari
semua bentuk kehidupan.

Macam-macam sterilisasi
Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik
dan kimiawi.
1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat
kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan
tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya
larutan enzim dan antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
 Pemanasan
a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung,
contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.
b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas
kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung
reaksi dll.
c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung
air lebih tepat menggunakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.
d. Uap air panas bertekanan : menggunakan autoklaf
 Penyinaran dengan UV
Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk
membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet
dengan disinari lampu UV
15
3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa disinfektan antara lain
alkohol.

Sterilisasi merupakan salah satu satu tahapan penting yang harus dilakukan
selama melaksanakan kerja mikrobiologi. Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan
membebaskan suatu bahan atau benda dari segala bentuk kehidupan. Tergantung dari
bahan atau alat yang akan disteril maka sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara.

1. Sterilisasi secara Mekanik (Filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan khususnya untuk bahan-bahan
cair yang bersifat mudah rusak apabila dipanasi, misalnya ekstrak enzim, serum, toksin
bakteri dan medium tertentu. Banyak jenis saringan atau filter yang dapat digunakan
untuk menyaring bahan-bahan tersebut, akan tetapi yang paling umum digunakan adalah
saringan Berkelfeld, Chamberland, dan Zeitz.

Tujuan : Mendapatkan bahan cair yang komposisinya tidak berubah dan steril
menggunakan saringan.
Bahan-bahan:
1. Ekstrak enzim
2. Bahan medium tertentu dengan senyawa gula, garam fisiologis, natrium
bikarbonat, dll.
Alat-alat:
1. Saringan Zeitz
2. Erlenmeyer yang dapat dipasang pompa vakum
3. Pompa vakum
Prosedur :
1. Erlenmeyer disterilkan menggunakan autoklaf, sebelumnya dibungkus
menggunakan plastik.
2. Pasang membran penyaring yang sudah steril dalam alat penyaring.
3. Pasanglah saringan pada erlenmeyer yang sudah steril.
4. Tuangkan bahan yang akan disaring kedalam saringan dengan hati-hati.
5. Hubungkan erlenmeyer tersebut dengan pompa vakum dan hidupkan pompa
vakum dengan hati-hati.
6. Pindahkan cairan bahan hasil saringan yang ada dalam erlenmeyer kedalam botol
lainnya yang sudah steril secara aseptis, ditutup dengan kapas steril dan
alumunium foil serta simpan botol tersebut pada suhu dingin sebelum digunakan
lebih lanjut.

2. Sterilisasi secara Fisik (Pemanasan atau Penyinaran)

Pemakaian panas untuk sterilisasi paling banyak dipraktekkan. Jenis dan bentuk
alat pemanas yang digunakan berbeda-beda. Adapun jenis sterilisasi menggunakan panas
yang sudah dikenal adalah :
1. Pemijaran
2. Udara panas (Kering)

16
 3. Uap air panas
4. Uap air panas bertekanan
5. Penyinaran sinar ultraviolet (UV)

2.1. Sterilisasi dengan pemijaran

Tujuan : sterilisasi alat-alat laboratorium dari bahan logam menggunakan alat pijar atau
lidah api (pembakar bunsen, lampu spirtus atau yang sejenis).
Bahan-bahan :
1. Jarum ose
2. Jarum inokulasi
3. Jarum spatula
4. Pinset
5. Skalpel
Alat-alat :
1. Pembakar bunsen
2. Lampu spirtus
Prosedur :
1. Jarum seperti tersebut di atas dipegang tangkai dan ujungnya yang umumnya
dibuat dari platina atau nikrom dikenakan pada lidah api sampai membara. Pinset
dan skalpel dikenakan pada lidah api cukup lama tetapi tidak sampai membara.
2. Gunakan alat-alat itu secara langsung akan tetapi setelah dibiarkan dulu untuk
beberapa saat, setelah dingin atau panasnya tidak akan mematikan jasad renik.
Alat- alat itu khususnya jarum inokulasi digunakan untuk memindahkan mikroba.
Biasakan mendinginkan alat-alat itu sampai kira-kira 40-45ºc.

2.2. Sterilisasi dengan panas kering

Tujuan : sterilisasi alat-alat laboratorium dari yang umumnya terbuat dari gelas,
menggunakan alat sterilisasi seperti oven (hot air sterilizer).
Bahan-bahan :
1. Tabung reaksi
2. Cawan petri
3. Gelas piala atau beaker glass
4. Pipet,dll
Alat-alat :
1. Oven
Prosedur :
1. Bungkus alat-alat yang akan disterilkan dengan aluminium foil, letakkan didalam
oven
2. Aturlah pengatur suhu oven untuk mencapai suhu 160-180ºC.
3. Tunggu sampai 2-3 jam.

2.3. Sterilisasi dengan uap air panas

Bahan-bahan berair paling tepat disterilkan dengan menggunakan uap air panas,
karena tidak dapat disterilkan dengan udara panas. Bahan berair apabila disterilkan

17
dengan udara panas akan mengalami perubahan komposisi zat yang ada sehingga tidak
sesuai lagi dengan tujuan penyediaan bahan itu.
Cara sterilisasi semacam itu juga dikenal dengan “tyndalisasi”. Pada prinsipnya
streilisasi itu dilakukan yang mencapai suhu 100ºC. Dibiarkan selama 30 menit dan
diulang 3 kali dengan interval waktu 24 jam.

Tujuan : sterilisasi bahan berair yang tidak tahan panas atau suhu tinggi.
Bahan-bahan :
1. Medium cair
2. Ekstrak buah atau sayur

Alat yang digunakan :

1. Arnold steam sterilizer
2. Dapat digunakan juga dengan alat pengukus nasi atau dandang
Prosedur :
1. Bahan yang akan disteril (dalam botol) diletakkan dalam alat sterilisasi.
2. Panaskan alat sterilisasi sampai termometer menunjukkan 100ºc dan dibiarkan
selama 30 menit.
3. Ambil bahan dari dalam alat sterilisasi dan simpan selama 24 jam pada suhu
kamar, untuk memberi kesempatan spora yang ada pada bahan itu dan masih
hidup menjadi sel vegetatif
4. Sterilisasi bahan yang disimpan itu dengan alat, suhu dan waktu yang sama seperti
nomor (2).
5. Lakukan seperti (3) untuk memberi kesempatan kedua kalinya bagi spora yang
masih hidup.
6. Lakukan seperti (3) dari sterilisasi ketiga kalinya itu bahan sudah bebas dari
semua bentuk kehidupan, termasuk spora yang tahan terhadap suhu tinggi atau
pengaruh lingkungan yang tidak menguntungkan.

2.4. Sterilisasi dengan uap air panas bertekanan

Alat yang dipergunakan untuk sterilisasi cara ini adalah autoklaf. Alat itu berupa
bejana silinder yang dilengkapi dengan pencatat suhu, tekanan dan waktu serta katup-
katup pengaman. Alat semacam itu, amat tepat digunakan untuk sterilisasi medium
pertumbuhan mikroorganisme. Melalui cara sterilisasi semacam itu, mikroorganisme
akan lebih cepat mati karena adanya panas dan tekanan. Bentuk autoklaf bermacam-
macam, tetapi pada dasarnya mempunyai sistem kerja yang sama.

Tujuan: sterilisasi medium pertumbuhan jasad renik menggunakan uap air panas dan
bertekanan.
Bahan-bahan :
1. Medium agar
2. Medium cair
Alat yang digunakan :
1. Autoklaf

18
 2. Kompor gas/listrik
3. Autoklaf listrik
Prosedur :
1. Isikan akuades ke dalam autoklaf sampai di bawah sarangan (dasar tempat
peletakan bahan-bahan).
2. Letakkan medium dalam botol pada sarangan.
3. Perapian dihidupkan.
4. Tutup autoklaf dipasang dengan mengencangkan sekrup-sekrup.
5. Biarkan katup pengeluaran uap tetap terbuka untuk mengeluarkan uap udara
yang masih terbuka yang masih ada dalam autoklaf sampai beberapa saat.
6. Setelah uap banyak keluar dari autoklaf, berarti sudah tidak ada udara di dalam
autoklaf (hanya uap air), katup pengeluaran uap ditutup.
7. Langsungkan sterilisasi dan amati pada alat pencatat suhu dan tekanan pada
autoklaf masing-masing harus 121ºC dan 15 lb/psi (2 atm).
8. Didiamkan selama 15 menit.
9. Setelah 15 menit, matikan kompor dengan hati-hati.
10. Buka autoklaf setelah alat pencatat tekanan menunjukkan angka 0 yang berarti
sudah tidak ada tekanan di dalam autoklaf.

2.5. Sterilisasi dengan penyinaran ultraviolet

Sinar ultraviolet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk
membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior safety cabinet dengan
disinari lampu.
Alat yang digunakan :
1. BSC (Biological Safety Cabinet) atau LAF (Laminar Air Flow)
Prosedur :
1. Hidupkan lampu uv selama 2 jam, selanjutnya matikan segera sebelum memulai
bekerja.
2. Pastikan kaca penutup terkunci dan pada posisi terendah.
3. Nyalakan lampu neon dan blower.
4. Biarkan selama 5 menit.
5. Cuci tangan dan lengan dengan sabun germisidal/alkohol 70%.
6. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 7% atau desinfektan yang cocok
dan biarkan menguap.
7. Masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan, jangan terlalu penuh karena akan
memperbesar resiko kontaminan.
8. Atur alat dan bahan yang telah dimasukkan ke bsc sedemikian rupa sehingga
efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar steril.
9. Jangan menggunakan pembakar bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi gunakan
yang berbahan bakar gas.
10. Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas
kerja.
11. Setelah selesai bekerja, biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari
BSC.

19
 12. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70% dan biarkan menguap lalu
tangan dibasuh dengan desinfektan.
13. Matikan lampu neon dan blower

II. ISOLASI DAN KARAKTERISASI MIKROORGANISME

Kompetensi: mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari kultur campurannya sehingga

didapat kultur murni dan mengkarakterisasi morfologi mikroorganisme

Isolasi Mikroorganisme:
Pengertian
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdapat
dalam campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat
diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi,
sifat dan kemampuan biokimiawinya.

Teknik Pengambilan Sampel

Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel.
Sampel ditempatkan pada wadah yang steril dan pengambilan sampel juga menggunakan
teknik aseptis. Berikut contoh prosedur pengambilan sampel tanah dan air:
1. Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka
cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang
diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat
permukaan hingga ujung perakaran..
2. Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika beerasal
dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan
arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan
dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan
dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.

20
Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril atau air
pepton steril atau larutan NaCl fisiologis steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya
adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam cairan atau larutan
sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada
bentuk sampel :

a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril yang dilembabkan

dengan air, air pepton atau larutan garam fisiologis steril selanjutnya
diusapkan pada permukaan sampel.
b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada
permukaan substrat dengan cara memasukkan sampel misalnya daun bunga
atau potongan daging yang sudah diketahui beratnya ke dalam air dengan
rasio 1 : 9 (w/v).
c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk
dengan mortar dan pestle kemudian dilarutkan ke dalam air dengan rasio 1 :
9 (w/v).

2. Teknik Pengenceran Bertingkat

21
 Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah
mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat
pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan
perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga
pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran
sebelumnya.
Cara Kerja :
Sampel yang mengandung bakteri dimasukkan ke dalam tabung pengenceran
pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis. Perbandingan berat sampel dengan volume tabung
pertama adalah 1 : 9. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya.
Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung
10-2 secara aseptis kemudian dikocok sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga
tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet
ukur yang digunakan harus selalu diganti.

3. Teknik Penanaman
3.1.Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat.
Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk
tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran
terakhir.
3.1.a. Spread Plate (agar tabur ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di
permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan
adalah sebagai berikut :
a. Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur
kemudian teteskan di atas permukaan agar yang telah memadat.
b. Batang L atau batang drugalsky diambil kemudian disterilkan
kemudian digunakan untuk meratakan suspensi pada permukaan
media
c. Batang L dan drugalsky dapat digantikan dengan glass beads.

3.1.b. Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang ke dalam
petri berisi suspensi bakteri kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Adapun
prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut :
a. Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan
media padat yang masih cair (>45oC)

22
 b. Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong
c. Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar
cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media,
kemudian diinkubasi.

3.2. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)

Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau
meremajakan kultur ke dalam medium baru.

3.2.a. Goresan Sinambung

Cara kerja :
a. Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu
sampai setengah permukaan agar.
b. Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan
sampai habis.
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan
koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
3.2.b. Goresan T
Cara kerja :
a. Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker
b. Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag
c. Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan
streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar
untuk memperoleh goresan yang sempurna
d. Lakukan hal yang sama pada daerah 3

3.2.c. Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Cara kerja :
Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda
yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih
mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau
disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-
pisah menjadi koloni tunggal.

Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah

Cara Kerja :
a. Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis
dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8

23
 b. Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada
medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam
c. Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang
relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali
d. Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan
teknik streak kuadran
e. Inkubasi 1x24 jam.

f.

Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :

a. Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80 oC selama 30
menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan
b. Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung
pengenceran bertingkat
c. Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media
PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian diinkubasi pada suhu
ruang 5-7 hari
d. Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,
e. Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.

Karakterisasi Morfologi Bakteri

Bakteri adalah jasad renik uniseluler yang reproduksinya dengan pembelahan
biner serta koloninya mengilap. Bakteri sukar diamati tanpa menggunakan mikroskop

24
perbesaran kuat dan dilakukan pewarnaan preparat sebelum diamati. Bentuk koloni suatu
bakteri yang ditumbuhkan pada medium yang berbeda-beda menunjukkan koloni yang
berbeda pula. Pada umumnya koloni bakteri berupa lender dan mengkilap.

A. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri

Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis
bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan kultur
murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk
dikenali ciri koloninya.

Pertumbuhan Bakteri pada Cawan Petri

Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :
 Ukuran; pinpoint/punctiform (titik)
Small (kecil)
Moderate (sedang)

Large (besar)
 Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen
intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat
terlarut dalam media
 Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni.
Opaque (tidak dapat ditembus cahaya), Translucent (dapat ditembus cahaya
sebagian), Transparant (bening)
Bentuk : Circular Elevasi : Flat

Irregular Raised

Spindle Convex

Filamentous
Umbonate
Rhizoid

 Permukaan : Halus mengkilap

Kasar
Berkerut
Kering seperti bubuk
 Margins :

25
B. Mengamati Morfologi Sel Bakteri
Bentuk sel bakteri juga berbeda-beda, meskipun bentuk umum atau bentuk dasar
ada 3 macam yaitu bulat (kokus), batang (basil), dan lengkung (curve). Dinding sel
bakteri mengandung berbagai senyawa kimia antara lain lipid, asam nukleat, protein. Zat-
zat warna itu akan bereaksi dengan zat warna asam atau basa dengan hasil kenampakan
yang berbeda. Zat warna asam mengandung ion negative dan akan bereaksi dengan zat
bersifat basa dari dinding, sedangkan zat warna zat warna basa mengandung ion positif
dan akan bereaksi dengan zat bersifat asam di dalam dinding sel. Zat yang digunakan
dalam pewarnaan bakteri adalah zat warna basa, zat warna basa antara lain metilen blue,
kristal ungu dan karbol fuksin. Zat warna asam yang kadang-kadang dipakai adalah garam
sodium. Penggunaa satu macam zat warna untuk mewarnai sel bakteri belum cukup
memberikan kejelasan dalam pengamatan, oleh karena itu sering dipergunakan pada lebih
dari satu macam untuk mewarnai satu jenis bakteri.. Kadang-kadang bagian tertentu dari
sel bakteri harus diberi pewarnaan khusus untuk dapat diamati seperti spora, kapsul, dan
flagel.
Sebelum diberi warna, sel bakteri itu perlu difiksasi yaitu dibunuh/dimatikan,
namun tampa merubah struktur/bentuk sel tersebut. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara
menaroh preparat ulas diatas api bunsen. Fiksasi juga meningkatkan afinitas sel (daya
ikat) terhadap zat warna menjadi lebih besar atau zat warna menjadi lebih melekat. Ada
beberapa cara pewarnaan bakteri yang bergantung pada tujuan dan sifat bakteri. Pada
praktikum akan dicoba pewarnaan bakteri yaitu pewarnaan gram.

Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram adalah pewarnaan differensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam tahap identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel
bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram ada 2 macam yaitu gram positif dan
gram negative. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membrane sel
selapis. Sedangkan bakteri gram negative mempunyai dinding sel tipis yang berada di
antara dua lapis membrane sel.

Bahan:
1. Isolat bakteri yang akan diamati morfologi selnya.
2. Zat warna Kristal Violet/ungu (gram A)

26
 Kristal Violet berfungsi sebagai pemberi warna dasar
3. Zat warna Lugols Iodin/Kalium Iodida (gram B)
Lugols iodine menyebabkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri semakin
tinggi.
4. Zat warna Alkohol 95% (Gram C)
Alcohol berfungsi sebagai decolorisasi.
5. Zat warna safranin (Gram C)
Safranin akan mewarnai sel gram negative menjadi warna merah, sedangkan gram
positif menjadi warna biru.
6. Aquades.

Prosedur Kerja Pewarnaan Gram

a. Buat ulasan bakteri pada object glass kemudian fiksasi di atas bunsen.
b. Tetesi preparat ulasan dengan gram A (Kristal Violet), biarkan selama 60 detik,
kemudian cuci dan kering anginkan.
c. Tetesi preparat ulasan dengan gram B (Iodin), biarkan selama 60 detik, kemudian
cuci dan kering anginkan.
d. Cuci preparat ulasan dengan Alkohol 95%, tunggu alkohol hingga
menguap/mengering
e. Tetesi preparat ulasan dengan Safranin, biarkan selama 60 detik, kemudian cuci
dan kering anginkan.
f. Kemudian amati di bawah mikroskop, hasil positif jika sel berwarna ungu dan
hasil negatif jika sel berwarna merah.

Pewarnaan Endospora
Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri
yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk
dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan
dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia.
Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel
vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas.
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan
tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan
sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel
vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut
merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton.

Cara Kerja : Dampak/Hasil

1. Buat preparat ulas dari Bacillus
subtilis lalu tutup dengan kertas
merang
2.Tetesi ulasan pada object glass
dengan Malachite green di atas kertas
Sel bakteri menempel pada permukaan
object glass
Malachite green akan mewarnai sel
vegetatif bakteri. Endospora sukar

27
 merang. Letakan di atas air yang
mendidih. Biarkan 5 menit. Dijaga
jangan sampai kering. Jika bagian
pinggir mulai mengering, tambahkan
lagi Malachite Green.
3.Setelah dingin, bilas object glass
dengan akuades mengalir
4.Tetesi dengan safranin sebagai
counter stain, diamkan selama + 45
detik
5.Cuci kering anginkan
Pemberian Malachite green
Pelunturan dengan air mengalir
Penambahan safranin
menyerap zat warna, sekali diberi zat
warna, warna tersebut sulit dilunturkan.
Untuk mewarnainya dilakukan pemanasan
untuk mempermudah penetrasi Malachite
green ke dinding endospora.
Air digunakan sebagai agen dekolorasi sel.
Setelah perlakuan di atas Malachite green
tidak melekat kuat dengan sel vegetatif.
Pembilasan dengan akuades akan
melunturkan Malachite green pada sel
vegetatif
Safranin akan mewarnai sel vegetatif
menjadi merah, warna ini tidak
mempengaruhi warna hijau endospora.
28
Cuci dan keringkan
Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya :

Yeast / Khamir
A. Mengamati morfologi koloni yeast
a. Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces cereviceae atau Candida
albicans) pada PDA dengan cara streak quadrant.
b. Inkubasi selama 2x24 jam.
c. Setelah didapatkan koloni tunggal, pengamatan ciri-ciri morfologi koloni hampir
sama dengan ciri morfologi bakteri.

B. Mengamati Morfologi Sel Yeast

Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler, tidak
membentuk hifa (beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa).
Bentuk selnya bervariasi dapat berbentuk bulat, bulat telur, bulat
memanjang dengan ukuran 1-9x20 μm. Beberapa spesies yeast
memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan bentuk hifa
atau pseudohifa. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari
rangkaian sel hasil pembelahan aseksual secara budding, tetapi tidak
melepaskan diri dari induk. Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti
dan organel seperti mitkondria, grannula lemak dan glikogen.

B.1 Melihat bentuk sel Yeast

Cara Kerja :
a. Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam.

29
 b. Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue hingga
rata (jangan difiksasi).
c. Tutup preparat dengan cover glass.
d. Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x10.

B.2 Melihat bentuk spora sel Yeast

Cara kerja :
a. Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur 10 hari.
b. Fiksasi dengan api bunsen.
c. Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu:
d. Tetesi preparat dengan Malachite Green dan biarkan 30-60 detik. Panasi preparat
dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap). Cuci preparat dengan
air mengalir. Keringkan dengan tissue kemudian biarkan pada udara terbuka.
Amati di bawah mikroskop. Perhatikan spora yang berwarna

Kapang / Jamur
Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa
benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium). Hifa dapat
berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat
(aseptat). Penampakan morfologi koloni pada umumnya seperti
benang (filamentous) yang pertumbuhannya membentuk lingkaran.
Morfologi koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri
walaupun ada beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip jamur, seperti dari kelompok
Actinomycetes atau Bacillus mycoides. Koloni kapang memiliki keragaman warna yang
muncul dari sporanya.

A. Mengamati morfologi koloni kapang

Cara kerja :
a. Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle yang diletakan
di tenganh-tengah cawan petri.
b. Inkubasi selam beberapa hari.
c. Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar.

30
 III. UJI BIOKIMIAWI MIKROORGANISME

Kompeternsi : mahasiswa mengetahui beberapa teknik uji biokimia yang meliputi

aktivitas enzimatik miroorganisme dan uji gula.

Aktivitas enzimatis mikroorganisme :

1. Uji aktivitas eksoenzim :
a. Uji amilolitik
b. Uji lipolitik
c. Uji proteolitik
2. Uji aktivitas endoenzim :
a. Uji oksidase
b. Uji katalase
c. Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Uji Amilolitik
Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas polimer
glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum
membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida
yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa. Hidrolisis akhir maltosa
menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Indikator yang

31
dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine
membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media.

Cara Kerja :
a. Inokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E.coli dan Bacillus sp.
secara streak.
b. Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC
c. Setelah selesai inkubasi, tetesi cawan dengan lugol’s iodine secukupnya sehingga
seluruh permukaan media terkena.
d. Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan hasil
negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam.

Uji Lipolitik
Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah
mikroorganisma. Untuk mendapatkan energi dari lipid, mikroba menghasilkan enzim
lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak.
Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya
adalah dengan menggunakan media Trybutirin Agar, Rodhamine Agar dan Spirit Blue
Agar. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu
mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak.

Cara Kerja Uji Lipolitik dengan Media Tributyrin Agar:

a. Inokulasikan Bacillus sp. dan E. coli pada media Tributyrin Agar dengan indikator
neutral red secara streak.
b. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
c. Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni, sedangkan
reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah.

Cara Kerja Uji Lipolitik dengan Media Rhodamine Agar:

a. Inokulasikan Bacillus sp. dan E. coli pada media Rhodamine Agar dengan indikator
Rhodamine secara streak..
b. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
c. Diamati didalam UV Cabinet, reaksi positif ditandai adanya perpendaran didaerah
koloni, sedangkan reaksi negatif tidak berubah warna.

Uji proteolitik
32
 Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
menghasilkan enzim protease. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam bentuk
kasein susu. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa
asam amino. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis.

Cara Kerja :
a. Inokulasikan Bacillus sp. dan E. coli pada Skim Milk Agar (SMA) secara streak.
b. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
c. Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni.

Uji Oksidase
Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama
respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh
molekul oksigen. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui
dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase tetramethyl-p-
phenylenediaminedihydrocloride pada koloni bakteri. Reaksi positif ditandai
pembentukan warna biru kehitaman. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan
bahwa uji yang dilakukan negatif.

Cara Kerja :
a. Koloni bakteri diambil satu ose, oleskan pada kertas saring lembab.
b. Tetesi dengan reagen, lalu lihat perubahan yang terjadi
c. Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif, sedangkan bila tidak
terjadi perubahan maka hasil uji negatif. Hasil uji positif tertunda jika warna biru
muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi.

Uji Katalase
Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme
menghasilkan hidrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang
sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada
mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif aerob
maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik.
Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk penguraian
khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. Produksi

33
katalase bisa diidentifikasi dengan menambahkan H2O2 berkonsentrasi 3% pada suspensi
bakteri. Reaksi positif ditandai pembentukan gelembung gas.

Cara Kerja :
a. Koloni bakteri umur 24 jam diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan
pada object glass.
b. Dengan menggunakan pipet tetes, H2O2 diteteskan pada object glass secukupnya.
c. Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil
negatif.

Uji TSIA
Medium TSIA dapat membedakan antar bakteri Enterobacteriaceae yang
kesemuanya adalah bakteri Gram negatif yang mampu memfermentasi glukosa, serta
membedakannya dengan bakteri enteron lainnya. Pembedaan didasarkan pada
kemampuannya memfermentasi gula dan adanya H2S yang dihasilkan.
Medium TSIA mengandung tiga macam gula, yaitu glukosa, sukrosa, dan laktosa.
Sukrosa dan laktosa terdapat dalam konsentrasi 1% dan glukosa 0,1%. Kemampuan
menggunakan gula selain glukosa akan ditunjukkan oleh adanya perubahan warna.
Indikator warna phenol red dapat menunjukkan adanya fermentasi gula dengan perubahan
warna dari merah menjadi kuning. Bila H2S dihasilkan, akan ditunjukkan oleh adanya
warna hitam.
Cara Kerja :
1. Disiapkan beberapa isolat bakteri enteron, diantaranya Salmonella, Shigella,
Escherichia coli, dan Alcaligenes.
2. Inokulasikan isolat bakteri secara aseptis ke medium TSIA dengan cara tusukan
pada bagian tegak dan dengan cara gores pada bagian miring
3. Biakan diinkubasi pada suhu ± 37oC selama 24 jam
4. Hasil diamati, terbentuknya perubahan warna pada bagian tegak dan miring serta
terbentuknya gas dan warna hitam karena adanya H2S. Perubahan warna medium
menjadi kuning maka terjadi reaksi asam (A), perubahan warna menjadi merah
maka terjadi reaksi katalis (K), dan terbentuknya H2S ditandai oleh warna hitam
di sekitar pertumbuhan bakteri. Interpretasi hasil uji TSIA yaitu sebagai berikut:
a. Bagian tegak merah, bagian miring merah (K/K) menunjukkan glukosa, sukrosa,
dan laktosa tidak difermentasi oleh bakteri.
b. Bagian tegak kuning, bagian miring merah (A/K) dan timbul warna hitam,
menunjukkan hanya glukosa yang difermentasi oleh bakteri sedangkan laktosa
dan sukrosa tidak difermentasi. Timbulnya warna hitam dengan bau khas
menunjukkan bakteri menghasilkan H2S.
c. Bagian tegak kuning, bagian miring kuning (A/A), dan medium agar pecah,
menunjukkan glukosa, sukrosa, dan laktosa difermentasi oleh bakteri. Medium
yang pecah menunjukkan bakteri tersebut menghasilkan gas.

34
 d. Bagian tegak kuning, bagian miring kuning (A/A), dan timbul warna hitam,
menunjukkan glukosa, sukrosa, dan laktosa difermentasi oleh bakteri bakteri
tersebut menghasilkan H2S.
5. Simpulkan hasil pengamatan yang diperoleh dengan mencocokkannya ke pedoman
berikut :
- Escherichia : bagian miring kuning/bagian tegak kuning/tidak ada H2S
- Salmonella : bagian miring merah/bagian tegak kuning/H2S dihasilkan
- Shigella : bagian miring merah/bagian tegak kuning/tidak ada H2S
- Alcaligenes : bag miring merah/bagian tegak merah atau tidak ada perubahan

Uji IMViC
1. Uji Indole
Menggunakan media Tryptone Broth (TB). TB mengandung asam amino
Tryptofane. Golongan Coli-fekal mampu mengubah asam amino tryptofane menjadi
Indole karena menghasilkan enzim Tryptofanase. Apabila ditambah Covack Indole
Reagent akan terbentuk cincin berwarna merah (Redindole).
2. Uji Methyle Red (MR)
Menggunakan media Protease Broth (PB) atau MRVP medium. Golongan
Coli-fecal mampu menurunkan pH menjadi 5 karena memfermentasi PB atau
MRVP medium untuk menghasilkan asam lebih banyak dari golongan Coli-
nonfecal, dan berwarna merah setelah ditambah indikator Methyle Red (+).
3. Uji Voges Proskauer (VP)
Menggunakan media Protease Broth (PB) atau MRVP medium. Golongan
Coli-fecal tidak mampu membentuk Asetyle Methyle Carbunol (Aseton) yang
merupakan hasil samping metabolisme karbohidrat. Dinyatakan positif apabila
terbentuk warna merah setelah ditambah KOH 40% dan α-naphtole.
4. Uji Citrat
Menggunakan media Koser’s Citrate atau Simmon’s Citrate. Golongan Coli-fecal
mampu menggunakan Sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Adanya
pertumbuhan menunjukkan penggunaan Sitrat dan dapat dilihat dari timbulnya
kekeruhan pada media Koser’s Citrate dan terjadi perubahan warna dari hijau menjadi
biru apabila menggunakan media Simmon’s Citrate

35
 IV. DAYA ZAT ANTIMIKROBA

Kompetensi : mahasiswa mengetahui cara kerja pengujian zat antimikroba yang

meliputi uji desinfektan, uji antiseptik dan uji antibiotik menggunakan
metode Kirby-Bauer dan metode MIC.

Pengertian dan Jenis Disinfektan

Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau menghambat
pertumbuhan mikroorganisme. Zat antimikroba dapat bersifat membunuh
mikroorganisme (microbicidal) atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme
(microbiostatic). Desinfektan yaitu suatu senyawa kimia yang dapat menekan
pertumbuhan mikroorganisme pada permukaan benda mati seperti meja, lantai dan pisau
bedah. Efisiensi dan efektivitas disinfektan dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu:
a. Konsentrasi
b. Waktu terpapar
c. Jenis mikroba
d. Kondisi lingkungan: temperatur, pH dan jenis tempat mikroba hidup

Beberapa jenis disinfektan diantaranya adalah:

Jenis Keterangan
Senyawa fenol : Merusak membran sel
Fenol, Cresol, Recorcinol Mendenaturasi protein
Hexaclhorophene, Thymol Konsentrasi kerja : 2-5%
Alkohol : Pelarut lemak
Ethyl, Isopropil Denaturasi dan koagulasi protein
Konsentrasi kerja : 50-75%
Senyawa halogen : Agen oksidasi
Senyawa chlorin : Presipitasi protein
Sodium hypochlorite, Chloramine Klorin bereaksi dengan air membentuk asam
Senyawa iodine : hipoklorit yang bersifat bakterisidal
Povidone-iodine (betadine)
Logam berat : Bereaksi dengan gugus SH (sufihidril) pada
Senyawa Hg, Senyawa Zn enzim yang menyebabkan denaturasi.
Senyawa Cu dll.
Agen aktif permukaan : Menciptakan tegangan permukaan yang rendah
Sabun, Detergen, Emulsifier Merusak membran sel
Memindahkan sel secara mekanis
Senyawa kationik : Tegangan permukaan yang rendah
Senyawa amonium kuartener
Benzalconiumclhoride
Senyawa anionik : Daya kerja sama dengan senyawa aktif
Sodium Tertradecyl Sulphate permukaan
Asam (H+) Merusak dinding sel dan membran sel
-
Basa (OH ) Koagulasi protein
Pewarna : Memiliki avinitas terhadap asam nukleat
Crystal Violet
Cara kerja pengujian zat desinfektan :

36
a. Lembabkan cotton bud steril ke dalam peptone water lalu diulaskan pada permukaan
sampel yang mengandung bakteri kemudian diulaskan pada cawan yang berisi media
di bagian before (B).
b. Ambil cotton bud steril baru lalu dicelupkan pada desinfektan yang akan digunakan
(detergen atau pemutih) lalu diulaskan pada permukaan sampel yang tadi diulas
dengan peptone water.
c. Gunakan cotton bud steril baru lagi lalu dilembabkan pada peptone water dan
kemudian diulaskan pada permukaan sampel yang tadi telah dibasahi oleh
desinfektan, kemudian ulaskan pada bagian cawan after (A).
d. Inkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang.
e. Amati dan bandingkan koloni yang tumbuh pada permukaan cawan bagian before
dan after.

Pengertian dan Jenis Antibiotik

Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang
dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh mikroorganisme
lainnya. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam.
Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya, misal antibiotik macrolide,
antimikroba peptida. Adapun penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya
ataupun mikroorganisma produsernya, misalnya:
1. Ragam antibakteria:
a. Penicillin dan cephalosporin
b. Erythromycine
c. Sulfa drugs
d. Trimethoprim dan sulfamethoxazole
e. Polymyxin B
f. Quinolone
g. Tetracycline
2. Antifungi :
a. Nystatin
b. Azoles

Mekanisme kerja antibiotik antara lain :

a. Menghambat dsintesis dinding sel
b. Merusak permeabilitas membran sel.
c. Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi)
d. Menghambat sintesis protein (proses translasi).
e. Menghambat replikasi DNA.

Pr[ osedur difusi-kertas cakram-agar standar biasanya menggunakan metode Kirby-

Bauer Pengukuran sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter
zona hambat yang terbentuk.

Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer :

37
 a. Konsentrasi mikroba uji
b. Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram
c. Jenis antibiotik.
d. pH medium.

Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer :

a. Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas
ke sisi tabung agar air tiris.
b. Ulaskan pada seluruh permukaan cawan secara merata.
c. Biarkan cawan selama 5 menit.
d. Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu.
e. Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas cakram pada
permukaan agar.
f. Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di
permukaan agar.
g. Inkubasi pada suhu 37 0C selama 24-48 jam.
h. Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel sensitivitas
antibiotik.

Tabel penentuan Sensitivitas Antibiotik (diameter zona hambat dalam mm)

38
 Potensi Diameter zona hambat (mm)
Cakram
Antibiotik/kemoteurapetik Resistant Intermediate Susceptible
Obat
(tahan) (medium) (peka)
Amikacin 30 mcg ≤14 15-16 ≥17
Ampicillin
 gram (-) bact,enterococci 10 mcg ≤11 12-13 ≥14
 Haemophillus sp. 10 mcg ≤19 ≥20
 Staphyllococci 10 mcg ≤20 21-28 ≥29
Amoxicillin/Clavulanic acid 20/10mcg ≤13 14-17 ≥18
 Haemophillus sp. & 20/10mcg ≤19 ≥20
Staphyllococci
Carbenicillin
 Enterobacteriaceae 100 mcg ≤17 18-22 ≥23
 Ps. Aeruginosa 100 mcg ≤13 14-16 ≥17
Bacitracin 10 unit ≤8 9-12 ≥13
Cefotaxime 30 mcg ≤14 15-22 ≥23
Ceftriaxone 30 mcg ≤13 14-20 ≥21
Cephalotin 30 mcg ≤14 15-17 ≥18
Cephazidime 30 mcg ≤14 15-17 ≥18
Cuforoxime 30 mcg ≤14 15-17 ≥18
Chloramphenicol 30 mcg ≤12 13-17 ≥18
Clifrofoxacin ≤15 16-20 ≥21
Clyndamycin ≤14 15-20 ≥21
Colistin 10 mcg ≤8 9-10 ≥11
Cotrimoxazole 25 mcg ≤10 11-15 ≥16
Doxycycline 30 mcg ≤12 13-15 ≥16
Enoxacin ≤14 15-17 ≥18
Erytromycin 15 mcg ≤13 14-17 ≥18
Gentamycin 10 mcg ≤12 13-14 ≥15
Kanamycin 30 mcg ≤13 14-17 ≥18
Methicillin 5 mcg ≤9 10-13 ≥14
Minocycline 30 mcg ≤14 15-18 ≥19
Mexalactam 30 mcg ≤14 15-27 ≥23
Nalidixic acid 30 mcg ≤13 14-18 ≥19
Neomycin 30 mcg ≤12 13-16 ≥17
Nitrotunantoin 300 mcg ≤14 15-16 ≥17
Nortloxacin 10 mcg ≤12 13-16 ≥17
Oxacillin 1 mcg ≤10 11-12 ≥13
 Staphylococci
Penicillin
 Staphylococci 10 unit ≤20 21-28 ≥29
 Lainnya 10 mcg ≤11 12-21 ≥22

39
 Piperacillin 100 mcg ≤14 15-16 ≥18
 gram (-) ≤17 18-20 ≥21
Streptomycin 10 mcg ≤11 12-14 ≥15
Sulfonamide 300 mcg ≤12 13-16 ≥17
Tetracyclin 30 mcg ≤4 15-18 ≥19
Ticarcillin 75 mcg ≤11 12-14 ≥15
Tobramycin 10 mcg ≤12 13-14 ≥15
Vancomycin 30 mcg ≤9 10-11 ≥12

Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Minimum Inhibitor Concentration

(MIC) :
1. Secara aseptis 0.8 ml medium NB dimasukkan ke dalam tiap sumuran dalam 24
sumuran microwell plate steril.
2. Setiap kultur ditambahkan 0.1 ml ke dalam 9.9 ml larutan blanko steril sehingga
diperoleh pengenceran 10-2.
3. Sebanyak 0,1 mL pengenceran 10-2 dari S. aureus ditambahkan ke dua baris 6
sumuran, sehingga diperoleh baris A dan baris B diinokulasi dengan S. aureus.
4. Pekerjaan yang sama dilakukan inokulasi E. coli terhadap dua baris 6 sumuran
yang lain, sehingga diperoleh baris C dan D diinokulasi dengan E. coli.
5. Disiapkan pengenceran masing-masing antibiotic sehingga diperoleh konsentrasi
640, 320, 260, 80, 40, dan 20 µg/mL. pengencerann dibuat dengan cara : 64 mg
antibiotic ditambahkan ke dalam 10 mL air steril, dikocok agar larut. Kemudian
ditambahkan 1 mL larutan ini ke 9 mL air steril untuk menghasilkan konsentrasi
640 µg/mL. Sebanyak 5 mL larutan ini ke 5 mL air ssteril untuk mendapatkan
konsentrasi 320 µg/mL. Demikian seterusnya untuk konsentrasi lainnya.
6. Sebanyak 0,1 mL larutan penicillin ditambahkan ke baris A dan C dengan urutan
konsentrasi tertinggi pada A1 dan C1 dan konsentrasi terendah pada A6 dan C6.
7. Pekerjaan yang sama dilakukan untuk larutan erythromycin terhadap baris B dan
D, dengan konsentrasi tertinggi pada B1 dan D1 sedangkan konsentrasi terendah
pada B6 dan D6. Dengan menambahkan 0,1 mL ke 0,9 mL maka akan diperoleh
baris dengan konsentrasi antibiotic 64, 32, 16, 8, 4, dan 2 µg/mL.
8. Plate diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam.
9. Setelah masa inkubasi, setiap sumuran diamati terjadinya kekeruhan. Bila
terbentuk kekeruhan / terjadi pertumbuhan menunjukkan bahwa organism resisten
terhadap antibiotic pada konsentrasi yang dicobakan. Pencatatan: pertumbuhan +
dan pertumbuhan -.
10. Dari hasil pengamatan dapat ditentukan konsentrasi minmum (MIC) setiap
antibiotic terhadap setiap spesies bakteri. MIC diinterpretasikan pada sumuran
pertama yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan dan bukan pada sumuran
terakhir dimana pertumbuhan terjadi.

Pengertian Antiseptik

40
 Antiseptik adalah senyawa kimia yang digunakan untuk menekan pertumbuhan
mikroorganisme pada jaringan tubuh, misalnya kulit. Antiseptik umum digunakan untuk
mengurangi jumlah mikroorganisme pada suatu bagian atau jaringan tubuh. Antiseptik
dapat mencegah terjadinya infeksi yang disebabkan oleh suatu mikroorganisme.
Beberapa jenis antiseptik yang umum kita ketahui dalam kehidupan sehari-hari adalah
sabun, obat luka luar, hand sanitizer, ataupun tissue basah.

Cara Kerja Pengujian Antiseptik :

a. Tempelkan bagian tubuh (misal : ibu jari tangan) yang belum terkena alkohol atau
antiseptik lain pada permukaan cawan berisi media di bagian before (B).
b. Bagian tubuh yang sama kemudian diberikan antiseptik yang akan diuji
sensitivitasnya (misal : sabun atau hand sanitizer), diamkan sejenak lalu tempelkan
pada bagian after (A) pada cawan yang sama.
c. Inkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang.
d. Amati dan bandingkan koloni yang tumbuh pada permukaan cawan bagian before
dan after.

V. UJI MIKROBIOLOGI PRODUK

41
Kompetensi : Mahasiswa dapat mengetahui cemaran mikroorganisme pada produk obat
tradisional, kosmetik, dan makanan dengan perhitungan TPC (Total Plate
Count).

Uji secara mikrobiologi terhadap bahan baku maupun produk perlu dilakukan
untuk menguji kualitas produk. Pengujian mikrobiologi adalah pengujian untuk
mengetahui berapa banyak mikroorganisme yang dapat menyebabkan kerusakan atau
penurunan kualitas produk. Jenis pengujian ini antara lain: TPC (Total Plate Count), uji
Escherichia coli, Salmonella, Staphyllococcus, Vibrio, dan sebagainya. Batas toleransi
maksimum jumlah mikroorganisme produk berdasarkan SNI 01-2725-1992 adalah 5 x
105 CFU’s/ml. Dalam pengujian mikrobiogis dari obat tradisional dilakukan pengujian
angka lempeng total bakteri dan jamur sesuai dengan kondisi contoh sampel. Pada
produk-produk obat tradisional, pengujian diarahkan pada mikroorganisme yang
mencemari obat tradisional pada waktu pengolahan melalui tangan, peralatan, bahan
baku simplisia. Sebab bahan baku organik merupakan media yang baik untuk
pertumbuhan bakteri. Selain itu spora bakteri dapat bertahan hidup lama dalam debu
dan tanah. Nutrisi yang terdapat dalam bahan pangan dan lainnya merupakan sumber
nutrisi bagi mikroorganisme. Sumber nutrisi yang terdapat dalam bahan pangan atau obat
tradisional dapat bertindak sebagi perantara atau substrat untuk pertumbuhan
mikroorganisme patogenik maupun nonpatogenik. Mikroorganisme yang terdapat dalam
bahan yang dikonsumsi biasanya dapat berupa bakteri, khamir, atau kapang. Hasil
perhitungan disesuaikan dengan pedoman SNI.

1. Menentukan jumlah mikroorganisme (enumerasi)

1.1. Penghitungan jumlah bakteri hidup dengan Plate Count (tidak langsung)
Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme
hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam
media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang
tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme
dalam suspensi tersebut.
Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena
beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai.
Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. koloni
yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat
dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya.
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut “
- Satu koloni dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
- Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2
koloni.

42
 - Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah
dihitung.
- Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.

Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml

CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran
Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10-6 dengan metode Spread Plate
dan Pour Plate.
Spread plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFU’s / 0,1 ml
Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFU’s / 0,1 ml
SP = 0,1 ml = 500 000 000 CFU’s / ml
= 5x108 CFU’s / ml
Pour plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFU’s / 1 ml
Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFU’s / 1 ml
PP = 1 ml = 5x107 CFU’s / ml

Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count:

a. Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab, maserasi dan
rinse) (jika perlu).
b. Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran pertama,
selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8)
tertentu.
c. Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien Agar) atau
PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran (duplo). Plating
dapat secara Spread Plate atau Pour Plate. Jika secara Spread Plate, dapat
digunakan batang L atau glass beads.
d. Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam.
e. Setelah tumbuh, koloni dihitung dengan persyaratan TPC

43
 Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya
dibuat transek atau dibagi-bagi jika koloni yang tumbuh
terlalu banyak. Transek dibuat dengan spidol/marker di
bagian bawah cawan petri. Pola transek dapat dibuat
bervariasi, tergantung kebutuhan. Penghitungan akan
lebih mudah bila memakai Coloni Counter.

Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara TPC memiliki syarat
khusus berdasarkan statistic untuk memperkecil kesalahan dalam perhitungan.
Perhitungan mengacu kepada standar atau peraturan yang telah ditentukan. Syarat-
syaratnya sebagai berikut :
- Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran, maka hanya dari
pengenceran tertinggi yang dilaporkan. Misalnya dengan cara menghitung
jumlahnya pada ¼ bagian (transek) cawan kemudian hasilnya dikalikan empat.
Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya faktor
pengenceran, tetapi jumlah sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan
6
3,0X10
TNTC TNTC 358 6 Pngc.trtgg(10-4)
(3,6X10 )
3,0X105
TNTC 325 18 5 Pngc.trtgg(10-3)
(3,3X10 )
- Apabila setiap pengenceran digunakan 2 cawan petri (duplo), maka jumlah
angka yang digunakan adalah data dari kedua cawan, tidak boleh diambil salah
satu, meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat di
antara 30-300. Data yang dilaporkan adalah rata-rata dari kedua cawan duplo
tersebut.
10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan
175 15 5 (17.500+20.800)/2
15 dan 20 <30
208 20 2 = 1,9X104
(135+165)/2 =150
135 45 5 (45+45)/2 =45 maka
1,5 X104
165 45 8 45.000/15.000 =3, >2,
dilap. Pengc. terendah
(275+285)/2 =280
(28.000+37.500)/2 (35+40)/2 =37,5 maka
275 35 5
=65.500 37.500/28.000 =1,34,
285 40 7
6,6 X104 ≤2, dilap. Pengc.
Rata-rata
(29.000+30.500)/2
290 25 5 Rata-rata dari 10-2
=29.750
305 28 0 meskipun 305>300
3,0X104

44
 Bagan alur persyaratan TPC

1.2. Penghitungan jumlah bakteri langsung dengan hemositometer

Penghitungan jumlah bakteri secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis
dengan alat Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat
kompartemen berbentuk bujur sangkar pada alat ini mempunyai volume tertentu sehingga
satuan isi yang terdapat di dalamnya juga tertentu.
Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di
tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang
dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400
kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan
memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat
diketahui.

(1) (2)

45
 (3) (4)
2
Luas kotak sedang = p x l = 0,2 x 0,2 = 0,04 mm
Volume kotak sedang := 0,04 mm2 x 0,1 mm= 0,004 mm3
Karena 1 ml = 1cm2
Maka : 0,004 mm3 = 0,000004 cm3 = 4x10-6 ml
Jumlah sel/ml dalam kotak sedang hemositometer :
= jumlah sel/4x10-6 ml
= (jumlah sel/4) x 106
= jumlah sel x (¼) x 106
= jumlah sel x 2,5 x 105
jadi misalnya diperoleh:20 sel dalam satu kotak sedang maka jumlah sel keseluruhan :
= 20 x (1/4) x 106 = 5 x 106 sel/ml

Cara kerja (digunakan kotak sedang) :

a. Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol
70 % lalu keringkan dengan tissue.
b. Letakkan cover glass di atas alat hitung.
c. Tambahkan ± 50 µl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan
pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas.
d. Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek
kapilaritas).
e. Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran
40x10.
f. Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak. Jika
dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka
perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5
atau 1:10.
g. Hitung sampel dari 5 kotak sedang. Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil
rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran maka
jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran.

46