Nama: Ade Nurlian

NIM: 1513015059
RESUME TEKNOLOGI FORMULASI SEDIAAN III
MATERI 3
DEPIROGENASI DAN UJI STERILITAS
1. Pengertian Depirogenasi
Depirogenasi adalah proses menghilangkan pirogen dari suatu larutan atau
vial obat dimana pirogen adalah senyawa dengan berat molekul tinggi
yang dinyatakan sebagai senyawa lipopolisakarida yang diproduksi oleh 5-
10 % masa total bakteri. Pirogen merupakan senyawa yang jika masuk ke
aliran darah akan mempengaruhi suhu tubuh dan menyebabkan demam
2. Metode Depirogenasi
a. Depirogenasi dengan membuang endotoksin
a. Destilasi
b. Osmosis balik
c. Ultrafiltrasi
d. Resin penukar ion
e. Karbon teraktivasi
f. Mengisi media yang dimodifikasi
g. Mencuci/membilas
b. Depirogenasi dengan destruksi kimia endotoksin
a. Hidrolisis asam
b. Hidrolisis basa
c. Oksidasi
c. Depirogenasi dengan dekstruksi fisika endotoksin
a. Radiasi
b. Panas lembab
c. Panas kering
3. Perbedaan Sterilisasi dan depirogenasi
Sterilisasi adalah proses menghilangkan spora, agen, dan mikroba yang
tidak tahan lama sedangkan depirogenasi adalah menghilangkan pirogen
(produk metabolit dari pertumbuhan mikroba, laut air, tahan panas, LPS
tidak hancur dengan sterilisasi uap air/ penyaringan)
4. Uji sterilitas
Pengujian sterilitas adalah pengujian dekstruksi dimana uji sterilisasi
didasarkan pada pengujian unit sampel, dimana tujuannya adalah untuk
menjamin bahwa produk yang melalui proses pembuatan itu tidak
mengandung mikroorganisme atau faktanya terkontaminasi.
5. Metode pengujian sterilitas
a. Metode transfer langsung (inokulasi langsung ke dalam media uji)
 Melibatkan transfersampel scara aseptik dari larutan yang akan
diuji kedalam medium pertumbuhan. Uji pada cairan, pindahkan
cairan dari wadah uji menggunakan pipet atau jarum suntik steril.
Secara aseptik inokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap
wadah uji ke dalam tabung media. Campur cairan dengan media
tanpa aerasi berlebihan. Inkubasi dalam media sesuai dengan
prosedur umum selama tidak kurang 14 hari. Amati pertumbuhan
pada media secara visual sesering mungkin sekurangnya pada hari
ke-3 atau ke-4 atau ke-5, pada hari ke-7 atau ke-8 dan pada hari
terakhir masa uji. Jika zat uji menyebabkan media menjadi keruh
sehingga ada atau tidaknya pertumbuhan mikroba tidak segera
dapat ditentukan secara visual, pindahkan sejumlah memadai
media ke dalam tabung baru berisi media yang sama, sekurangnya
1 kali antara hari ke-3 dan ke-7 sejak pengujian dimulai. Lanjutkan
inkubasi media awal dan media baru selama total waktu tidak
kurang dari 14 hari sejak inokulasi awal.
b. Metode filtrasi membran
Metode yang paling banyak digunakan pada industridimana
dilakukan penyaringan dengan tekanan atau vakum dari larutan
yang diuji melalui peralatan penyaring steril yang disambungkan
dengan membran filter, kemudian dilanjutkan dengan pembilasan
menggunakan pengencer steril dan menempelkan membran filter
pada permukaan pelat. Teknik yang banyak direkomendasikan
Farmakope, meliputi filtrasi cairan melalui membran steril. Filter
lalu ditanam dalam media. Masa inkubasi 7-14 hari karena
mungkin organisme perlu adaptasi dulu. Prosedur uji menggunakan
penyaringan membran: Jika teknik penyaringan membran
digunakan untuk bahan cair yang dapat diuji dengan cara inokulasi
langsung ke dalam media uji, uji tidak kurang dari volume dan
jumlah seperti yang tertera pada pemilihan spesimen uji dan masa
inkubasi. Peralatan unit penyaring membran yang sesuai terdiri
dari satu perangkat yang dapat memudahkan penanganan bahan uji
secara aseptik dan membran yang telah diproses dapat dipindahkan
secara aseptik untuk inokulasi ke dalam media yang sesuai atau
satu perangkat yang dapat ditambahkan media steril ke dalam
penyaringnya dan membran diinkubasi in situ. Membran yang
sesuai umumnya mempunyai porositas 0,45mm dengan diameter
lebih kurang 47mm, dan kecepatan penyaringan air 55 mL sampai
75 mL per menit pada tekanan 70cmHg. Unit keseluruhan dapat
dirakit dan disterilkan bersama dengan membran sebelum
digunakan atau membran dapat disterilkan terpisah dengan cara
apa saja yang dapat mempertahankan karakteristik penyaring dan
menjamin sterilitas penyaring dan perangkatnya. Jika bahan uji
 berupa minyak, membran dapat disterilkan terpisah dan setelah
melalui pengeringan unit dirakit secara aseptic

6. Media pertumbuhan pengujian sterilitas

a. Media tioglikolat cair (MTC FTM)

b. Medium pertumbuhan soybean-casein (SCD)

7. Jumlah unit sampel

Jumlah unit sampel pengujian bervariasi menurut faktor berikut
a. Jumlah unit per bets
b. Volume isi dari kontener
c. Metode sterilisasi produk
8. Waktu & suhu inkubasi
Terdapat 2 rentang suhu inkubasi 20-25 derajat celcius untuk SCD dan 30-
35 derajat celcius untuk FTM. Banyak kontaminan mikroba yang berasal
dari manusia seperti misalnya micrococcus dan staphylococcus yang
merupakan flora normal kulit. Sedangkan isolat yang berasal dari
lingkungan seperti jamur, kapang dan bacilus lebih menyukai suhu yang
lebih dingin. Waktu inkubasi untuk sediaan yang diisikan secara aseptik
(sterilisasi nonterminal) tidak kurang dari 14 hari dan produk yang
disterilkan secara terminal tidak kurang dari 7 hari, jika digunakan metode
filtrasi membran.
9. Interpretasi bersifat
Sifatnya langsung jika ada pertumbuhan mikroba dalam media tabung
yang diuji, jika terbukti ada yang terkontaminasi pertumbuhan mikroba
maka tabung dianggap tidak memenuhi syarat
 10. Validasi & kotrol pengujian
Validasi adalah suatu tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa
tiap bahan, proses, prosedur, kegiatan, sistem, perlengkapan, atau
mekanisme yang digunakan dalam produksi dan pengawasan akan
senantiasa mencapai hasil yang diinginkan. Tujuan dari validasi metode uji
sterilisasi adalah untuk memastikan metode dipengaruhi oleh bahan yang
ada dalam sediaan yang mungkin dapat menghambat pertumbuhan
mikroba yang mengkontaminasi sediaan
11. Keterbatasan Pengujian Sterilitas
a. Kemampuan secara statistik uji sterilitas USP rendah
b. Media pertumbuhan mempunyai kemampuan terbatas untuk
menumbuhkan semua kontaminan
c. Adanya kemungkinan kontaminasi di laaboratorium
12. Inovasi dan peningkatan pengujian sterilitas
Untuk melakukan pengujian sterilisasi dan pengembangan teknologi baru
agar dapat dicapai sasaran pengujian sterilitas cepat dan mendekati waktu
yang sesungguhnya setelah digunakan ruang isolasi. Penggunaan isolator
yang didesain dgn baik dapat mengurangi hasil pengujian yang palsu serta
juga menguragi atau menghilangkan kemungkinan kesalahan yang
dilakukan individu.
Teknologi baru yang berkembang untuk melakukan pengujian dengan
cepat, diantaranya:
a. Growth – based technologies
b. Viability - based technologies
c. Arrtifact - based technologies
d. Nucleic - based technologies

PERTANYAAN DAN JAWABAN

1. Dalam metode inoculatiom of culture medium, bagaimana kita mengetahui

steril atau tidak ? ( Desi)
Jawab : Pada metode ini ada penambahan zat uji dalam medium yang akan
mengubah warnanya menjadi keruh. Saat perubahan warna keruh tersebut
tidak dapat diketahui adanya pertumbuhan mikroba atau tidak, sehingga
dibuat media yang baru dan diinokulasikan warna yang keruh tersebut,
diinkubasi kembali tidak kurang dari 14 hari kemudian diamati secara
visual ada atau tidaknya pertumbuhan mikroba yang ditandai adanya
kelarutan dalam media.
2. Metode depirogenasi dengan metode sterilisasi apakah sama atau tidak ?
jika tidak apa yang membedakan ? (Lusi)
Jawab: Tidak. Karena sterilisasi hanya dapat membunuh spora yang tidak
tahan panas. Sedangkan depirogenasi dapat membunuh mikroba dan
pirogen – pirogen yang ada.
Metode depirogenasi terdiri atas 3 metode utama yaitu :

a. Depirogenasi dengan membuang endotoksin

d. Destilasi
e. Osmosis balik
f. Ultrafiltrasi
g. Resin penukar ion
h. Karbon teraktivasi
i. Mengisi media yang dimodifikasi
j. Mencuci/membilas
d. Depirogenasi dengan destruksi kimia endotoksin
a. Hidrolisis asam
b. Hidrolisis basa
c. Oksidasi
e. Depirogenasi dengan dekstruksi fisika endotoksin
a. Radiasi
b. Panas lembab
c. Panas kering

Sedangkan metode uji sterilitas terbagi menjadi 2 metode yaitu :

a. Membran filtrasi
b. Inokulasi langsung pada media uji/ transfer langsung.

3. Pada metode membran filtrasi disebutkan tentang menanam dalam media

lalu diinkubasi, tolong untuk dijelaskan lebih lanjut ?
Jawab : Metode membran filtrasi merupakan salah satu metode uji
sterilisasi yang cocok untuk sampel yang mengandung preservatif,
 senyawa bakteriostatik atau fungsistatik, yang dapat menghambat
pertumbuhan kontaminan mikroba yang potensial. Dengan membran
filtasi, mikroorganisme dan semua senyawa penghambat di cuci dengan
menggunakan larutan yang sesuai. Inokulasi pada media menggunakan
media yang dipilih berdasarkan kemampuannya untuk mendukung
pertumbuhan dari mikroorganisme anaerob maupun aerob yang kemudian
dipindahkan ke filter membran. Inkubasi selama 14 hari diperlukan untuk
memperoleh hasil uji.
4. Apa keuntungan menggunakan metode membran filtrasi ? (mega & ika)
Jawab: Kelemahan dan kelebihan membran filtrasi

a. Kelebihan

Karena banyak dari permukaan membrane adalah suatu ruangan yang

kosong atau terbuka, maka penyaring yang cukup baik di rakit dan
disterilkan akan memberikan suatu keuntungan berupa laju alir
tinggi.Kecepatan pada penyaringan sejumlah kecil larutan

 Efektif untuk mensterilkan materi – materi yang tidak tahan panas

 Penggunaan penyaring tertentu
 Peralatan yang digunakan murah
 Dapat mensterilkan bahan-bahan obat, vitamin, media yang tidak
tahan panas
 Dapat menyaring dalam volume besar

b. Kelemahan

Kelemahan membrane umumnya rapuh, sehingga penting untuk

menetapkan bahwa rakitan sudah cukup baik dan membran tidak akan
rusak atau pecah selama perakitan, sterilisasi atau selama penggunaan.

 Mempunyai kecenderungan mengabsorbsi beberapa senyawa aktif

tertentu selama proses penyaringan
  Kemungkinan kerusakan bentuk penyaring sehingga kesterilan
hasil yang di peroleh tidak pasti
 Tidak dapat menyaring virus
 Hanya sekali pakai
 Membran filter dapat tersumbat
 SAL kurang dari sterilisasi panas basah dan kering

5. Kenapa depirogenasi dipisahkan dari uji sterilitas ?

Jawab: Karena sterilisasi hanya membunuh spora yang tidak tahan panas,
sedangkan depirogenasi dapat membunuh pirogen-pirogen yang ada.
6. Apa saja kelebihan dan kekurangan dari depirogenasi ?
Jawab: Kelebihan dari depirogenasi adalah tidak hanya dapat membunuh
bakteri, tetapi dapat pula membunuh pirogen. Selain itu juga aman bagi
lungkungan, murah, tidak beracun, alat mudah dipasang dan tidak korosif
pada logam.
7. Kapan penggunaan media tioglikolat dan media SCD ?
Jawab: Media
tioglikolatmenyediakanlingkunganbagipertumbuhanbakteriaerobdananaero
b. Namun media tioglikolatmemilikibahan Na-tioglikolatdan L-
sisteindimanabekerjasebegaiagenpereduksidanmembantuterbentuknyaling
kungankadaroksigenrendahpadabagianbawahtabungsehinggahalinilebihme
mungkinkanuntukpertumbuhanbakterianaeron aero toleran.
Sedangkanpada median SDC
lebihcondongpadapertumbuhanmikroorganismeaerob.
8. Dua medium yang digunakan itu bisa untuk inokulasi bakteri apa saja ?
Apa perbedaan dari pengujian bakteristatik dan fungistatik dan bagaimana
cara pengujiannya dalam validasi uji sterilitas? (Fariana Nur Santi)
Jawab : Bakteri yang dapat digunakan yaitu S. aureus, P aeruginosa, B.
subtilis, C. albicans, A. niger, dan C. sporogenes. Validasi uji sterilitas
adalah suatu tindakan pembuktian untuk memastikan bahwa metode yang
dipakai tidak dipengaruhi oleh bahan-bahan yang ada dalam sediaan yang
mungkin dapat menghambat pertumbuhan mikroba yang mengkontaminasi
 sediaan. Dalam validasi uji sterilitas ada pengujian zat bakteriostatik dan
fungistatik. Pengujian bakteriostatik adalah pengujian yang ditunjukkan
untuk menggambarkan suatu zat yang menghentikan pertumbuhan bakteri
sedangkan pengujian fungistatik merupakan pengujian yang ditunjukkan
untuk menggambarkan suatu zat yang menghentikan pertumbuhan jamur.
Cara pengujiannya pertama dilakukan sesuai metode yang ada pada uji
sterilitas. Kemudian kedalam larutan pepton dimasukkan mikroba seperti
bakteri atau jamur selanjutnya gunakan larutan lerutan pepton untuk
pembilaasan diakfir saringan membran, dicatat kecepatan penyaringan dan
pembilasan, potong saringan membran menjadi 2 bagian , satu bagian
kedalam media thioglycollate dan satu bagian ke dalam media soybean
lalu diinkubasi dan amati selama 5 hari kemudian catat hasil pengamatan.
Lalu dilanjutkan dengan identifikasi konfirmasi mikroba, dinyatakan valid
jika terjadi pertumbuhan yang ditandai dengan kekeruhan yang sudah
harus bisa dideteksi dalam 48jam dan identifikasi mikroba menyatakan
bahwa mikroba yang tumbuh adalah jenis mikroba yang diinokulasikan.

9. Kenapa hanya medium tioglikolat dan SCD saja yang digunakan ?

Jawab: Karena mediatioglikolat merupakan media yang sering digunakan,
dimana tioglikolat merupakan media pembenihan cair yang berperan
sebagai media penyubur, yang mengandung bahan-bahan nutrisi seperti
casein, ragi dan ekstrak daging sapi serta vitamin untuk mempercepat
pertumbuhan. Sedangkan media SDC merupakan media nonselektif
,menyediakan nutrisi yang cukup untuk mikroorganisme berkembang,
karena mengandung enzimatik kasein dan bungkil kedelai yang
menyediakan asam amino dan nitrogen lain untuk media yang bergizi
bagi organisme.

10. Apa saja syarat validasi ?

Jawab: Tujuan dari validasi untuk mengetahui bahwa metode yang dipakai
tidak dipengaruhi oleh bahan-bahan yang ada dalam sediaan yang dapat
 menghambat pertumbuhan mikroba yang mengkontaminasi sediaan. Ada
tiga prinsip yang terlibat dalam proses validasi sterilitas :
a. Membuat sterilitas kedalam sediaan.
b. Untuk menunjukan tingkat kemungkinan maksimum yang pasti
dimana metode sterilisasi terpercaya terhadap semua batch sediaan.
c. Memberikan jaminan yang lebih luas dan mendukung hasil uji
sediaan akhir.
11. Perbedaan dari metode partikulat dan LAL ?
Jawab: Metode partikulat merupakan metode uji untuk melihat partikulat
asing dalam sediaan steril dengan menggunakan alata seperti mikroskop
atau secara visual, sedangkan metode LAL merupakan metode spesifik
untuk bakteri endotoksin, hanya untuk pirogen yang signifikan atau
merupakan tes biologis dengan menggunakan kelinci sebagai uji, karena
kelinci sangat sensitif terhadap pirogen.
12. Bagaimana cara melihat hasil selain dari kekeruhannya ?
Jawab: Selain kekeruhan interprestasi hasil dapat dilakukan dengan
menggunakan fluorensasi yaitu memanfaatkan sinar UV dan media khusus
yang menyebabkan bakteri dapat berpendar dibawah sinar UV setelah
dibiarkan 3 jam. Selain itu ada pula cara perubahan warna dengan
memanfaatkan media khusus yang mampu menghasilkan perubahan warna
jika terdapat mikroba setelah diinkubasi pada 57°C selama 24-48 jam.

13. Bagaimana meminimalisir keterbatasan dari media uji tersebut ?

Jawab: Cara meminimalisir keterbatasan media adalah dengan secara hati-
hati memilih media yang memiliki kemampuan untuk mendukung
pertumbuhan mikroba, baik itu mikroba yang bersifat anaerob maupun
aerobik.
14. Apa perbedaan depirogenasi dengan sterilisasi biasa, mengapa harus di
bedakan? Bukankah depirogenasi termasuk dalam sterilisasi? (Arief)
Jawab: Jelas berbeda, tujuan sterilisasi hanya untuk mematikan mikroba-
mikroba sedangkan depirogenasi lebih spesifik bertujuan untuk mematikan
pirogen-pirogen yang dapat menyebabkan demam bila tidak dimusnahkan