LAPORAN PRAKTIKUM VI

PENGECATAN / PEWARNAAN BAKTERI

Oleh:

NAMA : Dimas Lukito A

NIM : 1522220029

DOSEN PENGAMPU:

1. Awalul Fatiqin, M.Si

2. Ike Apriani, M.Si
3. Riri Novita S, M.Si

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS ILMU TARBIYAH DAN KEGURUAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) RADEN FATAH

PALEMBANG

2017
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa
macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan
tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus,
sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri
ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998).
Zat warna yang mengabsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroorganisme dengan sekelilingnya ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkimkan pengamatan struktur sel seperti spora, flagella dan bahan
inklusi yang mengandung zat pati dan granua fosfat. Pewarnan yang digunakan
untuk melihat alah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus, sedangkan
pewarnaan yang digunakan untuk memilah organisme disebut pewarnaan
diferensial. Pewarnaan gram merupakan contoh pewarnaan diferensial yang
mmilah bakteri menjadi dua yaitu kelompok gram positif dan gram negatif (Lay
W. Bibiana.1994).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut
kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen
seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat
dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Zat warna yang digunakan daam pewarnaan bersifat basa atau asam. Pada
zat yang basa , bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut
kromofor dan mempunyai muatan postif. Sebaliknya, pada zat warna asam,
bagian yang memberikan zat warna mempunyai muatan negatif. Zat warna
 yang basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan
pada dinding sel, membrane sel sitoplasma sewaktu proses pewarnaan. Muatan
positif pada zat warna basa akan berikatan dengan muatan negatif dalam sel,
sehingga mikroorganisme jeas terlihat (Lay W. Bibiana.1994).
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)
Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui
teknik pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat
bagian-bagian bakteri. Diharapkan dengan percobaan ini, mahasiswa mampu
melakukan berbagai pewarnaan bakteri sesuai dengan peruntukannya.

B. Tujuan Praktikum
1. Mengamati morfologi bakteri.
2. Mengamati dan membedakan struktur yang terdapat dalam sel dan juga
untuk membedakan kelompok bakteri berdasarkan reaksinya terhadap
warna yang sekaligus meunjukkan sifat bakteri tersebut.
3. Untuk mempelajari pewarnaan spora bakteri.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Pengertian Pewarnaan Bakteri

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir
tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan
zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar
belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga
kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang
mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk
melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan
pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut
pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram
positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl
neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam
dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus
dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada
umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak
bakteri yang tidak mempunyai zat warna. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk
mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad,
mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad
terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat
diketahui (Hadiutomo. 1990).
 Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada
tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua
yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari
reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut
ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias
dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti
Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu

pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik
adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam
yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah
satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat
pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah
ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang
mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut
pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan

asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna
disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat
warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan
negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak
ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses
pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan
negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat
(Dwidjoseputro.1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan
untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk
mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai
latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini
tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel.
Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang
bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna
terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu
proses pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme
disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat
warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang
bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang
disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan
mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan
mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998)
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek.
Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan
haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu
diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi
bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan
media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka
akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya
(Sutedjo.1991).
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka
seringkali setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh
pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas
api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk :
1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah
diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim,
prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal
violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang
kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam
yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994).
 Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini
sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada
mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang
(basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan
bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus),
buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang
terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa,
tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba
dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca
objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai
lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak
berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli
bioteknologi dari Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun 1884.
Menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja. Dengan metode ini.
Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan
bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap
cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu
merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994)

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan

segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat
kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel
mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding
sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan
pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak
tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri
gram negatif (Lay,1994)
 Ciri-ciri gram negative:

a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi
layer
b. Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%),
peptidoglikan terdapat dalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan
jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.
c. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
d. Tidak resisten terhadap gangguan fisik

Ciri-ciri bakteri gram positif:

a. Struktur dindingnya tebal

b. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
c. Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
d. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu
Kristal
e. Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
f. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu

a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu

b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk

mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah
dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk :

a. Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar

b. Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
c. Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang
serupa
B. Pembahasan
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam
zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk
mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan
pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol
, fuchsin , dan safranin(lay ,1994).
Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang
sulit diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya,
metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana
digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri
melainkan melatar belakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-
bentuk kosong tak berwarna(negatif) (Lay.1994).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk
mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu
tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat
warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat
pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat
warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet,
alkohol, safranin, dan iodine (Lay.1994).
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan
malachite green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul
warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya yaitu pada
Bacillus subtitulis (Lay.1994).
Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang
digunakan hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang
merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum
(Dwidjoseputro.1998).
 Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung
dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru
melainkan ke dalam latar belakangnya (Lay.1994)
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri ; sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat
warna dan penambahan larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998).
Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang
menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan
akan muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya
(Lay.1994)
Fuchsin carbon, merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang
digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan
dalam pewarnaan mikrobkateria karena memiliki ketertarikan untuk asam
mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol fuchsin juga digunakan
sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994)
Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna
ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri.
Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan
sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).
Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan
memanaskan campuran nirobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri
utamanya adalah sebagai pewarna untuk lak, pernis, dan tinta penanda pena.
Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk
dan organisme yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar
belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda
positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi
sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan sehingga
organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat
mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai
dengan metode biasa.
Lugol’s yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari
iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai
antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai
reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes medis
(Dwidjoseputro.1998).
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi.
Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan.
Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam
gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan, musin dan
butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada juga trimetil
safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan
biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara
keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari
kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redok dalam kimia
analitik (Sutedjo,1991)
Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel
agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses
pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel
bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya (Lay,1994).
Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan
bakteri dengan bentuk basil dan berwarna ungu dalam pembesaran 400. Pada
pewarnaan negatif, tidak ditemukan terlalu banyak bakteri, ditemukan bakteri
dengan bentuk coccus dan pewarnaan negatif mewarnai belakangnya berwarna
biru gelap dan bakteri berwarna kuning. Pada pewarnaan gram ditemukan
bakteri jenis gram negatif dengan warna merah dan memiliki bentuk basil pada
perbesaran mikroskop hingga 400. Sedangkan, pada perwarnaan spora yang
menggunakan malachite green dan safranin, spora seharusnya berwarna hijau,
tetapi pada hasil pengamatan yang terlihat hanya warna merah dari safranin,
yaitu sel vegetatifnya dengan bentuk coccus pada perbesaran 400 di mikroskop.
Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat
warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya
dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor
yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna
dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air.
 BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi,
pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup. Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada
warnanya pada gram positif berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat
pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi pada dinding selnya. Macam-
macam pewarnaan antara lain pewarnaan sederhana,pewarnaan differensial,
pewarnaan spora dan perwarnaan kapsul. Larutan zat warna yang digunakan
pada percobaan perwarnaan antara lain alkohol, carbol fuchsin, crystal violet,
nigrosin, malachite green, lugol’s iodida, dan safranin.

B. Saran
Sebaiknya pada praktikum dilakukan percobaab yang lain seperti
pewarnaan kapsul, basil tahan asam, dan perwarnaan fulton, diharapkan
dengan mempelajari berbagai macam metode pewarnaan lebih banyak
mengenai tentang proses dan metode pewarnaan.
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan

Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga

Lay, Bibiana. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali

Sutedjo, Mul Mulyani. 1991. Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta

Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press