BAB III

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus-Oktober 2016 bertempat di
Laboratorium Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Pakuan dan Biofarmaka.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1 Alat
Alat yang akan digunakan dalam penelitian ini meliputi timbangan digital,
botol coklat, penangas air, oven , grinder, ayakan mesh 20, neraca analitik, rotary
evaporator, Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Spektrofotometer UV-Vis,
Spektrofotometer FTIR, Alat-alat gelas meliputi erlenmeyer, gelas ukur, alat-alat
gelas meliputi rotary evaporator, erlenmeyer, gelas ukur.
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun binahong, Aseton,
asam klorida 1N, asam klorida 2N, asam klorida pekat, Natrium klorida, etanol p,
asam asetat, air suling, n-butanol, pereaksi Bouchardat, pereaksi Mayer, pereaksi
Liberman, amonia, kloroform, eter, formalin 3%, gelatin, Pb asetat, Besi (III)
Klorida, plat KLT silica G60 F254.

3.3 Tahap Pelaksanaan Penelitian

3.3.1 Pengumpulan Bahan
Bahan diambil dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (Balittro)
Bogor Jawa Barat.
3.3.2 Determinasi Sampel
Determinasi daun binahong dilakukan di Pusat Konservasi Tumbuhan
Kebun Raya Bogor, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI). Jalan Ir. H.
Juanda-Bogor.
 13

3.3.3 Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Binahong

Daun binahong dibersihkan dari kotoran yang menempel, kemudian dicuci
bersih dan dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung, kemudian
dibersihkan kembali dari kotoran yang mungkin tidak hilang saat sortasi basah.
Setelah sortasi kering digiling dan diayak menggunakan ayakan Mesh 30,
Rendemen simplisia dapat dihitung dengan cara :

Rendemen (%) = Bobot akhir x 100 %

Bobot Awal

Alur peneliitian dapat dilihat pada Lampiran 1.

3.3.4 Uji Karakteristik Serbuk Simplisia Daun Binahong

a. Penetapan kadar air
Prosedur penentuan kadar air simplisia dilakukan dengan menggunakan
alat moisture balance, yaitu dengan cara menyalakan tombol on/off terlebih
dahulu, kemudian pinggan diletakkan di tengah dan penahan punch di atasnya.
Kemudian diset program, akurasi dan temperatur sesuai dengan simplisia yang
akan diuji, lalu ditara. Ditimbang simplisia sebanyak 1 gram (akurasi rendah) atau
5 gram (akurasi sedang), simplisia disimpan di atas punch, diratakan sampai
menutupi permukaan punch lalu ditutup, setelah 10 menit proses selesai maka
persen kadar air dari simplisia akan tertera secara otomatis (penentuan dilakukan
duplo). Kadar air simplisia pada umumnya yaitu tidak lebih dari 5 %.

b. Penetapan kadar abu

Lebih kurang 2-3 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam krus porselin
yang telah dipijarkan dan ditara, diratakan. Dipijarkan perlahan-lahan hingga
arang habis, didinginkan, ditimbang. Jika dengan cara ini arang tidak bisa
dihilangkan, ditambahkan air panas, disaring melalui kertas saring bebas abu.
Dipijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan ke
dalam krus, diuapkan, dipijarkan hingga bobot tetap dan ditimbang. Kadar abu
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara (DepKes RI, 1995).

%
 14

3.3.5 Pembuatan Ekstrak Daun Binahong

Dimasukkan 50 gram simplisia kering ke dalam botol coklat, ditambahkan
400 mL pelarut aseton : air (7:3) dengan penambahan 3 mL asam askorbat 10mM.
Direndam selama 6 jam pertama sambil sekali-sekali diaduk, kemudian diamkan
selama 66 jam atau (3x24 jam). Maserat dipisahkan dengan cara pengendapan,
sentrifugasi, dekantasi atau filtrasi. Kemudian hasil ,maserat yang sudah disaring
diambil secukupnya dan dikentalkan pada waterbath untuk uji fitokimia,
kemudian diuapkan dengan penguap vakum hingga diperoleh ekstrak kental
(Sa’adah, 2010). Perhitungan pembuatan asam askorbat 10mM dapat dilihat pada
Lampiran 2.
3.3.6 Fraksinasi Senyawa Tanin Daun Binahong
Filtrat daun binahong hasil maserasi dipekatkan dengan menggunakan
vaccum rotary evaporator dan pemanasan di atas waterbath pada suhu 40-50oC.
Cairan hasil ekstrak kemudian diekstraksi dengan kloroform (4x25 mL)
menggunakan corong pisah sehingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan kloroform
(bawah) dipisahkan dan lapisan air (atas) diekstraksi dengan etil asetat (1x25 mL)
dan terbentuk 2 lapisan. Lapisan etil asetat 1 (atas) dipisahkan dan lapisan air
(bawah) diambil dan dipekatkan dengan waterbath (Makkar, 1998).
3.3.7 Uji Fitokimia Ekstrak
3.3.7.1 Flavonoid
Sebanyak kurang lebih 500 mg ekstrak ditambah 100 ml air panas
kemudian dididihkan selama 5 menit, disaring sehingga diperoleh filtrat yang
digunakan sebagai larutan percobaan. 5 ml larutan percobaan ditambahkan serbuk
Mg dan 1 ml HCl pekat. Selanjutnya ditambahkan amil alkohol dikocok dengan
kuat dan dibiarkan memisah. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga
dalam larutan amil alkohol menunjukkan adanya senyawa golongan flavonoid
(DepKes, 1980).
3.3.7.2 Alkaloid
Sebanyak 500 gram ekstrak ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml
air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan
disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk test alkaloida sebagai berikut:
 15

a. Filtrat sebanyak 1 mL ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Bouchardat,

reaksi positif ditandai dengan terbentuknya endapan berwarna coklat sampai
hitam.
b. Filtrat sebanyak 1 mL ditambah dengan 2 tetes pereaksi Dragendorff, reaksi
positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau jingga.
c. Filtrat sebanyak 1 mL ditambahkan dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer,
reaksi positif ditandai dengan terbentuknya endapan menggumpal berwarna
putih atau kuning (DepKes, 1980).
3.3.7.3 Saponin
Sekitar kurang lebih 500 mg ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan dan kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik (jika zat yang diperiksa berupa sediaan cair, diencerkan 1 ml
sediaan yang diperiksa dengan 10 ml air dan dikocok kuat-kuat selama 10 menit).
Reaksi positif jika terbentuk buih yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit,
setinggi 1 cm sampai 10 cm. Pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih
tidak hilang (DepKes RI, 1979).
3.3.7.4 Tanin
Ekstrak dilarutkan dengan air, alkohol atau aseton. Larutan tanin
mengendap dengan penambahan logam berat atau gelatin (protein) 1 % dalam
natrium klorida 10 %. Sampel ditambahkan larutan garam feri (besi), dan akan
menunjukkan reaksi positif warna biru hitam (Hanani, 2014).
3.3.7.5 Uji Kualitatif Tanin Ekstrak Daun Binahong
a. Ekstrak (hasil ekstraksi aseton : air) dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi
masing-masing sebanyak 3 mL. Ekstrak pada tabung pertama direaksikan
dengan 3 tetes larutan FeCl3 1 %. Jika ekstrak mengandung senyawa tanin
akan menghasilkan warna hijau kehitaman atau biru tua. Pada tabung kedua
ditambahkan dengan larutan gelatin jika terbentuk endapan putih maka positif
mengandung tanin (Hayati, dkk 2009).
b. Lapisan air 1 dari prosedur 3.6 dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi masing-
masing sebanyak 3 mL. Ekstrak pada tabung pertama direaksikan dengan 3
tetes larutan FeCl3 1 %. Jika ekstrak mengandung senyawa tanin akan
 16

menghasilkan warna hijau kehitaman atau biru tua. Pada tabung kedua
ditambahkan dengan larutan gelatin jika terbentuk endapan putih maka positif
mengandung tanin (Hayati, dkk 2009).
c. Lapisan air 2 dari prosedur 3.3.5 dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi
masing-masing sebanyak 3 mL. Ekstrak pada tabung pertama direaksikan
dengan 3 tetes larutan FeCl3 1%. Jika ekstrak mengandung senyawa tanin
akan menghasilkan warna hijau kehitaman atau biru tua. Tabung kedua
ditambahkan dengan larutan gelatin jika terbentuk endapan putih maka positif
mengandung tanin (Hayati, dkk 2009).

3.4 Isolasi Senyawa Tanin dengan KLT analitik

Lempeng alumunium silika gel GF254 Merck dipanaskan dalam oven
selama 10 menit, disiapkan dengan ukuran panjang 10 cm dan lebar 3 cm. Ekstrak
kental yang telah dilarutkan dengan aseton : air (7:3) ditotolkan pada lempeng tepi
bawah dan diangin-anginkan beberapa saat. Lempeng dimasukkan ke dalam
chamber yang berisi eluen yaitu campuran homogen lapisan bawah pelarut antara
n-butanol : asam asetat : air (4:1:5) (Sa’adah, 2010). Setelah gerakan larutan
pengembang sampai pada garis batas, elusi dihentikan dan dikeringkan. Noda
yang terbentuk masing-masing diukur nilai Rf nya. Noda yang terbentuk diperiksa
dengan lampu UV-Vis pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.

3.5 Isolasi Senyawa Tanin dengan KLT Preparatif

Lempeng preparatif silika gel 60 F254 Merck disiapkan dengan ukuran
panjang 20 cm dan lebar 20 cm. Ekstrak kental yang telah dilarutkan dengan
aseton : air (7:3) ditotolkan sepanjang plat pada jarak 1cm dari garis bawah dan
1cm dari garis tepi, kemudian diangin-anginkan beberapa saat. Lempeng
dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen n-butanol : asam asetat : air
(4:1:5) yang memberikan pemisahan terbaik pada KLT analitik (Sa’adah, 2010).
Setelah gerakan larutan pengembang sampai pada garis batas, elusi dihentikan.
Noda yang terbentuk masing-masing diukur nilai Rf nya. Noda yang terbentuk
diperiksa dengan lampu UV-Vis pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
 17

3.6 Identifikasi Menggunakan KLT Dua Dimensi

Isolat yang diperoleh kemudian ditotolkan pada lempeng KLT G60 F254,
dielusi 2 eluen dengan tingkat kepolaran dan arah yang berbeda. Hasil elusi
diamati menggunakan sinar ultra violet 254nm. Hasil pengamatan yang
menunjukkan satu bercak tunggal menandakan senyawa isolat tunggal (Harborne,
1984).

3.7 Identifikasi Senyawa Tanin dengan Spektrofotometri UV-Vis

Isolat yang menunjukkan hasil positif mengandung tanin yang diperoleh
dari hasil KLT preparatif dilarutkan dengan aseton : air (7:3) dan disentrifugasi,
selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis. Isolat sebanyak 2 ml
dimasukkan ke dalam kuvet spektrovotometer UV-Vis dan diidentifikasi nilai
absorbansi pada panjang gelombang 200-500 nm (Rosyda, dkk.,2010).

3.8 Identifikasi Gugus Fungsi dengan Spektrofotometer FTIR

Isolat yang menunjukkan hasil positf mengandung tanin yang diperoleh
dari hasil KLT preparatif diidentifikasi dengan menggunakan spektrofotometer
FTIR. 0,2 gram pellet KBr ditambahkan dengan 1 tetes isolat yang diduga
senyawa tanin, dekeringkan kemudian diidentifikasi dengan Spektrofotometer
FTIR dengan panjang gelombang 4000-400 cm-1 (Sa’adah, 2010).