Laporan Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

I. Judul Percobaan : Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

II. Mulai Percobaan : Senin/14 Oktober 2012
Selesai Percobaan : Senin/14 Oktober 2012
III. Tujuan Percobaan : Menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan
kromatografi kertas
IV. Tinjauan Pustaka :
Asam Amino
Asam amino adalah senyawa organik yang memiliki gugus fungsional karboksil (-
COOH) dan amina (biasanya –NH2). Dalam biokimia, seringkali pengertiannya dipersempit :
keduanya terikat pada atom karbon (C) yang sama dan disebut atom C alfa. Gugus karboksil
memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa.
Struktur umum dari asam amino :

Dimana R adalah gugus fungsi yang menentukan jenis dari asam amino. Semua asam
amino yang ditemukan pada protein memiliki ciri yang sama, yaitu adanya gugus karboksil dan
amina yang diikat pada atom karbon yang sama. Struktur asam amino secara umum adalah satu
atom C yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH2), gugus karboksil (COOH), atom
hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping
yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya.
Atom C pusat tersebut dinamai atom Cα ("C-alfa") sesuai dengan penamaan senyawa
bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung dengan gugus karboksil.Oleh karena
gugus amina juga terikat pada atom Cα ini, senyawa tersebut merupakan asam α-amino.
 Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai samping tersebut
menjadi empat kelompok.Rantai samping dapat membuat asam amino bersifat asam lemah, basa
lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika nonpolar. Jenis- jenis asam amino diantaranya :
Asam amino alifatik sederhana
Glisina (Gly, G) Alanina (Ala, A)
Valina (Val, V) Leusina (Leu, L)
Isoleusina (Ile, I)
Asam amino hidroksi-alifatik
Serina (Ser,S) Treonina (Thr, T)
Asam amino dikarboksilat (asam)
Asam aspartat (Asp,D) Asam Glutamat (Glu, E)
Amida
Asparagina (Asn, N) Glutamina (Gln,Q)
Asam Amino basa
Lisina (Lys, K) Arginina (Arg, R)
Histidina (His, H),
memiliki gugus siklik
Asam Amino dengan sulfur
Sisteina (Cys, C) Metionina (Met, M)
Prolin
Prolina (Pro, P), memiliki
gugus siklik
Asam amino aromatic
Fenilanilina (Phe, F) Tirosina (Tyr, Y)
Triptofan (Trp,W)
Fungsi asam amino antara lain penyusun protein, termasuk enzim, kerangka dasar
sejumlah senyawa penting dalam metabolism.
Kromatografi Kertas Dalam Analisis Campuran Asam Amino
Untuk mengetahui jenis-jenis dari asam amino yang terkandung dari suatu bahan/sampel,
biasanya digunakan metode kromatografi kertas.Kromatogrfi kertas diterapkan untuk analisis
campuran asam amino karena asam amino memiliki sifat yang larut dalam air dan tidak mudah
menguap sehingga dapat dipisahkan melaui perpindahan fasa gerak (eluen) pada fasa diam
(adsorben).Asam amino akan terbawa oleh fasa gerak dan akan mengendap atau menempel pada
fasa diam (adsorben) setelah menempuh jarak tertentu.
 Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang
akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian
dasar kertas saring dicelupkan ke dalam pelarut yang mengisi dasar wadah.Setiap asam amino
bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu.Setiap jenis asam amino akan selalu menempuh
jarak yang khas dari masing-masing asam amino asalkan jenis kertas, eluen, dan pelarutnya
sama. Dari dasar inilah, dapat dibandingkan jarak tempuh eluen dari masing-masing asam amino
yang telah diketahui dengan jarak tempuh eluen yang timbul pada sampel.
Jarak tempuh relative pada pelarut disebut sebagai Rf, untuk tiap senyawa berlaku rumus
:
Rf = jarak yang ditempuh oleh senyawa/jarak yang ditempuh oleh pelarut
Larutan Ninhidrin kemudian disemprotkan pada kertas saring setelah pelarut mencapai
batas atas dan menghasilkan senyawa berwarna, utamanya coklat dan ungu.Asam-asam amino
berinteraksi dengan ninhidrin membentuk produk yang disebut ungu ruhmann.Reaksi ini
biasanya digunakan sebagai uji bercak untuk mendeteksi adanya asam amino pada kertas
kromatografi. Adapun reaksi umum secara keseluruhan adalah :
Ninhidrin + H3N+-CHR-COO-  anion ungu + RCHO + CO2 + 3H2O + H+

V. Alat dan Bahan :

 Alat:
- Kertas kromatografi
- Pipa kapiler
- Gelas dasar datar
- Benang
- Botol semprot
- Oven
- Kaca Penutup
 Bahan:
- Asam asetat glacial
- n-butanol
- aquades
- larutan asam amino standar
 - HCl pekat
- Larutan sampel
VI. Cara Kerja/Alur Kerja

1. Pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak)

2. Menentukan komponen asam amino

 Hasil

VIII. Analisis Data

1. Pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak)
Prinsip kromatografi adalah adanya perbedaan distribusi antara fasa gerak dan diam.
Eluen ini digunakan sebagai fasa geraknya.Maka pada langkah awal bertujuan untuk pembuatan
larutan pengemulsi atau eluen yang digunakan sebagai fase gerak.Mula-mula 25 mL n-butanol
ditambahkan 6 mL asam asetat glasial dan 25 mL aquades.Ketiga larutan jernih, tak
berwarna.Ketiga larutan yang bercampur ini dinamakan eluen yang akan berfungsi sebagai fasa
gerak dalam kromatografi lapis tipis, eluen ini bercampur dan menjadi dua lapisan, yaitu lapisan
atas dan bawah. Kemudian menuangkan larutan tersebut pada lemari kromatografi (chamber)
yang berupa gelas dan diselubungi kertas saring di dalamnya hingga tertutup seluruh dinding
gelas pada bagian dalam. Kemudian menutup chamber yang telah berisi larutan tersebut dengan
kaca sehingga suasana dalam chamber tersebut menjadi jenuh akan uap dari larutan tersebut.
Tanda bahwa suasana dalam chamber telah jenuh adalah kertas saring yang berada dalam
chamber telah menjadi basah secara keseluruhan.Tujuan penjenuhan chamber ini adalah untuk
menjadikan eluen memenuhi chamber dan fungsinya sebagai fasa gerak dalam kromatografi
berjalan dengan baik. Jika eluen tidak memenuhi chamber, maka distribusi daripada fasa diam
tidak akan dapat berjalan sehingga kromatografi gagal dan hasil yang diperoleh tidak teliti.
Padahal dalam kromatografi bertujuan untuk menentukan senyawa apa yang terdapat dalam
sampel dengan ditandai adanya bercak/noda yang menunjukkan suatu senyawa. Tiap senyawa
memiliki distribusi yang berbeda-beda dalam suatu fasa gerak.
Pemilihan eluen sangat penting karena jika eluen yang digunakan memiliki konsentrasi
yang tidak sesuai dengan sampel yang akan dipisahkan, maka kromatografi dapat tidak berjalan.
Jika eluen terlalu polar akan menyebabkan seluruh noda yang ditotolkan pada kertas naik sampai
batas atas tanpa mengalami pemisahan, jika eluen kurang polar, maka noda yang ditotolkan tidak
akan bergerak sama sekali.
2. Menentukan komponen asam amino
Percobaan ini bertujuan untuk mengidentifikasi asam-asam amino yang terdapat dalam
sampel.Untuk tujuan identifikasi tersebut, maka kami menggunakan beberapa standar larutan
yang mengandung asam amino yaitu Lysin (larutan jernih, ada endapan putih), Sistein (larutan
jernih, ada endapan putih keruh), dan Tyrosin (larutan jernih, ada endapan putih keruh).Lysin
berlabel botol A, Sistein berlabel botol B, dan Tyrosin berlabel botol C.Mula-mula adalah
persiapan, kertas kromatografi dalam hal ini menggunakan kertas saring Whatman berukuran 7 x
12,5 cm diberi batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1 cm. Kemudian memberi tanda titik A, B, C
dan D dengan pensil sebagai titik menotolkan larutan. Masing-masing titik ditotoli larutan yaitu :

Titik A : Larutan Lysin

Titik B : Larutan Sistein
Titik C : Larutan Tyrosin
Titik D : Larutan Sampel

Masing-masing titik berjarak 1 cm dan penotolan menggunakan pipa kapiler dan

dilakukan penotolan sebanyak 5x. Diameter noda pada totolan tidak melebihi diameter 0,4 cm.
Setiap penotolan, noda totolan dikeringkan terlebih dahulu sebelum ditotolkan lagi. Tujuan
dilakukannya penotolan secara berulang kali supaya noda totolan tampak lebih jelas.Setiap
totolan pada titik A, B, C, dan D menghasilkan noda-noda tak berwarna pada kertas
kromatografi. Totolan pada titik A, B, C, dan D ini adalah fasa diam yang akan dielusi oleh eluen
yang telah dibuat pada percobaan pertama dalam chamber.

Persiapan kertas kromatografi telah selesai, kemudian langkah berikutnya adalah

memasukkan kertas kromatografi yang telah dilipat bagian ujungnya dan diberi tali ke dalam
gelas dengan hati-hati ke dalam chamber / lemari kromatografi dan bagian tepi pelat tidak
menyentuh dinding chamber hingga bagian bawah kertas kromatografi tercelup eluen tetapi tidak
sampai menyentuh batas bawah. Kemudian menutup kembali chamber tersebut dengan kaca
supaya terjadi elusi oleh eluen (fasa gerak). Berikutnya adalah mengamati proses kromatografi,
yaitu terjadinya perambatan eluen pada kertas saring hingga mencapai batas atas. Setelah eluen
mencapai batas atas kertas saring, maka kertas saring dikeluarkan.Jarak tempuh eluen pada
kertas saring adalah 6 cm (jarak dari batas bawah sampai batas atas). Hasil dari proses
kromatografi ini adalah kertas saring yang telah basah oleh perambatan eluen. Warna kertas
saring tetap putih dan belum timbul noda/bercak.Berikutnya, larutan disemprot dengan ninhidrin
yaitu larutan untuk mengidentifikasi adanya asam amino dengan menunjukkan perubahan warna
menjadi ungu.Kemudian kertas saring dikeringkan dalam oven untuk memperoleh noda-noda
bercak asam amino dengan ditandai adanya noda berwarna yang timbul secara jelas pada suatu
jarak yang ditempuh oleh eluen.
Setelah dikeringkan dalam oven, distribusi larutan berjalan lurus dan baik. Pada titik A
(totolan larutan Lisin), muncul noda berwarna ungu dengan jarak noda 0,3 cm dari batas bawah.
Pada titik B (totolan larutan sistein), muncul noda berwarna ungu dengan jarak noda 1,3 cm dari
batas bawah dan pada titik C (totolan larutan tyrosin), muncul noda berwarna ungu dengan jarak
noda 1 cm dari batas bawah. Untuk titik D yang merupakan totolan sampel (sampel D) yang
dianalisis kandungan asam aminonya muncul dua noda berwarna ungu dengan jarak noda 0,2
cm dan 1,1 cm dari batas bawah, hal ini menunjukkan sampel D terdiri dari campuran dua asam
amino yang berbeda. Dari perhitungan nilai Rf(pada lampiran) diperoleh nilai yaitu pada titik A
(larutan lysin), Rf = 0,05 ; pada titik B (larutan Sistein), Rf = 0,22 ; pada titik C (larutan
Tyrosin), Rf = 0, 17, dan pada titik D, (larutan sampel D)Rf A = 0, 03, Rf B = 0,18. Rf A pada
sampel D memiliki nilai yang mendekati Rf larutan lysine, dan Rf A pada sampel D memiliki
nilai yang mendekati Rf larutan Tyrosin
Dari nilai Rf tersebut maka dapat dianalisis sampel D mengandung asam amino lysin dan Sistein
karena memiliki nilai yang hampir serupa dengan nilai Rf dari larutan Lysin dan larutan sistein.

IX. Diskusi :
Pada percobaan kedua, bercak noda setelah disemprotkan ninhidrin dan dalam oven tidak
tampak begitu jelas dan cenderung tailing (berekor). Hal ini menyulitkan dalam penentuan nilai
Rf baik pada titik A, B, C ataupun D sehingga penentuan kandungan asam amino dalam sampel
menjadi lebih sulit. Padahal bercak noda yang tampak jelas akan menunjukkan Rf yang akurat
dan sebenarnya dan menunjukkan kandungan suatu senyawa (tiap senyawa memiliki nila Rf yang
berbeda). Hal ini mungkin karena kertas saring mungkin masih basah atau mengandung air
sehingga mengganggu proses distribusi fasa gerak terhadap fasa diam. Hal ini dikarenakan
kehadiran air yang merupakan senyawa polar dapat menarik sampel sehingga tidak dapat
 dipisahkan dengan sempurna. Selain itu, juga dicurigai eluen yang digunakan kurang polar
sehingga tidak memisahkan asam amino dengan sempurna.Untuk mencegah hal tersebut
mungkin sebaiknya kertas saring yang digunakan dalam kromatografi dikeringkan terlebih
dahulu dalam oven untuk menghilangkan kandungan airnya.
X. Kesimpulan
Asam-asam amino yang terkandung dalam sampel (sampel D) adalah Lysin dan Tyrosin,
hal ini dikarenakan pada sampel terdapat dua bercak noda dan memiliki nilai Rf( Rf A = 0, 03,
Rf B = 0,18) yang hampir sama dengan larutan standar yang mengandung Lysin ( R f = 0,05 ) ;
dan Tyrosin (Rf = 0, 17).

XI. Jawaban Pertanyaan :

1) Keuntungan dan kerugian dari metode pemisahan dengan Kromatografi Kertas :

 Keuntungan :
a) Pada kromatografi Kertas peralatan yang dipakai tidak perlu alat-alat yang teliti. Hasil-hasil
yang baik dapat diperoleh dengan peralatan dan materi-materi yang sangat sederhana.
b) Senyawa-senyawa yang terpisahkan dapat dideteksi pada kertas dan dapat segera
diidentifikasikan
c) Harganya lebih murah jika dibandingkan dengan KLT
d) kromatografi kertas preparatif diperlukan kertas yang lebih besar dari pada untuk analisis,
Keuntungannya yaitu beban langan bilangan Rf menjadi besar sehingga pengukuran Rf
merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan senyawa baru.
 Kerugian :
a) Tidak bisa melakukan analisis kuantitatif pada komponen-komponen sampel, hanya terbatas
pada analisis kualitatif saja.
b) Waktunya lebih lama dari pada adsorben lain, tapi lebih singkat dari pada KLT
c) Tidak bisa menggunakan pereaksi H2SO4 karena selulosa akan terdekomposisi

2) Metode kromatografi kertas dapat digunakan baik untuk melakukan analisis yang bersifat
kuantitatif maupun kualitatif.
 Analisis Kuantitatif dilakukan berdasarkan perbandingan Rf dari zat sampel dengan harga Rf zat
standar. Agar analisis kuantitatif dapat berhasil baik perlu diperhatikan hal – hal berikut :
a) Kondisi percobaan harus sama, karena harga Rf tergantung pada kondisi tersebut
b) Adanya noda pada kromatogram belum berarti adanya zat tunggal dalam sampel
c) Harus dicoba dengan berbagai pelarut
 Analisis Kualitatif dilakukan dengan mengidentifikasi komponen asam amino dari sampel
terhadap suatu larutan asam amino yang telah diketahui sebelumnya berdasarkan nilai Rf, Pada
percobaan ini ditandai dengan adanya warna ungu serta dari harga Rf sampel yang diselidiki lalu
dibandingkan dengan harga Rf standarnya.

3) Faktor-faktor yang menentukan harga Rf yaitu :

a) Pelarut  disebabkan oleh pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat
kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan- perubahan harga Rf.
b) Kehadiran ion lain, misalnya adanya klorida dalam pemisahan yang dilakukan dengan larutan-
larutan nitrat
c) Sifat dari campuran  berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama
dari fasa tetap dan bergerak. Sifat campuran hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari
kelarutan satu terhadap lainnya hingga berpengaruh juga terhadap harga Rf
d) Kertas  pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang
berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran dan mempengaruhi
kesetimbangan partisi.
e) Suhu  perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
f) Ukuran dari bejana  volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer sehingga
mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana
besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut
sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan
kompisisi mempengaruhi harga Rf.
g) Kualitas adsorben
h) Ketebalan lapisan , semakin tebal lapisan Rf nya semakin kecil
i) Kejenuhan ruang kromatografi
Lampiran Perhitungan
Perhitungan Rf :
Rf = Jarak tempuh noda / Jarak tempuh pelarut
Diketahui : - jarak tempuh pelarut = 6 cm
- jarak tempuh noda pada titik A = 0,3 cm
- jarak tempuh noda pada titik B = 1,3 cm
- jarak tempuh noda pada titik C = 1 cm
- jarak tempuh noda pada titik D = 0,2 cm dan 1,1 cm
Pada titik A (larutan Lysin):
Rf = 0,3 cm / 6 cm = 0,05
Pada titik B (larutan Sistein):
Rf = 1,3 cm / 6 cm = 0,22
Pada titik C (larutan Tyrosin):
Rf = 1 cm / 6 cm = 0, 17
Pada titik D (larutan sampel D)
Rf A = 0,2 cm / 6 cm = 0, 03
Rf B = 1,1 cm / 6 cm = 0,18

LAMPIRAN FOTO
 Sampel yang tersedia Asam amino standar yang
padapercobaan ini untuk digunakandalam percobaan ini.
diidentifikasi asam amino yang Lysin, Cystein, Tyrosin
terkandung di dalamnya.
 Hasil kromatografi dari asamamino. A adalah
Lysin, B adalah Cystein, C adalah Tyrosin
,dan D adalahSampel D yang diidentifikasi

DAFTAR PUSTAKA

 Lehninger, Albert L. 1993. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Terjemahan.Jakarta : Erlangga

 Tim. 2012. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya : Universitas Negeri Surabaya-FMIPA-
Jurusan Kimia
 Anonim.2012. Asam Amino, (Online).(http://id.wikipedia.org/wiki/asamamino, diakses pada
Minggu, 14-10-2012).
 Takeuchi, Yoshito. 2009. Kromatografi, (Online). (http://www.chem-is-try.org/materi-
kimia/Kimia_dasar/pemurnian_material/kromatografi, diakses pada Minggu, 14-10-2012).
 Mimir. 2011. Cara Menganalisis Kromatografi kertas. (Online). http://robbaniryo.com/ilmu-
kimia/cara-menganalisis-kromatografi-kertas/, diakses pada tanggal 19 Oktober 2012.