A.

Definisi DNA Rekombinan

Menurut Cohen dan Boyer (1980: DNA rekombinan (rDNA) adalah bentuk DNA
buatan yang dibuat dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang tidak akan biasanya
terjadi bersama-sama. Dalam hal modifikasi genetik, itu adalah diciptakan melalui
pengenalan DNA yang relevan ke dalam DNA organisme yang ada, seperti plasmid bakteri,
untuk kode untuk atau mengubah sifat berbeda untuk tujuan tertentu, seperti resistensi
antibiotik (News Medical.Net)
Robert (2009) mengatakan bahwa DNA rekombinan adalah DNA yang mengalami
perubahan karena penyisipan suatu sekuens deuksinukleotida yang sebelumnya tidak terdapat
dalam molekul DNA yang sudah ada dengan cara enzimatik atau kimiawi. Rekayasa genetika
adalah serangkaian teknik untuk memodifikasi dan merekomendasi gen dari berbagai
organisme yang berbeda yang juga disebut teknologi DNA rekombinan.
Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang
lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam
suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen.
Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA
rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa
teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan
cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk
terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan
sebagai sel inang. Rekayasa genetika dapat memberikan hasil yang sangat menguntungkan.
Sebagai contoh pasien yang menderita diabetes tidak mampu membentuk hormon insulin
untuk mengatur kadar gula dalam darah. Oleh karena itu, pasien membutuhkan suntikan
insulin sebagai tambahan. Dengan teknik rekayasa genetika, para peneliti berhasil memaksa
mikroorganisme (bakteri) untuk membentuk insulin yang mirip dengan insulin manusia
(suryo, 2001).
B. Teknologi DNA Rekombinan
Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik kejuruteraan genetik yang melibatkan
penggunaan DNA rekombinan - yaitu DNA yang menggabungkan maklumat genetik dua
species organisme yang berlainan. Jika gen-gen ini digabungkan dalam sel telur atau sel
sperma supaya maklumat genetik ini boleh diturunkan kepada progeni, maka hasil daripada
gabungan ini dinamakan organisme transgenik.
Penghasilan DNA rekombinan melibatkan tiga proses:
1. Manipulasi DNA in vitro (luar sel organisma)
2. Gabungan, atau rekombinasi DNA sesuatu organisma dengan DNA bakteria dalam plasmid
atau bakteriofak
3. Pengklonan, atau teknik untuk mereplikasi progeni yang membawa DNA rekombinan.
Proses-proses diatas pertama kali dilakukan oleh Paul Berg dan A.D. Kaiser pada
tahun 1972. Mereka berjaya memasukkan DNA prokariot kedalam bakteria, kemudian oleh
S.N. Cohen dan Herbert Boyer yang berjaya menggabungkan DNA organisme eukariot
bersama plasmid bakteria.
Komponen yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan diantaranya enzim
restriksi untuk memotong DNA, enzim ligase untuk menyambung DNA dan vektor untuk
menyambung dan mengklonkan gen di dalam sel hidup, transposon sebagai alat untuk
melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda, pustaka genom untuk menyimpan
gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan, enzim transkripsi balik untuk membuat DNA
berdasarkan RNA, pelacak DNA atau RNA untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang
diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Vektor yang sering digunakan diantarnya
plasmid, kosmid dan bakteriofag. Enzim restriksi, digunakan untuk memotong DNA. Enzim
restriksi mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya empat
sampai enam pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan nama enzim endonuklease
restriksi.
Ada dua bagian terpenting yang selalu digunakan dalam rekayasa genetika yaitu
sebagai berikut :
1. Enzim seluler/Cellular Enzymes
Enzim yang dipakai dalam memanipulasi DNA diantaranya adalah :
a. enzim Endonuklease, yaitu enzim yang mengenali batas-batas sekuen nukleotida spesifik dan
berfungsi dalam proses restriction atau pemotongan bahan-bahan genetik. Penggunaan enzim
ini yang paling umum antara lain pada sekuen palindromik. Enzim ini dibentuk dari bakteri
yang dibuat sedemikian rupa sehingga dapat menahan penyusupan DNA, seperti genom
bacteriophage.
b. DNA polimerisasi, yaitu enzim yang biasa dipakai untuk meng-copy DNA. Enzim ini
mengsintesis DNA dari sel induknya dan membentuk DNA yang sama persis ke sel induk
barunya. Enzim ini juga bisa didapatkan dari berbagai jenis organisme, yang tidak
mengherankan, karena semua organisme pasti harus meng-copy DNA mereka.
c. RNA polimerisasi yaitu enzim yang berfungsi untuk ’membaca sekuen DNA dan
mengsintesis molekul RNA komplementer. Seperti halnya DNA polimerisasi, RNA
 polimerisasi juga banyak ditemukan di banyak organisme karena semua organisme harus
’merekam’ gen mereka.
d. DNA ligase merupakan suatu enzim yang berfungsi untuk menyambungkan suatu bahan
genetik dengan bahan genetik yang lain. Contohnya saja, enzim DNA ligase ini dapat
bergabung dengan DNA atau RNA dan membentuk ikatan phosphodiester baru antara DNA
atau RNA yang satu dengan lainnya.
e. Reverse transcriptases adalah enzim yang berfungsi membentuk blue-print dari molekul
RNA membentuk cDNA (DNA komplementer). Enzim ini dibuat dari virus RNA yang
mengubah genom RNA mereka menjadi DNA ketika mereka menginfeksi inangnya. Enzim
ini biasa dipakai ketika bertemu dengan gen eukariotik yang biasanya terpisah-pisah menjadi
potongan kecil dan dipisahkan oleh introns dalam kromosom.
2. Vektor natural/ Natural Vectors
Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi DNA di luar sel, para ilmuwan dalam
bioteknologi harus bisa membuat suatu tempat yang keadaannya stabil dan cocok dengan
tempat DNA yang dimanipulasi. Sekali lagi, alam telah memberikan solusi dari masalah ini.
Vektor disini bisa diartikan sebagai alat yang membawa DNA ke dalam sel induk barunya.
Agar suatu metode dalam rekayasa genetika dianggap berhasil, di dalam vektor, DNA hasil
rekombinan seharusnya benar-benar hanya dibawa setelah sebelumnya DNA rekombinan
digabungkan dengan DNA vektor melalui enzim ligase. Namun di dalam vektor, DNA
rekombinan tidak termutasi lagi membentuk DNA dengan sifat baru. Contoh dari vektor
natural dari alam adalah plasmid dan virus atau bacteriophage (Witarto, 2005).
Adapun teknik pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai berikut:
1. Teknik mengisolasi DNA
2. Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim retriksi endonuklease
3. Teknik menggabung/ menyambung DNA dengan menggunakan enzim ligase
4. Teknik memasukkan DNA kedalam sel hidup (vektor)
5. Vektor berkembang dengan seleksi DNA yang direkayasa.
Gambar 1: mekanisme DNA Rekombinan
1. Isolasi DNA yang diawali dengan melakukan perusakan serta penghilangan dinding sel.
Dalam proses ini dapat dilakukan secara mekanis ataupun dengan cara enzimatis. Setelah
perusakan sel telah dilakukan, langkah selanjutnya adalah pelisisan sel hal ini dapat
dilakukan dengan menggunakan buffer nonosmotik, serta deterjen yang kuat seperti triton X-
100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Remukan sel yang diakibatkan oleh lisisnya sel
dibuang dengan melakukan sentrifugasi sehingga bias dibedakan antara bagian yang rusak
serta organel target yang pada akhirnya didapatlkan DNA yang nantinya dilakukan
pemurnian dengan penambahan amonium asetat dan alcohol.
 2. Pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid dilakukan dengan enzim
restriksi. Ada dua macam enzim restriksi yaieu enzim restriksi tipe I dan enzim restriksi
tipe II. Enzim restriksi tipe II mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:
a. mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul
DNA.
b. memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat
pengenalannya.
c. menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa. Berdasarkan
tempat hasil pemotongan, fragmen-fragmen DNA memiliki dua macam ujung yaitu:
Ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif, terjadi jika tempat pemotongan pada kedua
untai DNA terpisah sejauh beberapa pasang basa, sehingga menghasilkan fragmen-fragmen
dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama
panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu
sama lain.
Ujung tumpul (blunt end), terjadi jika tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama.
Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena
masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Penyatuan dua fragmen DNA ujung
tumpul sulit dilakukan sehingga memerlukan perlakuan tambahan, misalnya pemberian
molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase.
3. Tahap selanjutnya adalah penyambungan molekul DNA. Ada tiga cara yang dapat
digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi
menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari
sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4
ligase. Ketiga yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai
tunggal homopolimerik 3’. Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan
tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung
lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan
tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan
waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam).
4. Setelah tahap penyambungan molekul DNA, dilakukan analisis terhadap hasil pemotongan
DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut.
menggunakan teknik elektroforesis. Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-
fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk
molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar
dapat diperbanyak dengan cepat. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam
sel inang dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan
sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
5. Tahap selanjutnya adalah seleksi transforman dan seleksi rekombinan. Oleh karena DNA
yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus
melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan.
Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus
dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen
sisipan atau gen yang diinginkan. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi
setelah transformasi dilakukan, yaitu:
1. Sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal.
2. Sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan
3. Sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang
diinginkan.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya
 dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau
polymerase chain reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat
dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni (Tjahjoleksono, 2009).
Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu:
1. Transformasi : transfer DNA yang umumnya berasal dari satu sel bakteri ke dalam sel yang
berbeda. Prosesnya adalah ketika sebuah sel bakteri pecah atau lisis maka DNA sirkular akan
terlepas ke lingkungan. Efisiensi transformasi bergantung pada kompetensi sel.
2. Konjugasi : merupakan pemindahan materi genetik berupa plasmid secara langsung melalui
kontak sel dengan membentuk struktur seperti jembatan diantara dua sel bakteri yang
berdekatan. Umumnya terjadi pada bakteri gram negatif.
3. Transduksi : transfer materi genetik dari satu bakteri ke bakteri lainnya dengan menggunakan
virus bakteri sebagai vektor. Transfer ini menggunakan prinsip dasar dari galur donor yang
menyediakan DNA bagi galur resipien. Perbedaan utamanya dengan transfer DNA lainnya
adalah DNA ditransfer melalui perantaraan bakteriofag.

C. Manfaat Teknologi DNA Rekombinan

Berbagai penelitian tentang DNA rekombinan banyak gunakan dan dimanfaatkan
dalam berbagai bidang, diantaranya :
1. Bidang industri
Penelitian rekayasa genetika di bidang industry sedang meningkat dengan cepat.
Berbagai usaha yang telah giat dilakukan misalnya :
1. Menciptakan bakteri yang dapat melarutkan logam-logam langsung dari dalam bumi
2. Menciptakan bakteri yang dapat menghasilkan bahan kimia
Mencipatkan bakteri yang dapat menghasilkan bahan mentah kimia seperti etilen yang
diperlukan untuk pembuatan plastic
2. Bidang Pertanian
Beberapa manfaat rekayasa genetika dalam bidang pertanian diantaranya adalah:
1. Mengganti pemakaian pupuk nitrogen yang banyak dipergunakan tapi mahal harganya, oleh
fiksasi nitrogen secara alamiah. Bakteri tanah Rhizobium sp dapat mengadakan infeksi ke
dalam akar dari tanaman family Leguminosae. Infeksi ini menghasilkan bintil akar dan
bakteri yang terdapat di dalamnya dapat mengikat zat lemas bebas dari udara untuk di
ubahnya menjadi nitrogen yang dapat diambil dan digunakan oleh tanaman tersebut.
2. Teknik rekayasa genetika mengusahakan tanaman-tanaman (terutama yang mempunyai arti
ekonomi) yang tidak begitu pekah terhadap penyakit yang disebabkan oleh bakteri, jamur dan
cacing.
3. Mengusahakan tanaman-tanaman yang mampu menghasilkan peptisida sendiri.
3. Bidang Peternakan
1. Telah diperoleh vaksin-vaksin untuk melawan penyakit mencret ganas yang dapat
mematikan anak-anak babi
2. Sudah dipasarkan vaksin yang efektif terhadap penyakit kuku dan mulut, yaitu penyakit
ganas dan sangat menular pada sapi, domba, kambing, rusa dan babi
4. Bidang Kedokteran
Gen-gen bagi beberapa protein yang dibutuhkan dalam bidang kedokteran yang
dibutuhkan dalam bidang kedokteran yaitu pembuatan insulin manusia oleh bakteri
Eschrechia coli untuk pengobatan penyakit diabetes (Wikipedia.org).