Pembahasan PCR….

Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polymerase adalah metode
enzimatis untuk melipatgandakan (amolication) secara eksponensial suatu sekuen nukleotida
tertentu secara in vitro. Prinsip kerja dari PCR menggandakan segmen tertentu dengan
memanfaatkan enzim sebagai pengisiasi replikasi. Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini
yaitu untuk mengetahui suatu teknik pemeriksaan menggunakan PCR. Metode PCR juga dapat
melipatgandakan suatu molekul DNA (110 bp/5x10-19) sebesar 200.000 kali setelah dilakukan
20 siklus reaksi selama 220 menit. Dimana setiap siklus ini terdiri dari 3 tahap yaitu tahap
denaturasi, tahap annealing, dan tahap elongasi atau perpanjangan. Hal tersebut sesuai dengan
pernyataan Zuhriana dan Yusuf (2010) yang menyatakan bahwa ada 3 tahap yang paling penting
dalam proses PCR, yang selalu terulang dalam setiap siklus PCR diantaranya adalah tahap
denaturasi, annealing, dan perpanjangan primer.
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan bahan yang digunakan yaitu dH2O, DNA
Darah, dan Mater Mix, dimana master mix ini mengandung beberapa kompenen yang digunakan
dalam proses PCR, yaitu DNA Template, primer, DNA Polimerase, Buffer atau MgCL2, dan
dNTP. Komponen utama yaitu DNA Template, fungsi komponen ini adalah sebagai cetakan
untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama dengan. DNA Template. Komponen kedua
yaitu primer. Fungsi komponen ini adalah sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan
diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan
untuk proses eksistensi DNA. Dalam pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan
tidak terjadinya reaksi polymerase antara gen target dengan primer. Dalam proses PCR ini ada 2
digunakan primer yaitu, primer forward dan primer reverse yang bekerja pada dua untai yang
berbeda (sense dan antisense) dalam satu DNA.
Komponen ketiga yaitu DNA Polimerase. DNA Polimerase merupakan enzim yang stabil
dakam pemanasan. Fungsi komponen ini adalah sebagai katalis untuk reaksi polymerase DNA.
Komponen keempat yaitu buffer. Komponen ini berfungsi untuk menjaga keseimbangan pH
medium. Umumnya buffer PCR mengandung senyawa MgCL2 yang dimana bertindak sebagai
kofaktor dan berfungsi untuk menstimulasi aktivasi DNA Polimerase, dan dapat meningkatkan
interaksi primer dengan template yang membentuk komplek larut dan Dntp. Sedangkan
komponen yang kelima yaitu dNTP yang berfungsi sebagai campuran.
 Dalam proses PCR ini juga ada 3 tahap yang harus dilakukan. Pertama proses
Denaturasi dimana proses ini terjadi pemisahan untaian DNA dengan menggunakan temperature
suhu tinggi sekitar 90 hingga 97oC, namun pada praktikum kali ini suhu yang digunakan suhu
95oC selama 30 detik. Kedua proses annealing yang dimana proses ini merupakan penempelan
DNA primer pada salah satu untai DNA yang dilakukan pada temperature suhu 55 hingga 60oC
selama 3o detik, sehingga DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan
menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya. Dan
Tahap terakhir adalah elongasi atau pemanjangan untai DNA primer yang dibantu oleh enzim
polymerase sebagai pengkode basa nukleotida dalam memasangkan sesuai dengan pasangan basa
tersebut. Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72oC.
Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan
penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.
Adapun faktor – faktor yang mempengaruhi keberhasilan teknik amplifikasi DNA
menggunakan PCR adalah dNTP, oligonukleotida primer, DNA cetakan, komposisi larutan
buffer, jumlah siklus saat dilakukan reaksi, enzim yang digunakan, dan teknis pelaksanaan
maupun faktor non teknis lainnya. Faktor teknis yaitu pengaturan suhu yang tidak tepat yang
dapat mempengaruhi keberhasilan amplifikasi DNA menggunakan PCR. Sedangkan faktor non
teknis yaitu dalam pelaksanaan amplifikasi DNA dapat terjadi akibat kontaminasi saat
berjalannya kegiatan baik saat proses pencampuran bahan sebelum denaturasi maupun saat
dilakukannya proses denaturasi hingga ekstensi.