TINJAUAN PUSTAKA

Vitamin

Vitamin adalah komponen tambahan makanan yang berperan sangat

penting dalam gizi manusia (DEMAN, 1997). Vitamin pada umumnya dapat
dikelompokkan dalam dua kelompok yaitu vitamin yang larut dalam lemak yakni
vitamin A, D, E, K; serta vitamin yang larut dalam air seperti vitamin B dan
vitamin C (ROHMAN & SUMANTRI, 2007).

Vitamin Larut dalam Lemak

Vitamin yang larut dalam lemak merupakan molekul hidrofobik apolar,

yang semuanya adalah derivat isoprene. Vitamin yang larut dalam lemak ini
memerlukan absorbsi lemak yang normal agar vitamin tersebut dapat diabsorbsi
secara efisien. Diabsorbsi molekul vitamin tersebut harus diangkut dalam darah
yaitu oleh lipoprotein atau protein pengikat yang spesifik. Vitamin yang larut
didalam lemak adalah vitamin A, D, E, dan K.

Vitamin Larut dalam Air

Vitamin yang larut di dalam air kelompok dari vitamin B kompleks

merupakan kofaktor dalam berbagai reaksi enzimatik yang terdapat di dalam
tubuh kita. Karena kelarutannya dalamair, kelebihan vitamin ini akan
diekskresikan ke dalam urin dan dengan demikian jarang tertimbun dalam
konsentrasi yang toksik. Penyimpanan vitamin B kompleks bersifat terbatas
(kecuali kobalamin) sebagai akibatnya vitamin B kompleks harus dikomsumsi
secara teratur.Vitamin B yang penting bagi nutrisi manusia adalah Tiamin (vitamin
B1), Riboflavin (vitamin B2 ), Niasin (asam nikotinat, nikotinamida, vitamin B3),
Asam pantotenat (vitamin B5), Vitamin B6 (piridoksin, pridoksal, piridoksamin),
Biotin, Vitamin B12 (kobalamin), dan Asamfolat.
 Vitamin E

Vitamin E adalah istilah umum bagi delapan macam substansi alami yang
bersifat lemak, yaitu: 4 tocopherol dan 4 tocotrienol. Diantara delapan macam
substansi tersebut substansi α-tocopherol adalah jenis yang mempunyai aktivitas
biologi yang tertinggi dan terdapat dalam jumlah besar dalam jaringan tubuh.
Vitamin E merupakan istilah yang menunjukan kelompok senyawa trienol dimana
kelompok senyawa yang paling aktif ini adalah α-tocopherol (GOODMAN’S &
GILLMAN’S, 1991).

Gambar 1. Struktur Tokoferol dan Tokotrienol

Tokoferol berbentuk cairan berminyak yang bersifat transparan, kental,

sedikit berbau, dan mempunyai warna berkisar dari kuning muda sampai coklat
kemerahan. Tokoferol bersifat tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut
organik seperti etanol, kloroform, dan heksana (MUSALMAH et al., 2005).
 Menurut WINARNO (2002), vitamin E tahan terhadap suhu tinggi serta
asam, tetapi karena bersifat antioksidan, vitamin E mudah teroksidasi terutama
bila ada lemak yang tengik, timah dan garam besi, serta mudah rusak oleh sinar
ultraviolet. Peran utama vitamin E adalah sebagai antioksidan, dengan menerima
oksigen, vitamin E dapat membantu mencegah oksidasi. Dalam jaringan, vitamin
E menekan terjadinya oksidasi asam lemak tidak jenuh, dengan demikian akan
membantu dan mempertahankan fungsi membran sel.
Tokoferol, terutama α-tokoferol telah diketahui sebagai antioksidan yang
mampu mempertahankan integritas membran. Senyawa tersebut dilaporkan
bekerja sebagai scanvenger radikal bebas oksigen, peroksi lipid dan oksigen
singlet. Berdasarkan jumlah gugus metil pada inti aromatik, dikenal 4 tokoferol
yaitu α, δ, β, γ. Diantara ke empat bentuk tokoferol tersebut, yang paling aktif
adalah α-tokoferol. Oleh sebab itu, aktivitas vitamin E diukur sebagai α-tokoferol
(WINARSI, 2007)
Vitamin E dapat melindungi kulit dari sinar ultraviolet, dapat
menyembuhkan luka, berfungsi sebagai antioksidan, serta melindungi tubuh
akibat kelebihan vitamin A dan melindungi vitamin A dari kerusakan. Sumber
vitamin E antara lain minyak nabati, kacang-kacangan, dan biji-bijian (LAMID,
1995).

Validasi Metode

Menurut SNI 19-17025-2000, validasi metode adalah konfirmasi

pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk
suatu maksud khusus dipenuhi. Sedangkan menurut Wood et al., 1998, validasi
metode adalah proses penetapan kesesuaian sistem pengukuran untuk dapat
memberikan data analisis yang berguna.
Metode kuantitatif untuk pengujian validasi mengandung beberapa
parameter yang ditentukan yaitu: kekhususan/selektivitas, batas deteksi (LOD) , p
resisi (dibawah dalam pengulangan laboratorium dan/atau dalam laboratorium
kondisi reproducibility), linearitas dan jangkauan kerja, akurasi (dibawah dalam
pengulangan laboratorium dan di dalam laboratorium kondisi reproducibility),
recovery, ketidakpastian pengukuran, dan stabilitas. Parameter tambahan yang
ditentukan tetapi tidak begitu penting yaitu batas bawah kuantisasi (LLOQ),
kekasaran dan ketahanan (RIYANTO, 2014).

Uji Kesesuaian Sistem

Kesesuaian sistem adalah untuk memastikan bahwa prosedur analisis

didasarkan pada konsep peralatan, instrumen, elektronik dan pelaksanaan analisis
dan contoh uji merupakan suatu sistem integral (SIMEX, 2015).

Spesifisitas (Specificity)
Spesifisitas adalah kemampuan untuk menilai dengan jelas analit diantara
adanya komponen lain didalam suatu sampel. Komponen ini biasanya merupakan
impuritas, hasil urai atau matriks sampel, dan lain-lain (SIMEX, 2015).
Menurut RIYANTO (2014) bahwa selektivitas metode ditentukan dengan
membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai,
senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil
analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi.

Linearitas (Linearity)
Linieritas adalah kemampuan dari suatu metode untuk memberikan hasil
uji yang proporsional terhadap kepekatan analit dalam jangkauan kepekatan yang
ada. Linieritas merupakan korelasi antara dua variabel (konsentrasi dan
absorbansi) biasanya dinyatakan dalam koefisien korelasi yang dapat dihitung
secara statistika. Linieritas yang baik ditunjukkan dengan koefisien korelasi yang
mendekati satu. Dalam suatu penetapan, koefisien korelasi sebaiknya >0,995
(MILLER & MILLER, 1991).
Uji linieritas ini dilakukan dengan suatu seri larutan baku yang terdiri atas
minimal empat konsentrasi yang berbeda dengan rentang 50-150% dari kadar
analit sampel. Parameter hubungan kelinieran yang digunakan yaitu koefisien
korelasi (r) dan koefisien determinasi (R) pada regresi linier y = a + bx.
Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai a = 0 dan r = +1 atau -1 merupakan
hubungan yang sempurna (RIYANTO, 2014).

Akurasi (Accuracy)
Akurasi didefinisikan sebagai kedekatan antara hasil pengujian terhadap
nilai yang sebenarnya. Suatu hasil yang akurat adalah hasil yang mendekati nilai
sejati dari suatu besaran terukur (DAY & UNDERWOOD, 2002).
Uji akurasi untuk validasi selalu menggunakan Reference Material.
Reference Material (RM) adalah material yang cukup homogen dan stabil
sehubungan dengan satu atau lebih sifat tertentu, yang telah dibuat dengan fresh
untuk digunakan dalam proses pengukuran. Accuracy dinyatakan sebagai persen
perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (RIYANTO, 2014).

Presisi (Precision)

RIYANTO (2014) menyatakan bahwa presisi atau precision adalah ukuran

yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui
penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang
pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presisi diukur
sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi).
Menurut BIEVRE (1998), presisi dapat dinyatakan sebagai keterulangan
(repeatability), ketertiruan (reproducibility), dan presisi antara (intermediate
precision). Parameter presisi tersebut antara lain :

1. Keterulangan (Repeatability)
Keterulangan adalah ketelitian yang diperoleh dari hasil pengulangan
dengan menggunakan metode, operator, peralatan, laboratorium, dan
dalam interval pemeriksaan waktu yang singkat. Pemeriksaan
keterulangan bertujuan untuk mengetahui konsistensi analit, tingkat
kesulitan metode dan kesesuaian metode.
2. Presisi Antara (Intermediate Precision)
Presisi antara merupakan bagian dari presisi yang dilakukan dengan cara
mengulang pemeriksaan terhadap contoh uji dengan alat, waktu, analis
yang berbeda, namun dalam laboratorium yang sama.
3. Ketertiruan(Reproducibility)
 Ketertiruan yaitu ketelitian yang dihitung dari hasil penetapan ulangan
dengan menggunakan metode yang sama, namun dilakukan oleh analis,
peralatan, laboratorium dan waktu yang berbeda.

Robustness
Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh
dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti
laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll.
Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan
operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji.
Ketahanan suatu metode analisis adalah ukuran dari kemampuannya untuk
tetap tidak terpengaruh oleh variasi kecil, tetapi disengaja dalam parameter
metode, dan memberikan indikasi kehandalan selama penggunaan normal.
Ketangguhan metode kromatografi, misalnya, dapat dievaluasi oleh variasi dalam
parameter seperti komposisi fase gerak, pH dan kekuatan ion, suhu dan banyak
yang berbeda atau pemasok kolom (RIYANTO, 2014).

Batas deteksi/Limit of detection (LOD) dan Batas kuantitasi/Limit of

quantitation (LOQ)

Menurut RIYANTO (2014), batas deteksi adalah jumlah terkecil analit

dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan
dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas.
Limit kuantitasi adalah konsentrasi terendah analit dalam sampel yang
dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima dibawah kondisi
yang disepakati (KANTASUBRATA, 2008). Uji limit kuantitasi dilakukan
dengan menghitung data dari kurva kalibrasi.
Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada
metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak
menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit
dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi
dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung
simpangan baku respon blangko (RIYANTO, 2014).
 Nilai LOD dan LOQ juga dapat ditentukan secara statistik melalui garis
regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai tersebut dapat ditentukan dengan
persamaan sebagai berikut:
a. Batas deteksi (LOD)
Karena k = 3, simpangan bakunya (Sb) = Sy/x, maka
y
3 x S( )
x
LOD=
slope

b. Batas kuantitasi (LOQ)

Karena k = 10, simpangan bakunya (Sb) = Sy/x, maka
y
10 x S( )
x
LOQ=
slope
(RIYANTO, 2009).

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

High performance liquid chromatography (HPLC) atau yang sering

disebut kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang
penggunaannya paling luas. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan dan
pemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif senyawa obat dalam
sediaan farmasetika. Disamping itu, HPLC juga digunakan untuk identifikasi
kualitatif senyawa obat berdasarkan pada parameter waktu retensi senyawa obat
standar serta senyawa obat dalam sampel (GANDJAR & mulj, 2012). Kegunaan
HPLC antara lain:
- Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis
- Analisis ketidakmurnian (impurities)
- Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatile)
- Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion
- Isolasi dan pemurnian senyawa
- Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama
- Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah yang sekelumit (trace
element), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri
 (GANDJAR & ROHMAN, 2007)

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan teknik yang mana

solute atau zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan
solute-solute ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solute-solute ini
diatur oleh distribusi solute dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan
kromatografi cair secara sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi
membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi
operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom,
kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (GANDJAR &
ROHMAN, 2007).

Prinsip Dasar HPLC

Menurut JOHNSON & STEVENSON (1991), pemisahan komponen-

komponen sampel secara kromatografi didasarkan oleh perbedaan laju migrasi
komponen-komponen yang disebabkan oleh koefisien distribusi komponen-
komponen tersebut antara fase gerak dan fase diam. Jika koefisien distribusi besar
berarti afinitas komponen terhadap fase diam tinggi dan terjadi retensi kuat dari
komponen di dalam kolom sehingga komponen memerlukan waktu lebih lama
untuk melewati kolom. Sebaliknya jika koefisien kecil, komponen bias melewati
kolom dengan cepat. Koefisien distribusi atau partisi sendiri ditentukan oleh
tingkat kepolaran sampel, fase gerak dan fase diam “like dissolve like”.
Senyawa yang keluar dari kolom akan terdeteksi oleh detektor kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram. Dari kromatogram tersebut akan dapat
diidentifikasi waktu retensi dan luas area puncak. Informasi waktu retensi
digunakan untuk analisis kualitatif sedangkan informasi luas area puncak
digunakan untuk analisis kuantitatif. Jumlah puncak pada kromatogram
menyatakan jumlah komponen. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol
kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran.

Instrumentasi Kromatogarfi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

 Gambar 2. Instrumentasi KCKT
Instrumentasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) pada dasarnya
terdiri atas enam komponen pokok yaitu:
1. Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak yang digunakan harus bersih. Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut
(GANDJAR & ROHMAN, 2007).
2. Pompa
Menurut pi & SUHARMAN (1995), pompa yang cocok untuk KCKT
mempunyai beberapa ciri yaitu : pompa harus dibuat dari bahan yang lembam
terhadap semua macam pelarut, mampu menghasilkan tekanan sampai 5000-6000
psi pada kecepatan alir sampai 3 mL/menit, sedangkan jika untuk skala
preparative perlu kecepatan alir sampai 20 mL/menit, dan menghantarkan aliran
pelarut yang tetap dan terulangkan ke dalam kolom. Ada tiga macam jenis pompa
yang banyak dipakai pada KCKT antara lain:
- Reciprocating Pumps
- Displacement Pumps (Syringe Pumps)
- Pneumatic Pumps (Constant Pressure Pumps)
Sistem elusi pelarut yang digunakan pada KCKT ada dua jenis, yaitu elusi
isokratik (pemisahan dengan satu jenis fasa gerak dengan campuran tetap) dan
elusi gradien (penggunaan dua atau lebih fasa gerak dengan perbedaan sifat
campuran senyawa kompleks yang terdiri dari komponen-komponen dengan
afinitas yang berbeda (MULJA & SUHARMAN, 1995).
3. Injektor
Menurut MULJA & SUHARMAN (1995), sampel-sampel cair dan
larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir dibawah
tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik (injektor). Ada tiga macam
sistem injektor pada KCKT yaitu:
- Injektor dengan memakai diafragma (septum)
- Injektor tanpa septum
- Injektor dengan pipa dosis
4. Kolom
Menurut MULJA & SUHARMAN (1995), kolom merupakan jantung dari
KCKT karena disinilah tempat terjadi pemisahan. Tabung kolom terbuat dari
bahan tahan terhadap tekanan dan fasa gerak seperti stainless steel gelas, atau
logam yang dilapisi polimer. Ujung kolom diberi frits (bahan berpori) untuk
menahan fasa diam di dalam kolom. Berikut beberapa parameter yang perlu
diperhatikan dalam pemilihan kolom, yaitu:
1. Panjang kolom
Panjang kolom berkisar antara 125 mm - 250 mm. Semakin panjang
kolom maka resolusi pemisahan yang dihasilkan semakin baik namun
tekanan yang dihasilkan semakin besar dan waktu retensi semakin lama.
2. Diameter dalam
Diameter yang umum digunakan 4 mm – 10 mm. Semakin kecil kolom
maka semakin besar resolusi dan laju pemisahan.
3. Dimensi Partikel
Ukuran butir partikel 3 µm – 10 µm. semakin kecil dimensi partikel yang
digunakan maka resolusi pemisahan yang dihasilkan semakin baik karena
pengaruh difusi berkurang.

5. Detektor
Menurut ROHMAN (2007), detektor diperlukan untuk mengindera
adanya komponen cuplikan di dalam efluen kolom dan mengukur jumlahnya.
Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan
liniernya lebar, dan menanggapi semua jenis senyawa. Kita menginginkan pula
detektor yang kurang peka terhadap perubahan aliran dan suhu, tetapi hal itu
selalu tidak terpenuhi. Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua
golongan yaitu:
 - Detektor universal yaitu detektor yang mampu mendeteksi zat secara
umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif seperti
detektor indeks bias dan spektrofotometri massa.
- Detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia
6. Komputer
Alat pengumpul data seperti komputer dihubungkan dengan detektor. Alat
ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu
memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi
oleh seorang analis (GANDJAR & ROHMAN, 2007).

Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC)

Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) merupakan
versi terbaru dari High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang
pertama kali diperkenalkan pada tahun 2004. Secara prinsip dasar keduanya
sama, yang membedakan adalah UHPLC memiliki tekanan yang lebih tinggi,
ukuran partikel dalam kolom lebih kecil, kolom lebih pendek dan jumlah sampel
yang dibutuhkan lebih sedikit. Hal ini dimaksudkan agar kinerja analisis lebih
efisien tanpa mengurangi sensitifitas dan resolusinya (PIONTEK et al, 2013).
Perbedaan kolom UHPLC dengan HPLC adalah ukuran partikel yang
mengisi kolom. Ukuran partikel yang biasa digunakan UHPLC adalah ≤ 2 𝜇�
sedangkan untuk HPLC memiliki ukuran partikel 3 – 5 𝜇�. Kolom UHPLC
umumnya lebih pendek dan berdiameter lebih kecil dibandingkan dengan kolom
HPLC. Sistem UHPLC mampu menangani tekanan tinggi 15.000 – 18.000 psi
dibandingkan HPLC yang biasanya bekerja pada tekanan 5000 – 6000 psi.
Pemisahan menggunakan UHPLC memerlukan laju alir yang lebih rendah
dibandingkan dengan HPLC. Pemisahan pada kolom UHPLC sering
menghasilkan puncak yang sempit (beberapa detik atau bahkan kurang).
UHPLC memberikan keuntungan besar dalam hal penghematan waktu
dan biaya serta memberikan potensi ramah lingkungan. Pemisahan menggunakan
HPLC rata-rata membutuhkan waktu 10 – 30 menit atau lebih, sedangkan pada
UHPLC dapat diselesaikan dalam waktu kurang dari 10 menit dan beberapa dalam
waktu kurang dari 2 menit. Selain itu pemisahan menggunakan UHPLC dapat
menghemat biaya operasional karena waktu operasi yang singkat dan dengan laju
alir yang lebih rendah dibandingkan HPLC. UHPLC memberikan potensi ramah
lingkungan karena jumlah pelarut organik yang digunakan saat analisis lebih
sedikit dibanding HPLC. Kelemahan UHPLC adalah kolom mudah tersumbat
jika eluen kurang bagus dalam penyaringannya karena partikel penyusun fasa
diam pada kolom sangat kecil (BHANOT, 2014).