Untuk obat makrolida lain).

Larutan dicampur dan dipanaskan pada pengangas air yang

diatur secara termostatik pada suhu 800C selama 60 menit untuk eritromisin dan azitromisin,
dan selama 30 dan 45 menit untuk roksitromisin dan klaritromisin. Larutan selanjutnya
didinginkan, diencerkan sampai batas volume labu takar dengan akuades, dan diukur dengan
spektrofluometri pada panjang gelombang eksitasi 255 dan panjang gelombang emisi 348
nm.

3. Flow injection analysis (FIA)

FIA telah digunakan untuk analisis eritromisin dalam sediaan tablet dan kapsul.
Reagen kemiluminisensi terdiri atas larutan Ru(bpy)33+, yang dibuat dalam buffer
asetat 10 mM pH 5,8 dengan menggunakan 3 elektroda. Oksidasi dibiarkan terjadi
selama 30 menit untuk tiap 100 mL reagen sebelum digunakan dan potensial dibuat
konstan selama durasi percobaan. Pengaliran larutan Ru(bpy)33+ diatur pada 0,7
mL/menit. Fase gerak pembawa adalah asetonitril-buffer natrium asetat yang
mengandung heptana 10 mM (27:73 v/v) dan pH diatur 6,0 dengan asam sulfat.

Kondisi KLT untuk analisis antibiotik makrolida

Senyawa Matriks Sampel Fase diam Sistem eluen
EA,EB,psAHK,AE Larutan Silika gel Metilen-klorida-
metanol-benzen-
formamid
EA, EB, EC, AE, Larutan Kieselgel G Metilen-klorida-n-
ESM Keiselguhr heksan-etanol
Eritromisin Larutan Silika gel H Metanol
Eritromisin Kapsul Silika gel G Metanol-natrium
asetat dalam air

ket: EA(eritromisin A) ; EB (eritromisin B); EC(eritromisin C);

psEAHK(pseudoeritromisin hemiketal); AE(anhidroeritromisin) dan
ESM(eritrolosamin).
4. Kromatografi Lapis Tipis
Usaha pertama untuk menganalisis eritromisin melibatkan penggunaan KLT untuk
memisahkan eritromisin A dan eritromisin B. Pemisahan dilakukan dengan
menggunakan lempeng silika gel dengan berbagai macam pelarut organik atau
campuran pelarut organik sebagai eluen, yang visualisasinya dilakukan dengan asam
sulfat 50%. Visualisasi yang terdiri atas serium sulfat 1 %, dan asam molibdat 2,5%
dalam asam sulfat 10% juga digunakan. Beberapa sistem KLT yang digunakan untuk
analisis antibiotik makrolida dapat dilihat pada tabel 6.1.
KLT dikembangkan untuk analisis eritromisin dan tretinoin dalam sediaan
lotion dengan adanya beberapa bahan tambahan. KLT dilakukan dengan silika gel
60F(dengan gypsum) 254. Sebanyak 10µL larutan induk eritormisin 0,1% ditotolkan
pada lempeng dan dikeringkan dibawah aliran nitrogen. Larutan induk 0,1%
eritromisin dilarutkan dalam etanol. Fase gerak yang digunakan adalah
diklorometana-metanol-amonia 25%(60:6:1 v/v/v). Derivatisasi dilakukan dengan
menggunakan reagen pencelup yang terdiri atas anisaldehid-asam sulfat-asam asetat,
masing-masing 1,2, dan 10 % (v/v/v).
Kondisi berikut juga digunakan untuk analisis erirtromisin dalam sedian
farmasetik
Fase diam : Silika gel 60F-254
Fase gerak : etil-asetat-etanol : sodium asetat 10% (9:7:8 v/v)
Scanning : Densitometri dilakukan dengan mode absorbansi pada panjang
gelombang 425 nm, sebelumnya lempeng HPTLC disemprot dengan campuran
anisaldehid-asam- sulfat-etanol(1:1:9) dan dipanaskan pada suhu 1000C dalam oven
selama 2 menit.
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol.
5. Metode Kromatografi cair kinerja tinggi
Telah dilakukan uji banding antar laboratorium untuk melakukan analisis eritromisin
dan senyawa terkait. Protokol analisis dengan KCKT melibatkan penggunaan metode
gradien pada kecepatan alir 1,0 mL/menit. Kolom Xterra RP C18 (250 mm x 4,6 mm
i,d; ukuran partikel 3,5µm) digunakan da kolom dijaga pada suhu 650C dalam oven
udara panas. Volume yang diinjeksi adalah 100 µL dan deteksi dilakukan dengan UV
pada panjang gelombang 210 nm, Autosampler dijaga pada suhu 40C dengan tujuan
untuk memaksimalkan stabilitas larutan.
 Dua fase gerak yang terdiri atas asetonitril-KH2PO4 0,2 M pH 7,0-air
disiapkan. Fase gerak A menggunakan perbandingan 35: 5 :60 v/v/v) sementara fase
gerak B menggunakan perbandingan (50: 5: 45v/v/v). Program gradien yang
digunakan adalah 0 0-x menit :100 % A; x sampai (x+2): 100 -0% A ; (x+2) sampai
(x+9) sampai (x+10): 0 -100% A; (x+10) sampai (x+20): 100% A, yang mana x
adalah waktu retensi eritromisin B(dalam menit).
Semua sampel dilarutkan dalam campuran metanol-kalium hidrogen fosfat pH
8,0 (2:3 v/v). Kromatogram yang diperoleh untuk pemisahan eritromisin dan
senyawa-senyawa terkait sebagaimana dalam gambar 6.2

KCKT baik dengan detektor UV ataupun dengan detektor elektrokimia telah

digunakan untuk analisis eritromisin estolat dalam sediaan farmasetik. Perhatian
khusus diberikan terkait dengan stabilitas sifat estolat selama perlakuan sampel dan
selama penyimpanan. Detektor UV lebih sesuai untuk analisis dalam sediaan farmasi
yang mengandung eritromisin estolat karena memberikan keuntungan dibandingkan
detektor elektrokimia, dalam hal stabilitas serta sensitifitasnya untuk mendeteksi
sekelumit produk hasil degradasi.
Kondisi kromatografi KCKT : buffer fosfat 0,05 M disiapkan dengan
menambahkan 3,2 mL asam fosfat ke 1 liter air dan mengatur pH nya sampai 6,3
dengan natrium hidroksida. fase gerak disiapkan dengan mencampur 650 mL
asetonitril dengan 350 mL buffer fosfat dan campuran dilakukan degassing dan
disaring melalui penyaringan 0,45 mikron. Fase gerak dihantarkan dengan kecepatan
1 mL/menit. Kolom Techsil C18(250 mm x 3,9 mm; 10µm) digunakan untuk
pemisahan dan dijaga pada suhu 350C. Detektor UV diatur pada panjang gelombang
200 nm dan diletakan secara in line dengan detektor elektrokimia elektroda ganda
yang dioperasikan dalam mode oksidasi dengan elektroda atas diatur +0,70 V.
elektroda bawah +0,90V dan sel pengamatan pada +1,00V. Standar internal
oleandomisin fosfat (2,0 mg/mL) dilarutkan dalam campuran asetonitril-air(1:1 v/v).
Analisis kapsul : sejumlah serbuk kapsul yang setara dengan 5,0 mg ditimbang
seksama dan dipindahkan ke labu takar 10 mL yang telah mengandung 1 mL standar
internal. Setelah dilakukan pencampuran dengan vorteks selama 1 menit, sampel
dibuat sampel volume dengan asetonitril, disonikasi selama 5 menit dan dibiarkan
untuk mencapai setimbang pada suhu kamar. Sampel disentrifuge dan diinjeksi ke
sistem KCKT.
Gel yang mengandung eritromisin dan benzoil peroksida sering digunakan
untuk pengobatan acne vulgaris. Metode ini dikembangkan untuk determinasi
keduanya dalam gel. Eritromisin diekstrasi dari gel dalam suatu kondisi yang mana
daya oksidasi benzoil peroksida dinetralkan dengan penambahan asam askorbat.
Kolom yang digunakan untuk pemisahan adalah Xterra RP18 (250 mm x 4,6
0
mm i.d; 5µm). Kolom dijaga pada suhu 65 C dalam penangas air. Pemisahan
dilakukan secara isokratik dengan fase gerak yang mengandung astonitril-buffer
fosfat 0,2 pH 7,0-air (35:5:60 v/v/v) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit. Buffer
fosfat pH 7,0 disiapkan dengan mencampur dikalium hidrogen fosfat 0,2 M dengan
asam fosfat 0,2 M. Detektor dilakukan dengam UV pada panjang gelombang 215 nm.
Untuk penyiapan campuran disolusi, sebanyak 5 g asam askorbat ditambahkan
ke 500 mL buffer kalium fosfat 0,2 M pH pH 0,7 yang digunakan dalam fase gerak.
Campuran ini dibuat pH nya sampai pH 7,0 dengan larutan KOH 45 % (b/v). Gel
(sebanyak 1,00 g) diencerkan dengan campuran disolusi-asetonitril(75:25 v/v), dan
dibuat sampai 100,0 mL dan diaduk selama 30 menit. Larutan ini disaring melalui
penyaring membran 0,2 mikron, dan sebanyak 100 µL filtrat diinjeksi ke sistem
KCKT.
Eritromisin etilsuksinat dalam sediaan suspensi oral dianalisis dengan KCKT.
Pemisahan dilakukan dengan kolom X-TerraTM C18. Campuiran asetonitril-buffer
ammonium dihidrogen fosfat 0,025 M pH 7,0 (60:40 v/v) digunakan sebagai fase
gerak dan dihantarkan secara isokratik dengan detektor UV pada panjang gelombang
205 nm. Metode yang dikembangkan mampu menunjukan spesifitas yang baik, yang
 mana eritromisin tidak terganggu oleh puncak-puncak hasil degradasi eritromisin.
Kondisi-kondisi KCKT yang lain untuk analisis eritromisin adalah sebagai berikut :
Matriks : Basis krim
Kolom : poly(styrene-divinylbenzene) PLRP-s`1000A (250 mm x 4,6 i.d) dari
polimer Labs
Suhu kolom : 700C dalam penangas air
Fase gerak : 2-metil-2-propanol-asetonitril-buffer fosfat (0,2 M; pH 11,0)-air
(165:30:50:755 v/v/v/v)
Kecepatan alir : 2,0 mL/menit
Volume injeksi : 100µL
Detektor : UV 215
Matriks : Campuran eritromisin dengan trimetoprim dalam tablet.
Kolom : Symmetry Waters C18 (150 mm x 4,6 mm i.d µm)
Fase gerak : Buffer kalium dihidrogen fosfat pH 9-asetonitril-air (25:100:50 v/v/v)
Kecepatan alir : 1,6 mL/menit
Volume injeksi 20 µL
Detektor : UV 210
Matriks : Eritromisin A dan eritromisin D serta senyawa-senyawa terkait
Kolom :Hypersil BDS C18 (250 mm x 4,6 mm i.d: 5 µm)
Fase gerak : 2- metil-2-propanol-2-propanol-buffer fosfat 0,2 M (pH 7,5)-
air(8,5:8,5:78 v/v/v/v) atau 2-metil-propanol-asetonitril-buffer fosfat 0,2 M pH 7,5-air
(22:5:5:68 v/v/v/v). Fase organik dicampur dulu dilanjutkan dengan fase air.
Kecepatan alir : 1,0 mL/menit
Volume : 20 µL
Detektor : UV 215

6. Kromatografi cair-Spektrometri Massa

Kromatrografi cari yang dihubungkan dengan spektrometri massa (LC-MS)
dikembangkan untuk analisis (identifikasi dan kuantitatif) eritromisin etilsuksinat dan
eritromisin dalam plasma manusia, yang selanjutnya digunakan untuk studi klinik.
Metode berdasrkan pada ekstrasi cair-cair, diikuti dengan prosedur kromatografi
dengan kolom ODS, serta campuran asetonitril dan asam asetat 1,67 M digunakan
sebagai fase gerak. Deteksi dilakukan dengan spektrometer massa menggunakan
quadrupole tunggal dalam bentuk pemantauan ion positif tertentu. Proses
kromatografi dengan kolom ODS (250 mm x 2,0 mm i.d; µm). Fase gerak
dihantarkan dengan kecepatan 0,2 mL/menit yang berupa asetonitril-air yang
mengandung asam asetat 1,167mM (70:30 v/v). Suhu oven kolom dijaga 400C.
Pemisahan sampel : sebanyak 0,2 mL plasma dan larutan standar internal
diazepam (konsentrasi akhir 1 µg/mL) dipipet ke dalam tabung