PANDUAN PRAKTIKUM

FUNDAMENTAL OF MOLECULAR BIOLOGY

CUTTING DNA

PROGRAM STUDI ILMU GIZI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS KRISTEN SATYA WACANA
2018
 Pendahuluan

Memotong dan menyambung DNA merupakan pekerjaan rutin dalam pekerjaan rekayasa
genetik. Pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang dinamakan enzim restriksi. Enzim restriksi
merupakan enzim bakterial yang memotong untai ganda DNA pada runutan tertentu (spesifik). Situs
pengenalan merupakan runutan DNA yang menjadi tempat menempelnya enzim restriksi dan
melakukan pemotongan pada runutan tersebut. Panjang sekuen pengenalan enzim restriksi berbeda-
beda; ada yang 6-cutters, seperti enzim HindIII, EcoR1; 8-cutters, seperti NotI; dan 4-cutters, seperti
AluI
Terdapat 2 jenis bentuk hasil pemotongan enzim restriksi, a) Sticky ends dan b) Blunt ends.
Enzim yang memotong untai DNA di titik yang berhadapan langsung dengan yang lain, menghasilkan
fragmen DNA "ujung tumpul". Sedangkan enzim lain memotong dua untaian pada titik yang tidak
berhadapan secara langsung satu sama lain, menghasilkan belaian (overhang) di setiap untai. Belaian
ini disebut "ujung lengket" karena mereka siap berpasangan dengan basa komplementer pada fragmen
(DNA) lain.

Sticky ends

Blunt ends

Tujuan
1. Memahami prinsip dasar pemotongan DNA oleh enzim restriksi
2. Mampu melakukan tahapan-tahapan cutting DNA dengan benar
3. Mampu memotong DNA menggunakan enzim restriksi yang sesuai
4. Mampu membuat perhitungan dan penyusunan campuran reaksi untuk cutting DNA

Alat: Bahan:
  Micro tube (tabung ependorf 1,5 µl)  Sampel DNA (Clone)
 Standing Tube  Enzim restriksi (EcoR1)
 Mikro pipet  Buffer
 Tip  Aquades
 Water bath  Ice
 Box ice
 Vortex
 Waterproof pen marker

Protokol

A. Cutting DNA

1. Siapkan microtube steril kemudian beri label sesuai sampel yang akan dipotong dan enzim
pemotongnya.
2. Siapkan jumlah reaksi yang dibutuhkan berdasarkan tabel berikut:
 Sampel DNA 1 µl
Enzim 0.5 µl
Sampel DNA 1 µl Restriksi
Enzim 0 µl Buffer 10x 1 µl
dH2O 12.5
Restriksi
Buffer 10x 1 µl µl
dH2O 13 µl Total volume 15 µl
Total volume 15µl HARI SELASA
HARI SENIN

Sampel DNA 1 µl
Enzim Restriksi 1 µl
Buffer 10x 1 µl
dH2O 12 µl
Total volume 15 µl
HARI RABU

3. Masukkan 1 µl sampel DNA ke dalam microtube

4. Tambahkan 1 µl buffer 10x yang disesuaikan dengan enzim yang digunakan.
5. Tambahkan enzim restriksi ( volume sesuai kelompok )
6. Tambahkan aquades sampai volume total mencapai 15 µl.
7. Larutan diinkubasi di water bath dengan suhu 37⁰C selama 1 jam
8. Setelah selesai sampel disimpan di dalam kulkas dengan suhu 4⁰C
B. Elektroforesis
 Larutan Buffer TAE 1x
1. Buat 500 ml larutan TAE 1x menggunakan stok larutan TAE 50x.
2. Ambil Buffer TAE 50x sebanyak 10 ml dan diencerkan dengan aquades sampai volume 500 ml.
3. Buffer TAE ini dipakai sebagai perendam agarose gel dan juga sebagai penghantar arus listrik saat
running elektroforesis.
 Buat agarose gel
1. Buat agarose gel dengan konsentrasi 0,8% dengan pelarut menggunakan Buffer TAE 1x di atas
dengan volume total 80 ml
2. Timbang agarose sebanyak 0,64 gr dalam beaker gelas 100 ml
3. Tambahkan larutan TAE 1x sampai volume 80 ml
4. Panaskan larutan agarose menggunakan hotplate dengan magnetic stirrer sampai larutan berubah
menjadi bening (jernih).
5. Siapkan wadah pencetak gel agarose, pastikan bagian tutup samping dan sisiran pencetak sumur
telah terpasang dengan benar.
6. Tuang larutan agarose ke wadah pencetak gel, tunggu sampai gel mengeras. Lepaskan tutup
samping dan sisiran secara perlahan dan hati-hati jangan sampai merusak gel dan sumurnya.
 Setting alat dan persiapan sampel
1. Letakkan wadah dan agarose gel secara perlahan dan hati-hati ke dalam chamber alat
elektroforesis
2. Tuang larutan TAE 1x ke dalam tangki secara perlahan sampai menutupi permukaan gel agarose,
lebih kurang 2-3 ml di atas permukaan agarose gel atau sesuai garis petunjuk pada chamber.
 3. Siapkan sampel hasil Cutting DNA dan loading dye dalam box ice, termasuk DNA marker yang
akan digunakan. Catat informasi DNA marker yang digunakan utnuk kebutuhan identifikasi.
4. Siapkan 10 µl sampel yang merupakan campuran sampel Cutting DNA dan loading dye dengan
perbandingan DNA : loading dye = 4 : 1.
5. Ambil loading dye 2 µl lalu tempatkan pada kertas parafilm, kemudian ambil 8 µl sampel Cutting
DNA dan campurkan dengan loading dye sampai tercampur merata.
6. Setelah itu masukkan sampel ke dalam sumuran pada agarose gel dengan hati-hati jangan sampai
ujung tip merusak sumur atau sampel tidak masuk ke dalam sumur. Lakukan untuk semua sampel
DNA dan DNA marker, untuk DNA marker cukup gunakan 5 µl.
 Running
1. Pastikan semua sampel Cutting DNA dan DNA marker telah siap dalam sumuran dan kode
sampel dan nomor sumuran telah tercatat.
2. Pasang penutup alat electroforesis dan kabel power dari power supllya pada electroda masing-
masing.
3. Hidupkan power suplya dan atur tegangan lebih kurang 40 – 50 volt dan arus listrik lebih kurang
90 – 100 mA. Setelah semua siap, running selama lebih kurang 2 jam.
 Deteksi dan Identifikasi
1. Selesai running, ambil agarose gel dan pindahkan ke dalam wadah perendaman di dalam lemari
asam. Tuang larutan ETBR ke dalam wadah perendaman sampai seluruh gel terendam. Diamkan
selama lebih kurang 20 menit.
2. Setelah itu, ambil agarose gel dan masukkan dalam gel doc untuk proses visualisasi dengan
bantuan sinar UV. Dokumentasikan hasil visualisasi.
3. Agarose gel yang sudah selesai digunakan dipindahkan ke dalam beaker gelas lalu dipanaskan di
hotplate sampai larut kembali. Larutan dibuang ke dalam botol limbah yang sudah diberi label.
4. Gambar hasil dokumentasi diberi label dan keterangan.
5. Catatan: selama proses perendaman dengan ETBR sampai pengerjaan limbah agarose gel perlu
ekstra hati-hati. Jangan sampai ETBR terkena kulit, jika terkena kulit segera bilas dengan air
mengalir. Gunakan sarung tangan rangkap 2. Sarung tangan dan tissue yang digunakan dibuang
pada tempat khusus yang disediakan di dalam lemari asam.
Gambar 1. Hasil UV

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

marker DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA

uncut K K Sl Sl Rb Rb
Gambar 2. Pvu2

Gambar. 3 HindIII
Analisis Cutting DNA
1. Untuk menjalankan volume kecil pada reaksi enzim restriksi, diinkubasi selama 1 jam pada suhu
37oC pada microtube 1.5 ml (Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 µg DNA pada suhu 37 oC
± 1 jam)
 1 µl buffer 10X (disesuaikan dengan produk enzim)
 1 µl sampel DNA (0.1-5 µg)
 1 µl enzim restriksi EcoR1 (mengandung 0.2-10 U)
 H2O untuk mencapai volume akhir 15 µl
2. Setelah proses inkubasi, potongan DNA dapat dijalankan melalui proses elektroforesis (Lih.
Protokol elektroforesis) . dimana proses ini dapat menjelaskan apakah enzim restriksi dapat
memotong DNA dengan sempurna. Jika pada reaksi skala kecil bekerja dengan baik, maka reaksi
enzim restriksi dapat dijalankan lagi pada skala yang besar ( pada volume 250-400 µl) untuk
persiapan purifikasi DNA oleh elektroelusi.