Patogenisitas Dasar Molekuler

Selama replikasi, prekursor glikoprotein F0 memproduksi partikel APMV-1, yang harus

dibelah menjadi F1 dan F2 agar partikel virus bisa menular. Pembelahan post-translasi ini
dimediasi oleh protease sel inang. Trypsin mampu membelah F0 untuk semua strain NDV.
Molekul F0 virus yang ganas untuk ayam dapat dibelah oleh protease host atau protease yang
ditemukan di berbagai sel dan jaringan, dan menyebar ke seluruh host merusak organ vital.
Namun molekul F0 pada virus dengan virulensi rendah dibatasi pada kemampuan membelah
protease host tertentu yang mengakibatkan pembatasan virus ini berkembang hanya pada jenis
sel induk tertentu.

Sebagian besar virus APMV-1 yang patogen untuk ayam memiliki urutan 112R / K-R-Q /
K / R-K / R-R116 (Choi et al., 2010; Kim et al., 2008a) pada ujung C dari protein F2 dan F
(fenilalanin) pada residu 117, N-terminus protein F1, sedangkan virus dengan virulensi rendah
memiliki urutan diwilayah yang sama dengan 112G / E-K / R-Q-G / E-R116 dan L (leusin) pada
residu 117. Beberapa varian virus merpati (PPMV-1) diperiksa memiliki urutan 112G-R-Q / K-
K-R-F117, namun memberikan nilai ICPI (intracerebral pathogenicity index) tinggi. (Meulemans
et al., 2002). Dengan demikian tampaknya ada persyaratan setidaknya satu pasang amino asam
dasar pada residu 116 dan 115 ditambah fenilalanin pada residu 117 dan asam amino dasar (R)
pada 113 jika virus ini menunjukkan virulensi pada ayam. Namun, beberapa PPMV-1 mungkin
memiliki lokasi pembelahan yang ganas dengan nilai ICPI rendah (Collins et al., 1994).
Fenomena ini telah dikaitkan bukan dengan fusi protein (Dortmans et al., 2009), namun dengan
kompleks replikasi yang terdiri dari nukleoprotein, phosphoprotein dan polimerase (Dortmans et
al., 2010).

Beberapa penelitian telah dilakukan dengan menggunakan teknik molekuler untuk

menentukan lokasi pembelahan urutan F0 dengan reverse-transcription polymerase chain
reaction (RT-PCR), baik pada virus yang terisolasi atau pada jaringan dan feses dari burung yang
terinfeksi, dilanjutkan dengan analisis produk oleh analisis enzim restriksi, hibridisasi probe atau
urutan nukleotida dengan maksud untuk menetapkan uji in vitro rutin untuk virulensi (Miller et
al., 2010b). Penentuan urutan pembelahan F0 dapat memberikan hasil indikasi virulensi virus
yang jelas.

Dalam diagnosis ND penting untuk memahami bahwa demonstrasi adanya virus dengan
beberapa asam amino dasar di tempat pembelahan F0 mengkonfirmasi adanya virulen atau
berpotensi virus virulen, namun gagal mendeteksi virus atau deteksi NDV tanpa beberapa asam
amino dasar pada situs pembelahan F0 yang menggunakan teknik molekuler tidak
mengkonfirmasi tidak adanya virus yang mematikan. Ketidakcocokan primer, atau kemungkinan
populasi campuran virus mematikan dan avirulen berarti isolasi virus itu dan penilaian virulensi
in-vivo, seperti ICPI, masih diperlukan.

Analisis virus yang diisolasi di Irlandia pada tahun 1990 dan selama wabah ND di
Australia sejak tahun 1998 telah memberikan bukti kuat bahwa virus mematikan dapat timbul
dari virus progenitor dengan virulensi rendah (Alexander & Senne, 2008b). Virulen NDV juga
telah dihasilkan secara eksperimen dari virulensi rendah virus oleh bagian pada ayam (Shengqing
et al., 2002).
Diagnosa Menggunakan Teknik Molekuler
Selain penggunaan RT-PCR dan teknik serupa lainnya untuk penentuan virulensi virus ND
atau untuk studi filogenetik, telah ada peningkatan penggunaan teknik molekuler untuk
mendeteksi NDV dalam spesimen klinis, keuntungannya adalah demonstrasi sangat cepat adanya
virus. Perhatian harus diberikan dalam pemilihan sampel klinis karena beberapa penelitian
menunjukkan kurangnya kepekaan dalam mendeteksi virus di beberapa organ tubuh dan
terutama pada kotoran (Creelan et al., 2002; Nanthakumar et al., 2000). Swab trakea atau
orofaringeal sering digunakan sebagai spesimen pilihan karena mudah di proses dan biasanya
mengandung sedikit bahan organik asing yang dapat mengganggu pemulihan dan amplifikasi
RNA oleh PCR. Namun, sampel jaringan dan organ dan bahkan feses telah digunakan dengan
beberapa keberhasilan. Sistem yang digunakan untuk ekstraksi RNA juga akan mempengaruhi
keberhasilan RT-PCR pada spesimen klinis dan bahkan dengan penggunaan kit komersial harus
dilakukan dalam memilih yang paling tepat atau divalidasi untuk sampel yang akan dianalisis.

Biasanya sistem RT-PCR telah digunakan untuk memperkuat bagian tertentu dari genom
yang akan diberikan nilai tambah; misalnya dengan memperkuat bagian gen F yang mengandung
belahan pembelahan F0 sehingga produk dapat digunakan untuk menilai virulensi (Creelan et al.,
2002). Mungkin masalah yang paling serius dengan menggunakan RT-PCR dalam diagnosis
adalah perlunya proses pasca amplifikasi karena adanya potensi kontaminasi laboratorium yang
tinggi dan kontaminasi silang sampel. Tindakan ekstrim pencegahan dan regimen ketat untuk
penanganan sampel diperlukan untuk mencegah hal ini. Salah satu strategi yang digunakan untuk
menghindari proses pasca amplifikasi adalah dengan menggunakan teknik real-time RT-PCR
(rRTPCR). Kelebihan tes tersebut adalah tes rRT-PCR berdasarkan fluorogenik probe hidrolisis
atau pewarna fluoresen menghilangkan langkah pemrosesan pasca amplifikasi dan hasilnya bisa
diperoleh dalam waktu kurang dari 3 jam. Saat ini, penerapan terluas rRT-PCR assay untuk
deteksi APMV-1 ada di Amerika Serikat (AS) selama wabah ND tahun 2002-2003, ketika uji
yang dijelaskan oleh Wise et al. (2004) dipekerjakan. Primer dan probe dalam laporan ini
divalidasi pada strain lentogenik, mesogenik dan velogenik yang beredar di Amerika Serikat. Di
puncak wabah, antara 1000 dan 1500 sampel diuji setiap hari menggunakan teknik rRT-PCR.
Namun demikian protokol tidak mendeteksi semua strain NDV dan bagian genom yang lebih
aman harus ditargetkan atau beberapa pendekatan pengujian (yaitu setidaknya dua tes
laboratorium independen yang berbeda untuk deteksi antigen) mungkin diperlukan untuk
mendeteksi kasus indeks.

Sebenarnya, satu masalah penting adalah isolat APMV-1 terbukti berbeda secara genetis.
Contoh, satu kelompok virus, yang ditempatkan di genogroup 6 oleh Aldous et al. (2003) dan
selanjutnya Kelas I oleh Czegledi dkk. (2006), sangat berbeda dari isolat APMV-1 lainnya,
misalnya virus kelas II (Czegledi et al., 2006) bahwa primer yang berbeda akan diperlukan untuk
pendeteksiannya di tes RT-PCR. Selanjutnya, baru-baru ini ditunjukkan bahwa di kelas II virus
APMV-1, gen matriks tidak benar-benar sangat dilestarikan dan negatif palsu terjadi jika terjadi
wabah investigasi atau surveilans rutin pada unggas menggunakan uji RT-PCR dengan real-time
USDA menargetkan gen ini (Cattoli et al., 2009; 2010; Khan et al., 2010). Selain itu matriks
berbasis gen PCR real-time yang umumnya digunakan untuk mengidentifikasi APMV-1 tidak
membedakan antara lentogenic dan strain mesogenik / velogenik, oleh karena itu harus
digunakan sebagai tes skrining untuk kehadiran APMV-1 RNA dalam sampel dan bukan untuk
deteksi atau konfirmasi wabah ND. Hal ini terutama terjadi pada daerah atau negara yang
menggunakan vaksin hidup pada unggas secara rutin.

Uji rRTPCR spesifik fusi gen spesifik untuk mendeteksi dan menentukan patotipe virulensi
akan berguna karena akan memungkinkan untuk cepat. Pathotyping, namun karena variabilitas
pengkodean wilayah untuk situs pembelahan, tersedia tes penggunaannya terbatas dan bisa gagal
mendeteksi variannya. Pendekatan yang menjanjikan yang melibatkan pemasukan virus kelas I
dalam satu rRT-PCR dilakukan oleh Kim et al. 2008, menggabungkan primer untuk kelas I dan
kelas II (Kim et al., 2008b). Saat ini, perlu dicatat bahwa pengujian RT-PCR atau rRTPCR
multiplexing yang bertujuan untuk memperluas jangkauan deteksi virus sering mengakibatkan
berkurangnya sensitivitas terhadap tes dibandingkan dengan tes target tunggal (Fuller et al.,
2010; Liu et al., 2010).