LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

ANALISIS KANDUNGAN TUMBUHAN OBAT

Analisis Flavonoid dari Daun Ketela Pohon

(Manihot utilissima Pohl.)

Disusun oleh :
Nama : Gunawan Aji Pamungkas
Magdalena Devika S
NIM : 12/331156/FA/09230
12/331165/FA/09323
Kelas/Gol/Kel. : FBA/I/5
Tanggal praktikum : 30 September 2015
Asisten Jaga : Dena, Putri,Asri
Asisten Koreksi : Dena, Putri Asri
Dosen Jaga : Prof. Dr. S. Pramono, DEA., Apt.

LABORATORIUM KIMIA PRODUK ALAM

BAGIAN BIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2015
 Percobaan 1
ANALISIS FLAVONOID DALAM DAUN KETELA POHON
(Manihot utilissima Pohl.)

I. SKEMA KERJA

Maserasi dengan 50 ml metanol (10’)

Remaserasi 1 x dengan 50 ml metanol (10’)

II. HASIL DAN ANALISIS DATA
Analisis Kualitatif
1. Sistem satu
a. Sistem KLT
Fase diam : Silika gel F 254
Fase gerak : asam asetat 15 %
Jarak migrasi : 8 cm
Deteksi : Pereaksi semprot sitroborat
Sampel : tiap bercak 4 penotolan
b. Hasil Kromatografi
Sebelum penambahan pereaksi semprot :

Sinar tampak UV 254 UV 366

Setelah penambahan sitoborat :

Sinar tampak UV 366

 c. Data Rf
Sebelum disemprot Setelah disemprot
Sampel Rf
Tampak UV 254 UV 366 Tampak UV 366
0,03 kuning
0,13 kuning
0,24 kuning kuning
0,27 Kuning
A
0,49 kuning
0,53 kuning Biru hitam kuning
0,6 kuning
0,67 kuning Biru Kuning
0,03 Kuning Kuning Kuning Biru
0,36 Biru Kuning
0,44 Biru Kuning
B1
0,56 Biru Kuning
0,73 Biru
0,8 Biru Biru
0,04 Biru
0,3 Kuning
B2
0,53 Kuning Kuning
0,8 Kuning Biru

2. Sistem dua
a. Sistem KLT
Fase diam : Silika gel F 254
Fase gerak : n-butanol-asam asetat-air (4:1:5 v/v)
Jarak migrasi : 8 cm
Deteksi : Pereaksi semprot sitroborat
Sampel : tiap bercak 4 penotolan
b. Hasil Kromatografi
Sebelum penambahan pereaksi semprot :

Sinar tampak UV 254 UV 366

Setelah penambahan sitoborat :

Sinar tampak UV 366

c. Data Rf
Sebelum disemprot Setelah disemprot
Sampel Rf
Tampak UV 254 UV 366 Tampak UV 366
0,07 Kuning Kuning Biru
A
0,15 Kuning Kuning Biru
B1 0,2 Biru
B2 0,3 Kuning Kuning Biru
0,45 Biru Kuning
0,62 Kuning Kuning Kuning
0,82 Biru Kuning
1 Coklat Kuning kecoklatan Merah Coklat Merah
0,77 Kuning Kuning Kuning Kuning
B1
1 Coklat Kuning kecoklatan Merah Coklat Merah
0,15 Kuning
B2
0,28 Kuning
 0,31 Kuning
0,46 Kuning Kuning Kuning Kuning
0,62 Kuning
1 Coklat Biru coklat

Analisis Kuantitatif
1. Absorbansi larutan baku dan persamaan regresi linier
Kadar kuersetin Absorbansi
(ppm) Tanpa AlCl3 Dengan AlCl3 Selisih absobansi
1 0,276 0,676 0,4
5 0,213 1,081 0,868
10 0,483 0,669 0,186
25 0,726 1,212 0,486
50 0,931 2,557 1,626
100 1,452 3,034 1,582
Dari data di atas, dibuat persamaan kurva baku menggunakan data
konsentrasi pada 10 ppm, 25 ppm, dan 50 ppm, sehingga diperoleh :
A = -0,2063
B = 0,0365
r = 0,981 sehingga Y = 0,0365 x – 0,2063

2. Absorbansi sampel
Sampel Absorbansi
Tanpa AlCl3 Dengan AlCl3 Selisih absobansi
A 0,513 1,696 1,183
B1 0,512 1,735 1,223
B2 0,484 2,438 1,954

3. Perhitungan kadar sampel

Y = 0,0365 x – 0,2063
a. sampel A
1,183 = 0,0365 x – 0,2063
x = 38,063 ppm
kadar dalam % = 38,063 ppm x 10-4 % = 3,8063 x 10-3 %

b. sampel B
1,223 = 0,0365 x – 0,2063
 x = 39,159 ppm
kadar dalam % = 39,159 ppm x 10-4 % = 3,9159 x 10-3 %

c. sampel C
1,954= 0,0365 x – 0,2063
x = 59,186 ppm
kadar dalam % = 59,186 ppm x 10-4 % = 5,9186 x 10-3 %

Kadar flavonoid total rata-rata dalam sampel adalah 45,469 ppm atau
4,5469 x 10-3 %

Kadar Flavonoid Total

kadar Flavonoid total =

= = 4,547 x
Perhitungan % b/b ekivalen
⁄
% ⁄ ekuivalen = x 100%
⁄

larutan stok sampel = bahan yang diambil = 5 gram

dimaserasi dengan = 100 mL metanol

%= ⁄ = ⁄

⁄ % ekuivalen dengan 100 mL

Total flavonoid daun singkong  mg kuersetin/100 ml

III. PEMBAHASAN
Tujuan dari percobaan ini adalah agar mahasiswa dapat memahami dan dapat
melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela pohon (Manihot utilissima) serta
melakukan anaisis kualitatif golongan senyawa tersebut dengan metode
kromatografi lapis tipis.
Flavonoid merupakan senyawa metabolit sekunder yang tersusun oleh dua
cincin benzen yang dihubungkan oleh tiga atom C yang dapat membentuk cincin
ketiga sehingga tersusun kerangka dasar C3-C6-C3. Senyawa flavonoid secara
umum berbentuk sebagai glikosida. Glikosida adalah senyawa yang apabila
dihidrolisis akan menghasilkan senyawa gula (glikon) dan bukan gula (aglikon).
Aglikon flavonoid adalah polifenol oleh karena itu memiliki sifat kimia senyawa
fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Flavonoid
merupakan senyawa polar sehingga cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol,
methanol, butanol, aseton, dan air. Adanya gula yang terikat pada flavonoid
cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air. Sebaliknya,
aglikon yang kurang polar seperti flavonon, flavon serta flavonol lebih mudah larut
dalam pelarut seperti eter dan kloroform.
Dalam ketela pohon terdapat glikosida flavonoid yaitu rutinosa dimana ada
dua sakarida yaitu rhamnosil dan glukosa. Golongan flavonoidnya adalah flavonol,
maka rutin merupakan glikosida flavonol. Aglikon dari rutin adalah kuersetin yang
merupakan suatu flavonoid dan tidak larut dalam air. Struktur dari rutin dan
kuersetin adalah sebagai berikut.
Rutin

Dalam praktikum ini dilakukan isolasi flavonoid dengan cara maserasi.

Bagian dari glikosida dan aglikon dari flavonoid rutin dapat disari menggunakan
metanol. Sebanyak 5,0 gram Serbuk daun ketela pohon dimasukkan ke dalam
erlenmeyer 100 ml dan ditambahkan 50 ml metanol kemudian dilakukan maserasi
sambil digojog selama 10 menit. Digunakan serbuk untuk memperluas permukaan,
sehingga proses penyarian dapat berlangsung cepat. Kemudian larutan disaring
dengan kertas saring hingga diperoleh filtrat yang berwarna hijau. Selanjutnya
dilakukan satu kali remaserasi agar senyawa-senyawa yang masih terdapat dalam
serbuk dapat tersari. Filtrat dikumpulkan dan diuapkan diatas penangas air hingga
volumenya tersisa 10 ml. Filtrat dibagi menjadi dua sama banyak masing-masing 5
ml (A dan B). Bagian A dipisahkan untuk analisis menggunakan KLT. Bagian B
diuapkan hingga kental kemudian dilakukan hidrolisis menggunakan HCl 1% agar
glikosida flavonoid rutin terhidrolisis sehingga aglikon flavonoid (kuersetin)
terpisah dari molekul gulanya. Refluks digunakan untuk memaksimalkan proses
hidrolisi.
Setelah dihidrolisis, larutan dipartisi dengan pelarut eter 10 ml dengan
menggunakan corong pisah. Eter digunakan karena memiliki kepolaran yang sama
dengan aglikon flavonoid (kuersetin), maka seluruh senyawa kuersetin akan
tertarik kedalam pelarut eter. Ekstraksi dilakukan sebanyak 3 kali untuk
memaksimalkan pengisolasian. Fase eter dikumpulkan kemudian ditambahkan Na
sulfat anhidrat untuk menyerap molekul air yang ada dalam eter, sehingga larutan
benar-benar murni eter dan aglikon flavonoid. Fase eter ini diuapkan dan
selanjutnya residu yang ada ditambahkan methanol sampai 5 ml sebagai pelarut
untuk dilakukan KLT (Sampel B1). Bagian air-asam sisa hidrolisis diuapkan diatas
penangas air hingga tersisa 1 ml (Sampel B2), lalu dilakukan analisis KLT.

Analisis Kualitatif

Sampel uji dari larutan A, B1, dan B3 diuji menggunakan metode KLT.
Masing-masing sampel ditotolkan sebanyak 4 penotolan. Digunakan dua sistem
fase gerak yang memiliki perbedaan kepolaran, bertujuan untuk mengoptimalkan
pemisahan antara glikosida dan aglikon. Sistem pertama menggunakan fase gerak
asam asetat 15% yang sifatnya polar. Sedangkan sistem kedua menggunakan fase
gerak n-butanol : asam asetat : air (4:1:5 v/v; lapisan atas) yang bersifat nonpolar.
Menurut teori, pada sampel B1 terkandung kuersetin hasil hidrolisis dari rutin,
sedangkan pada sampel B2 tidak terkandung apa-apa, karena apabila hidrolisis
berjalan sempurna, rutin telah terurai menjadi glikon dan aglikonnya.

Pada analisis KLT dengan fase gerak asam asetat 15%, secara teori rutin
(glikosida) akan lebih terbawa oleh fase gerak daripada aglikonnya karena
glikosida bersifat lebih polar. Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan
bahwa hidrolisis yang dilakukan belum sempurna karena masih terdapat banyak
bercak baik pada sampel B1 maupun sampel B2, namun pada sampel B1 terlihat
bercak yang lebih tertahan pada fase diam dan berfluoresensi kuning pada UV366,
bercak tersebut diduga merupakan kuersetin. Pada sampel B2, masih terdapat
benyak bercak yang serupa dengan sampel A. Hal ini terjadi karena hidrolisis yang
dilakukan belum sempurna, pada percobaan di laboratorium hanya berjalan 30
menit padahal seharusnya 1 jam. Apabila hidrolisis telah berjalan sempurna maka
pada sampel B1 akan terlihat bercak kuersetin dan pada sampel B2 tidak terdapat
bercak karena hanya menyisakan gula. Selain itu pemisahan KLT yang kurang
sempurna juga menyulitkan analisis.

Pada analisis KLT dengan fase gerak butanol : asam asetat : air (4:1:5),
secara teori kuersetin (aglikon) akan lebih terbawa fase gerak daripada
glikosidanya karena aglikon bersifat lebih nonpolar. Berdasarkan hasil percobaan
pada sampel B1 terlihat bercak yang lebih terbawa fase gerak dan berfluoresensi
kuning pada UV366, bercak tersebut diduga merupakan kuersetin. Sedangkan pada
sampel B2 masih terdapat banyak bercak yang hampir serupa dengan sampel A
sehingga disimpulkan hidrolisis belum berjalan sempurna. Rutin belum terurai
menjadi glikon dan aglikonnya.

Deteksi terhadap flavonoid dilanjutkan dengan pereaksi sitroborat. Pereaksi

sitroborat ini bereaksi dengan flavonoid menghasilkan kompleks berwarna kuning
seperti reaksi dengan AlCl3. Meskipun beda sisi reaksi keduanya menghasilkan
kompleks yang berwarna sama. Berdasarkan hasil percobaan terlihat bercak yang
berwarna kuning namun karena hidrolisis yang belum sempurna dan pemisahan
KLT yang kurang sempurna membuat analisis sulit dilakukan.

Analisi Kuantitatif

Analisis kuantitatif flavonoid dilakukan dengan metode spektrofotometri.

Larutan baku kuersetin dibuat dengan berbagai tingkat konsentrasi yaitu 1 ppm, 5
ppm, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm, dan 100 ppm yang dibuat duplo. Seri konsentrasi
pertama direaksikan dengan Na asetat, aquadest, dan AlCl3, sedangkan seri
konsentrasi kedua direaksikan dengan Na asetat dan aquadest tanpa penambahan
AlCl3. Kemudian semua seri konsentrasi diukur absorbansinya dan dilakukan
regresi linier, kadar kuersetin sebagai y dan selisih absorbansi larutan baku dengan
AlCl3 dengan absorbansi larutan baku tanpa AlCl3 sebagai x. Prinsipnya AlCl3
akan membentuk kompleks asam yang stabil dengan C-4 keto maupun C-3 atau C-
5 hidroksil flavon dan flavonol (Chang, et al, 2002). Persamaan kurva baku yang
diperoleh adalah Y = 0,0365 x - 0,2063.

Sampel yang terdiri dari larutan sampel B1, Na asetat, aquadest, methanol,
dengan dan tanpa AlCl3 diukur absorbansinya pada panjang gelombang 415 nm.
 Selisih absorbansi yang dihasilkan adalah 1,183; 1,223; dan 1,954. Kemudian
dimasukkan ke persamaan regresi linier untuk mendapatkan x, yaitu 38,063 ppm;
39,159 ppm; dan 59,186 ppm. Perhitungan kadar flavonoid total menghasilkan
4,547 x . Sedangkan % b/b ekivalen menghasilkan rata-rata
mg kuersetin/100 ml.

JAWABAN PERTANYAAN
1. Bagaimana dapat diketahui bahwa hidrolisis yang dikerjakan telah sempurna?
Jawab:

Cara untuk mengetahui apakah hidrolisis glikosida flavonoid telah sempurna

adalah dengan melihat bercak hasil pengembangan sampel A, sampel B1, dan
sampel B2. Jika hidrolisis sempurna, pada sampel B1 akan tampak bercak
kuersetin dan pada sampel B2 tidak terlihat bercak.

2. Apa perbedaan fluoresensi rutin (flavonoid-3-glikosida) dan aglikonnya dan

bagaimana sifat keduanya dalam dua jenis system fase gerak yang digunakan?
Jawab:
Fluoresensi rutin lebih terang daripada aglikonnya karena gugus kromofor rutin
lebih banyak. Gula atau glikon banyak mengandung gugus OH, dan gugus OH
tersebut merupakan auksokrom. Gugus auksokrom ini akan hilang jika ikatan
glikosidik lepas. Dalam sifat fase gerak, rutin lebih cenderung polar karena
mengikat gula atau glikon yang sifatnya polar sedangkan aglikonnya lebih
cenderung non polar, sehingga rutin akan mudah terbawa oleh fase gerak asam
asetat 15% dan kuersetin (aglikon) akan cenderung lebih terbawa oleh fase
gerak BAW.

IV. PUSTAKA
Anonim, 1986, Materia Medika Indonesia, Jilid IV, Departemen Kesehatan RI,
Jakarta.
Chang, C., Yang, M., Wen, H., Chern, J., 2002, Estimation of Total Flavonoid
Content in Propolis by Two Complementary Colorimetric Methods, Journal of
Food and Drug Analysis, Vol. 10, No. 3, Pages 178-182.
Harborne, J.B., 1996, Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan, Penerbit ITB, Bandung.
Stahl,E., 1985, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, ITB, Bandung.
Wagner,H, Sabine Balat, 1996, Plant Drug Analysis, Springer Verlag Berlin,
Heidelberg, Germany.