HK1.3.4263312018*.52. Jawaban Surat Substantif*** 2510512018 11:03:49.

--SURYANA***Terkait dengan
POO2Ol3O459BT--PROSES PRODUKSI DAN APLIKASI . E E
E
 dengan I
HK|.3.42633 l2Olg**.SZ.Jawaban Surat Substantif*** 25lO5t2O1B 11:03:49***SURYANA***Terkait EI
P00201 304598r- S PRODUKEMAI.II4R{IKNfusrT, TEKNoLoGI DAN PENDIDIKAN TIN
El
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
TEMBAGA PENELITIAN DAN PENGABDIAN KEPADA r
falan lr. Sutaml No. 364 Kentingan Surakarta Telp. (0271) 632916Eax{027t) 6329358
http://www.lppm.uns.ac.id: E-mail: Ippm@uns.ac.id

SURAT PENGANTAR
Nomor: \ \69 /LrN27 .Zlrnu n0L8

Yth. Direktur Jenderal Kekayaan Intelektual

Kementrian Hukum dan Hak Asasi Manusia
Jakarta

No Isi Barang Jumlah Keterangan

1 Respon dan hasil revisi atas 3 lembar Kami kirimkan dengan hormat unh*
pemeriksaan substantif yang dikirim diproses lebih lanjut.
pada tanggal 15 Maret 2018 dengan

nomor pendaftaran P00201304598 dan Atas perhatiannya, kami ucapkan

judul invensi PROSES PRODUKSI terima kasih.
DAN APLIKASI PAKAN
TAMBAHAN YANG
MENGANDUNG FITASE PADA
PAKAN AYAM BROILER

,G{
2 ILAY 2018

+ f(,
E +
2 72
z
2d
t 1
M.Si., Ph.D
ETUA.
/)
99403 1001
 KEF/ENTERI.AN HUKUM OAN HAK ASASI MA,NUSIA
REPUELIK INDONESIA
DIREKTORAT JENDERAL KEKAYAAN INTELEKTUAL
Jl. H R. Rasuna Said Kav 8-9. Kr.rningan Jakarta Selatan, 12940
Telepon: r02'tt 57905611 Faksimili: (021) 579056i1
Larnan http:^{iwvr/.dgip go id Surel dopatent@dgip go rd

Nomor : HKI-3-H|.05.02.0t.P00201304S98-TA 15 r{AR 2018

;
Lampiran 1 (satu halarnan)
Hal : Pemberitahuan hasil pemeriksaan substantif

Ytlr. LPPM Universitas Sebelas Maret

Jl. lr. Sutami36A Kentingan. Surakarta 57.t26
(u.p. Prof Dr. lr. Darsono. M.Si.i

Dengan ini diberitahukan, bahwa permohonan paten dengan.

I'ionrorPermohonan :
P00201304598
Pemohon :
LPPM Universitas Sebelas Maret
invensi
Jirdul :
PRosEs PRoDUKSI DAN APLIKAS| PAKAN TAMBAHAN YANG
I'IENGANDUNG FITASE PADA PAKAN AYAM BROILER

telah dilakukan pemeriksaan tahap pertanra dan drlunrpai kekurangan-kekurangan seperti tersebut
dalam lampiran.

Perbaikan kekurangan harus sudah diterima oleh Direktorat Jenderat paling tamhat 3
ttiga) butan
terhitung seiak tanggal surat pemberitahuan ini. gesuai dengan ketentuan pasal 5? r2r l-,p,:lilng-
undang Nomor 14 Tahun 2001 tentang.paten.

Perbaikan deskripsi, klaim dan gambar disampaikan dalam rangkap tiga pada halamsr-r ,a;ro
terpisah.

Jika kekurangan-kekurangan tersebut tidak diperbaiki clalam batas waktu tersebut cli ata,: ,r-raka
permohonan paten tersebut dianggap ditarik kernbali berdasarkan ketentuan Pasal
53 Lrrr,:larrg-
undang Nomor 14 Tahun 2001 tentang paten.

a.rr. Direktur Paten, Desain Tata Leterk

trBf[rEl Sirkuit Terpadu dan Rahasia OsganrS
an
Hffi
0Ctsl[' l8-57uBl

Dr , s.H, ril si
171 99503'lr),J r
TeEbusan.
1 Yth Direktur Jenderal Kekayaan lntelektual lsebagai Laporan)
2 Rani Nuradi. S.Si.
Nt P. 1 977050520031 22001

F.'t ttt llll.i a/ir'-'t,/-i

t)li Ir lalcl ll ) I {l
 LatrtPtr:rn 1

HASIL PEMERIKSAAN SUBS]ANTIF TAHAP

I

Nomor Permohonan: P00201 304598

(deskripsi klaim garrrbar)
pemeriksaan substantif telah dilakukan terhadap clokumen permohonan
dengan nomor Permohonan di atas :

IX t dokumen permohonan, asli seperti saal diajukan'

ii i deskripsi. I -7 aslisepertisaat diaiukan:
halaman
cleskripsi. - surat saudara tanggal :

halaman
tX I klaim. nomor 1 - 6 asli seperti saat diaiukan'
klaim. nomor ' surat saudara tanggal :
I I ganlbar,nomor asli seperti saat diajukan:
gambar. nomor sural saudara tanggal :

Hal-hal vanq harus diPerhatikan:

l.BerdasarkanPasal52Undang.UnrlangPatellt..lo'l4Tahun200l.clalaminvensiiniditemukan
trcberapa kelidaklelasan. diantaranya adalah:

a. Ketidakielasan Klatm

Klaint 1
contoh penyusunan klairi sebargai
Disarankan diubah menjadi klaim rnetode atau proses, dengan
berikut:
'Metode nremproduksifitase dengan bakterirekombinan E.Coli BL21(DE3t+pEASl'lyl dettqan
(DE3)dengan induksi IPTG 1 5 mil
cara transformasipEASI ke dalanr sel kompeten E.Coli BL?1 "
..tr*u sedikitnya 94 mettit inkubasi pada pH7 dan temperatur 4l)oc
Klaim 2,
fitase cekaman beku
Metode menurut klaim 1, dimana diikuti dengan proses ekstraksi

dsb.
b Ketidaklelasan lstilah
"(b/v)'
lstilah '(w/v)" disaranian diubah menjadi
' cligrinder" t seluruh spesifikasrt disarankan diubah menjadi
"digerinda"

keberatan periettksa
2 Penreriksaan tahap lanjut akan dilakukan Setelah Saudara menanggapi
pcrbaikan dan disertai dengan
seJuai dengan Ouiir f 1ii atas, dan telah mengirimkan deskripsi
salinan lunak (soft-coPY) dari deskripsi tersebut

melalur alanra:t errtail:

Untuk kelancaran komunikasi pemetikSaan' perneriksa dapat dihubungi
rani105@yahoo.com
Pemeriksa.

RaniNuradi, S.Si.
NtP. 1 977050520031 22001
 L

Deskripsi

PROSES PRODUKSI DAI{ APLIKASI PAK;AI.I TAI'IBJATIAN YAI\iG MENGANDUNG

FITASE PADA PAKAI{ AYAI.{ BROILER

5 Bidang Teknik Invensi

fnvensi ini berhubungan dengan proses pembuatan serbuk
pakan tambahan yang mengandung fitase untuk campuran pakan
ayam broiler

10 Latar Belakang Invensi

Fitase adalah enzim yang dapat menghidrolisis asam
fitat. Asam fitat tidak dapat dicerna oleh ayam broiler dan
diekskresikan ke Iingkungan, sehingga dapat mencemari
Iingkungan dengan ter;adinya eut.rofikasi. Pemberian pakan
15 tambahan yang mengandung enzim memerlukan sentuhan teknologi
agar dapat berfunqsi di dalam saluran pencernaan ayam
broiler, menqinqat dengan adanya enzim pencernaan dan pH
ekstrem asam di dalam saluran pencernaan tersebut. Selaj-n itu
juga ha::us awet selama penyimpanan cian mudah dicampurkan
20 dalam pakan ayam broiler.
KfebsielTa sp. strain ASR1 penghasil fitase yang telah
dapat diisolasi dari akar tauaman pacii IR64 dan homolog
dengan karakter makroskoprs, mikroskopis, uji biokimia dan
l6SrDNA dari KLebsieTta sp. Fitase pada E. coJ.i mempunyai pH
25 optimum 4,0 dan fitase KlebsieLla sp. sangat aktif pada pH 5.
Optimasi temperatur fitase E. coLi pada temperalur 50 sampai
55 "C dan fitase Kfebsiefl-a sp. pada temperatur 45 sampai
50"C (Sajidan et a7., 2OO4a).
Fitase dari bakteri Kl-ebsieLl-a sp. strain ASRl telah
30 dapat dimurnikan, dikarakterisasi dan disekuensi gennya. Gen
phyK dari bakteri tersebut telah dapat dr-kloning ke dalam
pTasmid vector pET22b (+) produk Novagen dan diekspresikan
dalam sel kompeten E. coli strain C41 (DE3) (Sajidan et df.,

\
 2

2004b) dan E. cofi BL27(DE3) (dihasilkan bakteri rekombinan

pEASI-AMP lE. coLi BL27 (DE3) +pET22b+ (+)pEAS1-
AMPI) (Nuhriawangsa, 2008), sehingga dapat dihasilkan fitase
dari bakteri rekombinan yang terkarakterisasi. Fitase ini
5 masuk dalam golongan histidin fosfatase asam (Bohm et af.,
2010), mempunyai kisaran aktivitas pada pH 2 sampai 8 dan
suhu 35 sampai 50oC (Nuhriawangsa et a7., 2008). Selain itu
juga dapat menghidrolisis asam fitat sampai mioi nosito]
monofosfat (Sajidan et ai., 2004).
10 Fitase ini juga telah dapat dienkapsulasi menggunakan
sito-oan denEan bahan pembawa bekatul jagung dan dikeringkan
dalam bentuk serbuk (Nuhriawangsa et dl., 20L2a), sehingqa
tahan asam, panas, mudah disimpan dan mudah d,icampurkan ke
dalam pakan. Aplikasi pada ayam broi-fer fase grower
15 menunjukkan dapat meningkatkan PBB, FCR, P' protein dan
glukosa darah (Nuhriawangsa et dl., 20L2b), kecernaan P, Ca
dan protein kasar, kanciungan P dan Ca t-ibia dan mertjngkatkan
ciaging dada (Nuhriawangsa et a7., 2013) .
Sequ.en DNA penyandi f itase Cari K.LebsielTa pneumoniae
20 ASR1 telah dipublikasi pada pusat database GenBank dunia
(http: / /www. ncbi . nLm. rtih. gov) dengan Accession number:
AYo91638.
Invensi ini dibanding paten dengan no. W0020LL04265
menggunakan sumber bakteri asli yang berbeda, invensi ini
25 menggunakan Kfebsieffa pneumonia yang dapat memotong asam
fitat sampai mioinositol monofosfat, ekstraksi enzim pada
invensi ini menggunakan cekaman beku, invensi ini larutan
fitase ditambahkan ion l4g'* 10-4 M sebanyak O,2Z dari total
larutan sebagai kofaktor fitase, aplikasi pada ternak invensi
30 ini menggunakan ayam, serbuk pakan tambahan menggunakan
sitosan sebagai enkapsulator dan pencampuran pakan sebanyak
7-2% dari total pemberian pakan ayam broiLer fase grower-
 J

Invensr ini dibanding paten dengan no- W00200401197

menggunakan sumber mikrobia yang berbeda. Paten no -

W00200401197 menggunakan sumber mikrobia berupa spesies

jamur, dan invensi ini mengggunakan sumber berupa spesies
5 bakteri untuk produksi fitase.
Invensi ini dibanding paten no. T 1061/08 - 3.3-09/
i0.2.207L menggunakan sumber enkapsulasi menggunakan polimer
karbohidrat terlarut pati dan konsentrasi 15%, sehingga
berbeda dengan j-nvensi ini yang menggunakan sumber
10 karbohidrat berupa sitosan dengan konsentrasl 0, BA dengan
perbandingan 1 : 1 (v/v) -
Invensi ini mengrgunakan sumber fitase dari bakteri
rekombinan pEASI-AMP lE. cofi BL27 (DE3) +pET22b+ (+)?EAS7-AIIPI,
bekatul- jagung, kofaktor ion logam Mq'*, dan sitosan lberasal
L5 dari kulit udang, nilai derajat deasetilisasi (DD) 83,26%,
diberikan dalam kondisi cair i,0? (b/v) dalam pelarut asam
asetat 0,5%, pH 3,3/kisaran 3-41 hasil produksi Unit
Pelayanan Teknis Balai Pengembangan Proses dan Teknologi
Kimia Lembaga IImu Pengetahuan Indonesia (UPT BPPTK LIPI)
20 Yogyakarta.
Keunggulan invensi- ini dengan menggunakan gen
phyK/pEAS7 dari Kl-ebsiel-La pnemoniae, sehinqga dihasilkan
fitase yang dapat menghidrolisis asam fi-tat sampai
mioinositol monofosfat dan tahan asam karena fitase masuk
25 dafam oolongan histidin fosfatase asam. Selain itu dengan
enkapsulasi menggunakan sj-tosan, sehingga produk pakan
tambahan yang dihasilkan tahan terhadap cekaman pH dan
protease di dalam saluran pencernaan. Aplikasj- pada campuran
pakan ternak membutuhkan serbuk dengan aktivitas fitase 400
30 unit dengan jumlah pemberian l-2% dari total pakan yang
diberikan sudah dapat meningkatkan kinerja produksi ayam
broiler.
 4

Uraian Singkat Invensi

Invensi yang diusulkan ini pacla prinsipnya adalah proses
produksi dan apl-ikasi pakan tambahan yang berupa serbuk untuk
ayam broiler fase grower, sehinqga invensj- ini mempunyai
5 beberapa keunggu.Ian menghasi-lkan f itase yang dapat
menghidrolj-sis asam fita.t sampai mioinosj-tol monofosfat,
tahaa asam/ tahan terhadap cekaman pH dan protease di dal-am
saluran pencernaan dan membutuhkan serbuk dengan aktivitas
fitase 400 unit dengan juinlah pembei:ian 7-2% dari total pakan
10 yang diberikan. Proses produksi untuk menghasilkan pakan
tambahan yang mengandung fitase dengan beberapa tahap:
a. Produksi fitase dari bakteri rekombinan E. coTi
BL27 (DE3) +?EAS7-AMP (induksi rPTG 1,5 mM setelah 94 menit
inkubasi, optimasi produksi pada pH 7 dan temperatur 40'C
15 dan penambahan kofaktor vig'* konsentrasi 10-4 M pada
fitase).
b. Ekstraksi f j-tase derrgan cekaman beku (pembekuan ciengan
nitrogen cair, setelah beku kemudian dicairkan pada
penangas air dengan suhu 40"C dengan pengulangan tiga
70 kali).
c. Enkapsulasi fitase menggunakan sitosan [pelarut asam
asetat konsentrasi 0,2% (b/v), sitosan konsentrasi 0, B%
dalam asam asetat 0,2% (v/v) pada pH 5, perbandingan
fitase dan sitosan 1 : 11.
25 d. Pengeringan dengan menggunakan oven (ketebalan maksimum
0,5 cm pada loyang, pada suhu 40oC selama 24 jam, diameter
granula 1 mm).
e. Aplikasi pada pakan ayam broil-er (aktivitas fi-tase 400
unit, pemberi-an 7-2* pada total pakan, waktu penyimpanan
30 pakan tambahan 3 minggu di kondisi lingkungan).
 5

Uraian Lengkap Invensi

Sebagalmana yang telah dikernukakan pada latar beiakang
invensi bahwa pakan tambahan yang mengandung fitase dari
bakteri rekombinan dapat digunakan pada campuran pakan ayam
5 broiler fase grower untuk meni-ngkatkan kuafitas pakan dan
kinerja produksi dan kinerja produksi fitase pada ayam
- broiler. Fitase pada pakan tambahan tersebut telah
dj-enkapsulasi denqan sitosan agar tahan terhadap pH rendah,
panas dan penyimpanan. Enkapsulasi fitase tersebut dicampur
10 bahan pembawa bekatul jagung sebaqai sumber fitat, sehj-ngga
mudah untuk diawetkan dan dicampur pada pakan ayam broiler.
Pakan tambahan tersebut diaplikasikan pada ayam broil-er dan
dapat meningkatkan produktivitas ayam broiler dan ramah
lingkungan, karena ekskreta yang dihasil-kan rendah asam
15 fitat.
Transformasi, produksi- bakteri dan produksi enzim
menggunakan metode menurut Sajidan (2.002) dan Novagen (2005)
yang dimodifikasi. Produksi bakterj- rekombinan dengan cara
transformasi pEAST ke dalam se1 kornpeten E. coLi BL27 dan E.
20 coli BL27 (DE3) dan untuk memproduksi fitase dengan
menggunakan inctuksi IPTG 1,5 mM, pH 7 dan temperatur 40"C.
Bahan yang digunakan untuk produksi bakteri rekombinan adalah
pEASI Plasmid-Vektor (Sajidan, 2002\, se1 kompeten E. coLi
BL27 (Novaqen, katalog 10232-3) dan IPTG (Novaqen, katalogt
25 70527-3) . Produksi fitase diawali dengan cara mengambil satu
kotoni bakteri rekombinan dari- media LB padat yang rnengandung
50 p9/m1 rekombinan, dimasukkan ke dalam 5 mI media LB yang
mengandung amfisilin (25 pglml) dan diinkubasi pada shaker
incubator dengan ternperatur 37oC dan kecepatan 100 rpm selama
30 6 jam. Produksi fitase pada kondisi pertumbuhan menuju
eksponensial-, dengan cara mengambil kultur cair dari kultur
yang telah diinkubasi selama 6 jam tersebut di atas sebanyak
2% dari jumlah media LB cair yang mengandung amfisilin 25
 6

p9/m1 yang akan digunakan untuk produksi fitase (v/v),

setelah inkubasi dalam shaker incubator pada suhu 31oC,
kecepat.an 100 rpm dan waktu 94 menit ditambahkan 1? dari
jumlah media cair 1,5 mM IPTG untuk induksi enzim. Modifikasi
5 dilakukan pada ekstraksi enzim dengan menggunakan metode
cekaman beku, larutan LB cair yang mengandung bakteri
rekcmbinan ciimasukkan dalam tabung dan ciibekukan daf am
l-arutan nitrogen cair, setelah beku kemudian dicairkan pada
penangas air dengan suhu 40"C sampai cair dan hal- inj- diulang
10 sampai 3 kali. Modifikasi dengan metode ini cii-harapkan dapat
dihasilkan fitase intra dan ekstraselul-er. Larutan LB cai-r
yang mengandung fitase tersebut ditambahkan .ion Mg'* 10-4 M
sebanyak 0,2% dari total l-arutan sebag'ai kofaktor f itase .
Fitase yang dihasilkan dienkapsulasi menggunakan sitosan
15 konsentrasi 0,8% denqan pelarut asam asetat 0,2%, dicampur
dengan bekatul- jagung dan dikeringkan dengan oven pada suhu
4 0oC. Asam ase tat dilarutkarr dalam a j-r dengarl konsentrasi
0,2% (b/v). Sitosan dilarutkan dalam larutan asam asetat 0,2e"
dengan korrsentrasi sitcsan 0, B% (v/v) secara bertahap dengan
20 pengadukkan pada suhu 37"C. Larutan yang mengandung sitosan
dicampur dengan larutan media LB cair yang mengandung fitase
pada pH 5 dengan perbandingan larutan enzim dan sitosan
adalah 1 : 1, (v /vl secara bertahap sampai homogen. Setel-ah
homogen larutan tersebut dicampur dengan bekatul jagung
25 (d:-ameter granula 1 mm) sed-ikit demi sedikit dengan
perbandingan bekatul jagung clengan larutan enzim + sitosan
adalah 1 : 3 (v/b) sampai homogen- Campuran tersebut kemudian
dimasukkan dalam loyang dengan ketebalan maksimum 0r 5 cm dan
dikeringkan dalam oven pada suhu 40"C selama 24 jam. Setelah
30 kering, campuran tersebut digerinda dan diayak dengan ayakan
ukuran granula 1 mm, sehingga didapatkan serbuk pakan
tambahan denqan ukuran I mm.
 7

Aplikasi pada ayam broiler fase grower dengan cara

mencampurkan serbuk pakan tambahan pada pakan ayam broiler
(berbasis jagung dan kedelai denqan kandungan P av 0,35%)
dengan jumlah 7-2% dari total pakan yang diberikan setiap
5 pemberian pakan (sehari dua kali, Pagi jam 08.00 dan sore
jam 16.00) dan penyimpanan serbuk pakan tambahan tersebut
maksimum 3 minggu pada suhu kamar
Pakan tambahan berupa campuran fitase denqan bekatul
3agung yang dienkapsulasi dengan sitosan dan dikeringkan
10 secara oven dapat memperbaiki nilai ECR, PBB, kecernaan bahan
kering ekskretal, kecernaan P ekskretal, kecernaan kalsium
ekskretal, kecernaan protein kasar ekekreLal, kecernaan
glukosa ekskretal, P darah, protej-n total darah, glukosa
darah, panjang tibia, Ca tibia, abu tibia dan bobot dada-
15
 8

Klaim
1. Metode memproduksi fitase dengan bakteri rekombinan E
cof i BL27(DE3)+pEAS7-AI"IP dengan cara transformasi
pEAST ke
dalam sel kompeten E. coLi BL21 tDE3) dengan
induksi IPTG
5 1,5 mM setelah 94 men't inkubasi pada pH 7 dan temperatur
40.c.
2' Ektrak'fitase yang dihasilkan pada metode klaim
l- dimana
diikuti dengan proses ekstraksi fitase cekaman beku
denqan
cara larutan LB cair yang mengandung bakteri rekombinan
10 dinrasukkan dalam tabung dan dibekukan daram
larutan
nitroqen cai-r, setelah beku kemudian dicairkan pada
penangas air dengan suhu 40"c dan hal ini
diulang sampai 3
kali.
3' Ekstrak fitase yang dihasilkan pada klaim ke 2
ditambah
L5 dengan kofaktor dengan cara -r-arutan LB cair
yang
mengandung' fitase citambah ion Mgr* 10-4 M
sebanyak 0,2%
dari totaf r-arutan untuk stabiri.sasi dan meningkatkan
aktivitas fi_tase.
4 ' Ektrak fitase yang dihasirkan pada klaim 3 dienkapsurasi
20 dengan cara:
a' Sitosan difarutkan dalam r-arutan asam asetat 0,2%
dengan konsentrasj- sitosan 0, B? (v/v) secara
bertahap.
b. Larutan yang mengandung sitosan dicampur dengan
25 r-arutan medi-a LB cair yang mengandung fitase pada
pH 5 dengan perbandingan larutan enzim dan
sitosan
adalah1: I (v/v) sampai_homogen.
c' setelah homogen larutan tersebut dicampur denqan
bekatul jagung sedikit demi sedikit dengan
30 perbandingan bekatul jagung dengan larutan
enzim
dan sj-tosan adalah 1 : 3 (b/v) sampai homogen-
5 ' campuran ekstrak fitase dan
bekatul jagung pada klaim ke 4
dikeringkan dengan cara campuran dlmasukkan dar-am
royang
 9

dengan ketebalan maksimum 0,5 cm dan dikeringkan dalam

oven pada suhu 40"C selama 24 jam. Setelah kering,
campuran tersebut digerinda, sehingga didapatkan serbuk
pakan tambahan dengalr diameter 1 mm.
5 6. Serbuk pakan tambahan yang dihasilkan pada klaim 5
diaplikasi pada ayam broiler fase grower dengan cara
mencampurkan serbuk pakan tambahan pada pakan ayam broiler
dengan jumlah l-22 dari total pakan yang diberikan setiap
pemberian pakan dan penyimpanan serbuk pakan tambahan
10 tersebut maksimum 3 minggu pacia suhu kamar.

15
 10

Abstrak

PROSES PRODT KSI DAI{ APTIKASI PAIGAI{ TAMBAIIA}I YAI{G MENGAI.IDUNG

EITASE PADA PAKiNI AYAI.{ BROILER
5

Invensi ini berhubungan dengan produksl pakan tambahan

yang mengano-ung fitase dari bakteri rekombinan dan
aplikasinya pada pakan ayam broif er fase girower. Pr:oduksi
fitase dari bakteri rekombinan dengan cara transformasi
10 pEASI-AMP ke dal-am seI kompeten E. col-i BL27 (DE3) dengan
menggunakan induksi IPTG 1,5 mM, pI{ I, temperatur 40"C,
penambahan kofaktor dengan menggunakan ion Nlg'-' 10-4 M
sebanyak 0,2%, ektraksi enzim dengan cekaman beku menggunakan
nitrogen cair dan pemanasan suhu 4OoC, enkapsulasi
15 mengEunakan sitosan konsentrasi 0, B% denqan pelarut asam
asetat 0,2%, pencampuran fitase enkapsulasi dengan bekatr:l
jagung dengan perbandingan 3 : -L, dan pengeringan dengan oven
pada suhu 40"C selama 24 jam dengan ketebalan maksimum 0,5 m
telah menghasilkan se.r:buk pa,kan tambahan dengan ukuran
20 granula 1 mm. Aplikasi dengan cara mencampurkan serbuk pakan
tambahan pada pakan ayam broiler dengan jumlah l-2% dari
total pakan yang diberikan setiap pemberian pakan dan
penyimpanan serbuk pakan tambahan tersebut maksimum 3 mi-nggu
pada suhu kamar dapat meningkatkan kinerja procluksi dan
25 produksi fitase. Serbuk tambahan ini tahan terhadap cekaman
kondisi pencernaan ayam broiler, rnudah disimpan dan mudah
dicampurkan pada pakan ayam broj-ler.
 KEMENTERiA,N HUKUM DAN HA.K ASASI MA,NUSIA
REPUBLIK INDONESIA
DIREKTORAT JENDERAL KEKAYAAN INTELEKTU,AL
Jl. H.R. Rasuna Said Kav 8-9, Kr.rningan. Jakarta Sclatan, 12940
Telepon: (021 ) 5790561 1 Faksirnili: r021 t 5790561 1
Laman' http: ','wLvw.dgip go id Surel dopatent@dgip go id

Nomor : HKI-3-H1.05.02.01.P00201304598-TA 15 l.lAR 2018

:
Lampiran 1 (satu halaman)
Hal : Pemberitahuan hasil pemeriksaan substantif

Yth. LPPM Universitas Sebelas Maret

Jl. lr. Sutami 36,0, Kentingan. Surakarta 57126
1u.p. Prof Dr. ir. Darsono. M.Si.)

Dengan ini diberitahukan, bahwa permohonan paten dengan.

I'lonrorPermohonan P00201304598 :
Pemohon :
LPPM Universitas Sebetas Maret
Judulinvensi :
PRoSES PRoDUKS| DAN APL|KAS| PAKAN TAMBAHAN YANG
MENGANDUNG FITASE PADA PAKAN AYAM BROILER

telah dilakukan pemeriksaan tahap pertanla dan dr,iumpai kekurangan-kekurangan sepertr ter:ebut
dalanr lanrpiran.

Perbaikan kekurangan harus sudah diterima oleh Direktorat Jenderal paling lambat 3 itiga) Dulan
terhitung sejak tanggal sutat pemberitahuan ini. sesuai dengan ketentuan Pasai 52 r2r i-trr,:lang-
undang Nomor 14 Tahun 200'l tentang.Palen,

Perbaikan deskripsi, klaim dan gambar disampaikan cialam rangkap tiga pada halam;irr ;arrg
terpisah.

Jika kekurangan-kekurangan tersebut ticlak cliperbaiki dalam batas waktu tersebut di ata:s. rnaka
permohonan paten tersebut dianggap ditarik kembali berdasarkan ketentuan Pasal 53 Urrdang-
undang Nomor 14 Tahun 2001 tentang Paten.

a.n. Dircktur Paten. Desain Tata Letak

ffi
Sirkuit Terpadu dan Rahasra DaganrS
at"l

00-i(r t8-5r(.8i

S.H,, M.Si
171995031001
Ternbqsan:
1 Yth. Direktur Jenderal Kekayaan lntelektual (sebagai Laporan)
2 Rani Nuradi. S.Si.
Nr P. 1 977050520031 22001

!:','t,'t Hk'l.i r,it- -'//i.;

illi N lirlct :il 8
1
 LatrtPitan 1

TAHAP I
HASIL PEMERIKSAAN SUBSTANTIF
Nomor Permohonan: P00201 304593

Pemeriksaansubstantiftelahdilakukanterhadapdokumenpermohonan(deskripsiklaim,galrlcarl
denga n nomor Permohonan di atas :

ixl Jo[uinJn permohonan. asli seperti saat dialukan'

IX] deskripsi, 1. 7 aslisepertisaat diajukan:
halaman
cleskripsi - surat saudara tanggal :

halanran
txl klarm. nomor 1 - 6 asli seperti saat diaiukan'
klaint, nontor - surat saudara tanggal '
ganlbar. nomor asli seperti saat diajukan:
ganrbar. nomor surat saudara tanggal :

Hal-hal Yanq harus diPerhatikan

No '!4 Tahun 2001, dalam invensiini dileriiukan
1 Berdasarkan Pasal 52 Undang-Undang Paten
treberapa ketidakielasan. diantaranya adalah:

a. Ketidakielasan Klaim /
Klainr 1
proses, dengan contoh penyusunan klatnr sebai:l:'r
Disarankan diubah menjadi klainr metode atau
berikut: rJenrJ,r
-Metode memproduksifitase clerrgan bakterirekombinan E Coti BL21(DE3)+pEAS1.-AMP
(DE3) dengan induksi IPTG 1'5 nrl'r'1
cara transformasi pEASI ke dalair sef tompeien i.Coti BL21
i"frrn. sedikitnya g4 menil inkubasi pada pH7 dan temperatur 40"C."
Klaim 2.
fitase cekaman beku'
Mefode menurut klaim 1, dimana diikuti dengan proses ekstraksi

dsb.
b Ketidakjelasan lstilah
"1bh')"
lstilah "(w/v1" disaranian diubah menjadi
"digerinda"
OigrinOer' r'selurufr spesifikasi) disarankan diubah menjadi
:

keberaton perier tksa

/. Penrerik$aan tahap lanjut akan dilakukan seteleh Saudara menanggapi
perbaikan dcskripsidan diseilai dengat't
."ruriOingan Ouiir I diaias. dan telah mengirinrkan
salinan h.rnak (soft-copy) dari deski'ipsi tersehttt

melalui alantat rrriail

5 t.rntuk kelancaran komunikasi pemeriksaan, oemeriksa dapat dihubungi
rani105@yahoo.com
Pemeriksa.

RaniNuradi, S,Si.
NlP. 1 97705052003 1 22001
 L

Deskripsi

PROSES PRODUKSI DAI{ APLIKASI PAI(AI{ TAI'TELTIAI{ YA}IG MENGANDUNG

EITASE PADA PAKAN AYAI{ BROILER

5 Bidang Teknik Invensi

Invensi ini berhubungan dengan proses pembuatan serbuk
pakan tambahan yang mengandung fitase untuk campuran pakan
ayam broiler.

10 Latar Belakang Invensi

Fitase adalah enzim yang dapat menghidrcl-isis asam
fitat. Asam fitat tidak dapat dicerna oleh ayam broiler dan
diekskresikan ke Iingkungan, sehingga dapat mencemari
Iingkungan dengan terjadinya eutrofikasi. Pemberian pakan
15 tambahan yang mengandung enzim memerluk^atr sentuhan teknologi
agar dapat berfungsi di dalarn sal-uran pencernaan ayam
broi-'l-er, rnengingat denga,n adanya enzim pencernaan dan pH
ekstrem asam di dalam sa.luran pencernaan tersebut. Selain itu
juga harus awet selama penyimpanan dan mudah dicampurkan
20 dalam pakan ayam broiler.
Kl-ebsieTLa sp. strain ASR1 penghasil fitase yang telah
dapat diisolasi dari akar tanaman padi IR64 dan tromolog
dengan karakter makroskopis, mikroskopj-s, ,rj i biokimia dan
l6SrDNA darj- Klebsielfa sp. Fitase pada E. co-li mempunyai pli
25 cptimum 4,0 dan fj.tase Kl-ebsielTa sp. sangat aktif pada pH 5.
Optimasi temperatur fitase E. col-i pada temperatur 50 sampai
55 "C dan fitase KLebsiel-7a sp. pada temperatur 45 sampai
50"C (Sajidan et a7., 2004a) .
Fitase dari bakteri Klebsiell"a sp. strain ASRl telah
30 dapat dimurnikan, dikarakterisasi dan dj-sekuensi gennya. Gen
phyK dari bakteri tersebut telah dapat di-kloning ke dalam
plasmid vector pET22b (+) produk Novagen dan diekspresikan
dalam se1 kompeten E. col,i strain C41 (DE3) (Sajidan et a7.,
 2

2004b) dan E. cofi BL27 (DE3) (dihasilkan bakteri rekombinan

pEASI-AMP [E- cofi BL27 (DE3) +pET22b+ (+)PEASI-
AMP)) (Nuhriawangsa, 20OB) , sehingga dapat dihasilkan fitase
dari bakteri rekombinan yang terkarakterisasi. Eitase ini
5 masuk da1am golongan histidirr fosfatase asam (Bohm et df.,
20L0), mempunyai kisaran aktivitas pada pi{ 2 sampai 8 dan
suhu 35 sainpai 50oC (Nuhriawangsa et af., 2008). Selain itu
juga dapat menghidrolisis asam fitat sampai mioinositol
monofosfat (Sajidan et a.1-. , 2004) .
10 Eitase ini juga tel-ah dapat dienkapsuiasi menggunakan
sitosan dengan bahan pembawa bekatul- jagung dan dikeringkan
dalam bentuk serbuk (Nuhriawangsa et a7., 2412a), sehingga
tahan asam, panas, mudah disimpan dan mudah Cicampurkan ke
dalam pakan. Aplikasi pada ayam broiler fase grower
15 menunjukkan dapat meningkatkan PBB, ECR, P, protein dan
glukosa darah (Nuirriawangsa et af . , 201,2b) , kecernaan P, Ca
dan protein kasar, karrdrrngan P dan Ca tibia dan menj-ngkatkan
daging dada (Nuhriawangsa et al., 2013) .
Sequen DNA penyandl- fitase dari KlebsieLTa pneuntctniae
20 ASR1 telah dipublikasi pada pusat database GenBank dunia
(http: / /www. ncbi . nLm. nih. gcv) dengan Accession number
AYo91638.
Invensj- ini dibanding paten dengan no. W0020LL04265
menggunakan sumber bakteri asli yang berbeda, invensi ini
25 menggunakan KLeb-cief l-a pneumonia yang dapat memotong asam
fitat sampai mioinositol monofosfat, ekstraksi enzim pada
invensi ini menggunakan cekaman beku, invensi ini farutan
fitase ditambahkan j-on Mg'* 10-4 M sebanyak 0,2% dari total
Iarutan sebagai kofaktor fitase, aplikasi pada ternak invensi
30 ini menggunakan ayam, serbuk pakan tambahan menggunakan
sitosan sebagai enkapsulator dan pencampuran pakan sebanyak
1-2t dari total pemberian pakan ayam broiler fase grower.
 3

Invensi ini dibanding paten dengan no- W00200401191

menggunal<an sumber mikrobia yang berbeda' Paten no-
V[00200401197 menggunakan sumber mikrobia berupa spesies
jamur, dan invensi ini mengggurtakan sumber berupa spesies
5 bakteri untuk produksi fitase.
Invensi ini dibanding paten no. T 1,057 tl08 - 3.3.09/
L0.2.20L1 menggunakan sumber enkapsulasi menggunakan polimer
karbohidrat terlarut pati dan konsentrasi 15%, sehingga
berbeda denqan invensi ini yang menggunakan sumber
10 karbohidrat berupa sitosan dengan konsentrasl 0, BB dengan
perbandj-ngan 1:1 (v/v) .
Invensi ini menggunakan sumber fitase dari bakteri
rekombinan pEASI-AMP lE. cofi BL21 (DE3) +pET22b+ (+)?EAS7'AMP\,
bekatul jagung, kofaktor ion logam Mq'*, dan sitosan lberasal
15 dari kulit udang, nilai derajat deasetil-isasi (DD) 83,26%,
diberikan dalam kondisi cair 7,02 (b/v) dalam pelarut asam
asetat 0,5%, pH 3,3/kisaran 3-41 hasil produksi Unit
Pe.Iayanan Teknis BaIai Penqembarrldrr Proses dan Teknologi
Kinia Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (UPT BPPTK LIPI)
20 Yogyakarta.
Keunggulan invensi in"i dengan menggunakan gen
phyK/pEAS7 dari KTebsieJ-J-a pnemoniae, sehingga dihasilkan
f itase yang dapat mengrhidrolisis asam f j-tat sampai
mioinositol monofosfat dan tahan asam karena fitase masuk
25 dalam golongan histidin fosfatase asam. Selain itu dengan
enkapsulasi menggunakan si-tosan, sehingga produk pakan
tambahan yang dihasilkan tahan terhadap cekaman pH dan
protease di dalam saluran pencernaan. Aplikasi pada campurar-l
pakan ternak membutuhkan serbuk dengan aktivitas fitase 400
30 unit dengan jumlah pemberian 7-2% darj- total pakan yang
diberikan sudah dapat meningkatkan kinerja produksi ayam
broiler.
 4

Uraian Singkat Invensi

fnvensi yang diusulkan ini pada prinsipnya adalah proses
produksi dan aplikasi pakan tambahan yang berupa serbuk untuk
ayam broiler fase grower, sehingga invensi ini mempunyai
5 beberapa keunggulan menghasilkan fitase yang dapat
menghiclrolisis asam fitat sampai mioinositol monofosfat,
tahan asam, tahan- terhadap cekaman pH dan protease di dalam
saluran pencernaan dan membutuhkan serbuk dengan aktivitas
fitase 400 unit dengan jumlah pemberian 7-2% dari total pakan
10 yang diberikan. Proses produksi untuk menghasilkan pakan
tambahan yang mengandung fit.ase dengan beberapa tahap:
a. Produksi fitase dari bakteri rekombinan E. coli
BL27(DE3) rpEAST-AIUIP (induksi IPTG 1,5 mM setel-ah 94 menj-t
inkubasi, optimasi produksi pada pH 7 dan temperatur 40"C
15 dan penambahan kofak-tor Mg'* konsentrasi 10-4 M pada
fitase).
b. Ekstraksi f itase cieirgan cekaman beku (pembekuan dengan
nj-trogen cair, setelah beku kemudian dicairkan pada
penangas air dengan suhu 40"C dengan pengulanqan tiga
20 kali).
c. Enrapsulasi fitase menggunakan sitosan [pelarut asam
asetat konsentrasi 0 r2% (b/v) , sitosarr konsentrasi 0, B%
dalam asam asetat 0,2% (v/v) pada pH 5, perbandingan
fitase dan sitosan l- : 11.
25 d. Pengeringan dengan menggunakan oven (ketebal-an maksimum
0,5 cm pada loyang, pada suhu 40"C selama 24 jam, diameter
granula 1 mm).
e. Aplikasi pada pakan ayam broil-er (aktivitas fitase 400
unit, pemberian 7-2% pada total- pakan, waktu penyimpanan
30 pakan t.ambahan 3 minggu di kondisi lingkungan).
 5

Uraian Lengkap Invensi

Sebagaimana yang telah dikemukakan pada latar belakang
invensi bahwa pakan tambahan yang mengandung fitase dari
bakteri rekombinan dapat digunakan pada campuran pakan ayam
5 broiler fase grower untuk meningkatkart kualitas pakan dan
kiner j a p,:oduksi dan kiner j a pr.oduksi f itase pada ayam
broiler. Fit-ase paJa pakan tambahan tersebut te-l-ah
dienkapsulasi dengan sitosan agar tahan terhadap pH rendah,
panas dan penyimpanan. Enkapsulasi fitase tersebut dicampur
10 bahan pembawa bekatut jagung sebagai sumber fit.at, sehj-ngga
mudah untuk diawetkan dan dicampur pada pakan ayam hroiler-
Pakan tambahan tersebut diaplikasikan pada ayam broil-er Can
dapat meningkatkan produktivitas ayam broiler dan ramah
IJ-ngkungan, karena ekskreta yang dihasilkan rendah asam
15 fitat.
Transformasi, produksi bakteri dan produksi enzim
menggunakan metode men.rrut Sa; idan (20Ct2 ) dan Novagen (2005
)

yang' dimodifikasi. Produksi bakteri rekombinan dengan cara

transformasi pEAST ke dalam sel kompeten E. col-i BL27 dan E-
20 coli BL27 (DE3) dan untuk memproduksi fitase dengan
menggunakan induksi IPTG 1,5 mM, pH 7 dan temperatur 40"C.
Bahan yang digunakan untuk produksi bakteri rekombinan adalah
pEASI Plasmid-Vektor (Sajidan, 2002) , sel kompeten E. coli
BL21 (Novagen, katalog 10232-3) dan IPTG (Novagen, katalog
25 70521-3). Produksi fitase diawali dengan cara nrengambil satu
koloni bakteri rekombirran dari media LB padat yang mengandung
50 pg/ml rekombinan, climasukkan ke dalam 5 mI media LB yang
mengandung amfisilin (25 p9lm1) dan di-inkubasi pada shaker
incubator dengan temperatur 37oC dan kecepatan 100 rpm selama
30 6 jam. Produksi fitase pada kondisi pertumbuhan menuju
eksponensial, dengan cara mengambil kul-tur cair dari kultur
yang telah diinkubasi selama 6 jam tersebut di atas sebanyak
2% dari jumtah media LB cair yang mengandung amfisi-Iin 25
 6

p9lml yang akan digunakan untuk produksi fitase (v/v),

setelah inkubasi Calam shaker incubator pada suhu 3'7oC,
kecepatan 100 rpm dan waktu 94 menil- ditambahkan 1% ciari
jumlah medj-a cair 1,5 mM IPTG untuk induksi enzim. Modifikasi
5 dilakukan pada ekstraksi enzim dengan menggunakan metode
cekaman beku, Iarutan LB cair yang mengandung bakteri
rekombinan dinasukkan d-.:lam tabung dan dibekukan dalam
Larutan nitrogen calr, setelah beku kemudian dicaj-rkan pada
penangas air dengan suhu 40"C sampai cair dan hal ini diulang
10 sampai 3 kali. Modifikasi dengan metode ini diharapkan dapat
dihasilkan fitase intra dan ekstraseluler. Larutan LB cair
yang mengandung fi-tase tersebut ditambahkan ion Mg'* 10-4 M
sebanyak 0,2% dari total larutan sebagai kofaktor fitase.
Fitase yang dihasilkan dienkapsulasi menggunakan sitosan
15 konsentrasi 0r8% dengan pelarut asam asetat 0,2%, dicampur
dengan bekatul jagung dan dikeringkan denqan oven pada suhu
40"C. Asam. asetat difarutkan dalam air dengan konsentrasi
0t2Z (b/v). Sitosan difarutkan dalam larutan asam asetat 0,2eo
dengan konsentrasj- sitosan 0, B? ('r/v) secara bertahap dengan
20 pengadukkan pada suhu 37oC. Larutan yang mengandung sitosan
dicampur dengan larutan media LB cair yang mengandung fitase
pada pH 5 dengan perbandingan larutan enzim dan sitosan
adalah 1 : 1 (v/v) secara bertahap sampai homogen. Setelah
homogen Iarutan tersebul dicampur dengan bekatul jagung
25 (diameter granula 1 mm) sedikit derai sedikit dengan
perbandingan bekatul jagung dengan Iarutan enzim + sitosan
adalah 1 : 3 (v/b) sampai homogen. Campuran tersebut kemudian
dimasukkan dalam loyang dengan ketebalan maksimum 0,5 cm dan
dikeringkan dalam oven pada suhu 40oC selama 24 jam. Setelah
30 kering, campuran tersebut digerinda dan diayak dengan ayakan
ukuran granula 1- mm, sehingga didapatkan serbuk pakan
tambahan dengan ukuran 1 mm.
 1

Aplikasi pada ayam broifer fase grower dengan cara

mencampurkan serbuk pakan tambahan pada pakan ayam broiler
(berbasis jagung dan kedelai dengan kandungan P av 0,35%)
dengan jumlah 7-2% dari total pakan yang diberikarr setiap
5 pemberian pakan (sehari dua kali, pagi jam 08.00 Can sore
jam 16.00) dan penyimpanan serbuk pakan tambahan tersebut
maksirnum 3 minggu pada suhu k-amar.
Pakan tambahan berupa campuran fitase dengan bekatul
jagung yang dienkapsulasi dengan sitosan dan dikeringkan
10 secara oven dapat memperbaiki nilai FCR, PBB, kece::naan bahan
kering ekskretal, kecernaan P ekskretal, kecernaan kalsium
ekskretal, kecernaan protein kasar ekekretal, kecernaan
glukosa ekskretal, P darah, protei-n total darah, gJ-ukosa
darah, panjang tibia, Ca tibia, abu tibia dan bobot dada.
15
 6

Klaim
l.Metode memproduksi fitase dengan bakteri rekombj-nan E.
coLi BL27(DE3)+gEASI-AI"IP dengan cara transformasi pEASI ke
dalam sel kompeten E. col,i BL27 (DE3) dengan induksi IPTG
5 1,5 mM setefah 94 menit inkubasi pada pH 7 dan tempe::atur
40"c.
2. Ektrak fitase yang dihasilkan- pada metode klaim 1 dimana
diikuti dengan proses ekstraksi fitase cekaman beku dengan
cara Iarutan LB cair yang mengandung bakteri rekombiuan
10 dj-masukkan dalam tabung dan dibekukan dalam farutan
nj-trogen cair, setelah beku kemudian dicairkan pada
penangas air dengan suhu 40"C dan ha1 ini dj-ulang sampai 3
kali.
3. Ekstrak fitase yang dihasilkan pada klaim ke 2 ditambah
L5 dengan kofaktor dengan cara larutan LB cair yang
mengandung f itase ditambah ion Mg'* I 0-4 M seban1,a[ O ,2eo
dari total- Iarutan untuk stabilisasi dan meningkatkan
aktivitas fltase.
4. Ektrak fitase yang dihasilkan pada klaim 3 dienkapsulasJ-
20 dengan cara:
a. Sitosan dil-arutkan dalam larutan asam asetat 0,2%
dengan konsentrasi sj-tosan 0, B% (v/v) secara
bertahap.
b. Larutan yang meng'andung sitosan dicampur dengan
25 .l-arutan media LB cair yang mengandung fitase pada
pH 5 dengan perbandingan larutan enzim dan sltosan
adalah 1 : I (v/v) sampai homogen.
c. Setelah homogen larutan tersebut dj-campur dengan
bekatu] jagung sedikit demi sedikit dengan
30 perbandingan bekatul jagung dengan Iarutan enzj-m
dan sitosan adalah 1 : 3 (b/v) sampai homogen.
5. Campuran ekstrak fitase dan bekatul jagung pada klaim ke 4
dikeringkan dengan cara campuran dimasukkan dalam loyang
 9

dengan ketebalan maksimum 0,5 cm dan dikeringkan dafam

oven pada suhu 4OoC selama 24 jam. Setelah kering,
campuran tersebut digerinda, sehingga didapatkan serbuk
pakan tambahan dengan diameter 1 mm.
5 6. Serbuk pakan tambahan yang dihasilkan pada kl-aim 5
diaplikasi pada ayam broiler fase grower dengan cara
mencampurkan serbuk pakan tambahar, pada pakan ayam broiler
dengan jumiah 1,-22 dari total pakan yang diberikan setiap
pembe::i-an pakan dan penyimpanan serbuk pakan tambahan
10 tersebut maksimum 3 minggu pada suhu kamar.

15
 KEMENTERIAN HUKUIil DAN HAK ASASI MA.NUSIA
REPU BLI K I l.rDOttlES lA
DIREKTORAT JENDERAL KEKAYAAN INTELEKTU,qL
Jl. H.R. Rasuna Said Kav 8-9, Kuningan Jakarta Salatan, 12940
Telepon: (021) 57905611 Faksimili: (021I 57905611
Laman. http.riwww.dgip go id Surel: clopatent@dgip go id

Nonror . HKI-3-H1.05.02.01P00201304598-TA 15 11AR 2018

Lampiran : 1 (satuhalaman)
Hal Pemberitahuan hasil pemerlksaan substantif

'fth. LPPM Universitas Sebelas Maret

.Jl. lr- Sutami 364 Kentingan. Surakarta 57126
tu.p. Prof Dr lr. Darsono. M.Si.i
Dengan ini diberitahukan, bahwa permohcnan paterliengan.
Nonror Permohonan :
P00201304598
Pemohon :
LPPM Universitas Sebelas Maret
invensi
Judul :
PRoSES PRoDUKSI DAN APL|KAS| PAKAN TAMBAHAN yAN(j
MENGANDUNG FITASE PADA PAKAN AYAM BROILER

telah dilakukan pemeriksaan tahap pertama dan drlunrpai kekurangan-kekurangan seperti tersebr.rt
dalam lampiran.

Perbaikan kekurangan harus sudah diterima oleh Direktorat Jenderal paling lambat 3 (tigar bulan
terhitung sejak tanggal surat pemberitahuan ini. sesuai dengan ketentrran Pasal 52 r2r t-trr,.lang-
undang Nomor 14 Tahun 2001 tentang.Paten,

Perbarkan deskripsi, klaim dan gambar disarnpaikan dalam rangkap tiga par^Ja lralanr.rrr j,arr,:l
terplsah,

Jika kekurangan-kekurangan tersebut tidak diperbaiki dalam batas waktu tersebut di atars inaka
permohonan paten tersebut dianggap ditarik kembali berdasarkan ketentuan Pasal 53 t-rri,iang-
undang Nornor 14 Tahun 2001 tentang paten.

a.n. Direktur Paten. Desain Tata Letark

EIffiEI
ffi
Slrkuit Terpadu dan Rahasra Dagan,,
Ka r Pemeriksaarr

00-i018-s7f,8i

Dr'. , S.H.. M.Si

99503 1 00 1
Tembuqan:
1 Yth. Direklur Jonderal Kekayaan lntolektual rsebagal Laporani
2 Rani Nuradi, S.Si.
NtP 1 97705052003122001

F,r ',, lll.,'1..i r,i,- -'rf ,/.1

ilXh l:rr.ct lt) |g
 LatrtPiran 1

HASIL PEMERIKSAAN SUESTANTIF TAHAP

I

Nomor Permohonan: Pt\0201 304598

(deskripsi klaim gattibarr
pemeriksaan substantif telah dilakukan terhadap dokumen permohonan
clengan nomor Permohonan di atas :

tX t clokumen permohonan. asli seperti saat diaiukan

i* i cleskripsi. 1 -7
asli seperti saat diajukan'
halaman
cleskripsi. - surat sattdara tanggal :

halaman
tX I klaim. nomor 1 - 6 asli seperti saat dialukani
klaim. nomor ' $urat saudara tanggal :

t I gambar. nomor asli seperl saat diajukan'

ganrbar. nomor surat-::y.dara tanggal :

Hal-hal vanq harus diPerhatikan:

Berdasarkan Pasal 52 Undang-Undang Paten No' 14

Tahun 2001' dalam invensi ini ditentukan
1
beberapa ketidakielasan. diantaranya adalah:

a. Kgtidakielasan Klaim
.1
Klainr
penyusunan klaim seburgai
Disarankan diubah rnenjadi klaim metode atau proses, dengan contoh
lrerikut: dengat"t
"Metode memproduksifitase r.lengan bakterirekombinan E'Coli BL21(DE3;+pEASl'lul
(DE3) dengan induksi IPTG 1 5 tnl/
cara transformasipEAS't ke dalam sel kompeien E.Coli BL21
selama sedikitnya 94 menit inkubasi pada pH7 dan temperatur 40oc."

Klaim 2.
Metocle menurut klaim 1, dimana diikuti dengan proses ekstraksi
fitase cekaman beku

dst:
b Ketidakjelasan lstilah
lstilah'(w/v;" disaranian diubah menladi "(b/v)"
,,digrinder" "digerinda"
iseturun spesifikasi) disarankan ciiubah menjaCi
pelr re)l(sa
2. Penreriksaan tahap laniut akan dilakukan Setelah Saudara menanggapi keberatan
dan disertai dengan
ri.rii Ocngan buiir t di atas. dan telah mengirimkan perbaikan deskripsi
salinan lunak (soft-copy) dari deskripsi tersebut'
alantat etitail'
3. untuk kelancaren komunikasi penreriksaarr, pemeriksa dapat dihubungimelalui
rani105@yahoo.com

Perneriksa.

RaniNuradi. S.Si.
NlP. 1 977050520031 22001
 10

Abstrak

APLIKASI PAI(AI.I TAMBAIIAI.I YAI{G

PROSES PRODIIKSI DAll MENGA}IDUNG
FITASE PADA PAKA!{ AYE.M BROTLER
5

Invensi ini berhubungan dengan produksi pakan tambahan

yang mengandung fitase dari bakteri rekombinan dan
aplikasinya pada pakan ayam broiler fase grower. Produksi-
f.itase dari bakteri rekombinan dengan cara transformasi
10 pEAST-AMP ke dalam sel kompeten E. col-i BL27 (DE3) dengan
menggunakan induksi IPTG 1r 5 mM, pH 1, temperatur 40"C,
penambahan kofaktor dengan menggunakan ion Mq'n 10-4 M
sebanyak 0,2%, ektraksj- enzim dengan cekaman beku menggunakan
nitrogen cair dan pemanasan suhu 40"C, enkapsulasJ-
15 mengEunakan sitosan konsentrasi 0, B% dengan pelarut asam
asetaL 0 ,2"a, pencampuran fj-tase enkapsulasi dengan bekatul
jagttng dengan perbandingan 3 : !, dan pengeringair dengan overl
pada suhu 40"C seiama 24 jam dengan ketebalan maksimum 0,5 m
telah menghasilkan serbuk pakan tambahan dengan ukuran
20 granula 1 mm. Aplikasi dengan cara mencampurkan serbuk pakan
tambahan pada pakan ayam broiler dengan jumlah 7-2% dari
total pakan yang diberikan setiap pemberian pakan dan
penyimpanan serbuk pakan tambahan tersebut maksimum 3 minggu
pada suhu kamar dapat meningkatkan kinerja produksi dan
25 produksi fitase. Serbuk tambahan ini tahan terhadap cekaman
kondisi perlcernaan ayam broiler, mudah disimpan dan mudah
dicampurkan pada pakan ayam broiler.
 1

Deskripsi

PROSES PRODUKST DAN APLIKASI PAKjAI{ TAI'IBAHAN YANG MENGANDU1iIG

FTTASE PADA PAIGAI{ AYAI'{ BROILER

5 Bidang Teknik Invensi

fnvensi ini berhubungan dengan proses- pembuatan serbuk
pakan tambahan yang mengandung fitase untuk campuran pakan
ayam broiler-

10 tatar Belakang Invensi

Fitase adalah enzim yang dapat menghiCrolisis asam
fitat. Asam fitat tidak dapat dicerna oleh ayam broiler dan
diekskresikan ke lingkungian, sehingga dapat mencemari
lingkungan dengan terSadinya eutrofj-kasi. Pemberian pakan
15 tambahan yang mengandung enzim memerlukan seniuhan teknologi
agar dapat berfungsi di dafam saluran pencernaan ayam
broiler, mengingat dengan adanya enzim pencernaan dan pII
ekstrem asam di dal-am saluran pencernaan tersebut. Selain it.u
j uga harus av"ret sel-arna penyirnpanan dan mudah dicampurkan
20 dalam pakan ayam broiler.
KlebsieLla sp. strain ASR1 penghasil fitase yang telah
dapat diisolasi dari akar tanaman padi- IR64 dan homolog
dengan karakter makroskopis, mikroskopj-s, uji bi-okimia dan
l6SrDNA dari KfebsieTl,a sp. Fitase pada E. coJi mempunyai pH
25 optimum 4,0 dan fitase KlebsieLla sp. sangat aktif pada pH 5.
Optimasi temperatur fitase E. coLi pada temperatur 50 sampai
55 oC dan fitase Kfebsielfa sp. pada temperatur 45 sampai
5OoC (Sajidan et a7-, 2004a).
Fitase dari bakteri Kl-ebsielLa sp. strain ASRI telah
30 dapat dimurnikan, dikarakterisasj- dan disekuensi gennya. Gen
phyK dari bakteri tersebut telah dapat di-kloning ke dalam
plasmid vector pET22b (+) produk Novagen dan diekspresikan
dalam sel kompeten E- cofi strain C41 (DE3) (Sajidan et df.,
 2

2004b) dan E. col-i BL21 (DE3) (dihasilkan bakteri rekombinan

pEASI-AMP IE- cofi BL27 (DE3) +pET22b+ (+)pEAS7-
AMP)) (Nuhriawangsa, 2008), sehi-ngga dapat dihasilkan fitase
dari bakteri rekombinan yang terkarakterisasj-. Fitase ini
5 masuk dalam golongan histidin fosfatase asam (Bohm et df.,
20I0), mempunyai kisaran aktivitas pada pH 2 sampai B dan
suhu 35 sampai 5OoC (Nuhriawangsa ei df., 2008i. Selain itu
juga dapat menghidrolisis asam fitat sampai mioinositol
monofosfat (Sajidan et a7., 2004) .
10 Fitase ini juga telah dapat dienkapsul-asi menggunakan
sitosan dengan bahan pembawa bekatul jagung dan dikeringkan
dalam bentuk serbuk (Nuhriawangsa et df., 20L2a), sehingga
tahan asam, panas, mudah disimpan dan nrudah dicampurkan ke
dalam pakan. Aplikasi pada ayam broil-er fase grower
15 menunjukkan dapat meningkatkan PBB, FCR, Pt protein dan
glukosa darah (Nuhriawangsa et af., 2072b), kecernaan P, Ca
dan protein kasar, kandungan P dan Ca tibia dan meningkatkan
daging dada (Nuhriawangsa et a7., 2013) .
Sequen DNA penyandi fit-ase dari KLebsielTa pneunoniae
20 ASR1 telah dipublikasi pada pusat database GenBank dunia
(http : / / www. ncb i . nLm. nih. gov) dengan Accession nunber:
AYo91638.
Invensl ini dibanding paten dengan no. W0020L1,04265
menggunakan sumber bakteri asl-i yang berbeda, invensi ini
25 menggunakan KJ-ebsiel-La pneumonia yang dapat memotong asam
fitat sampai mioinositol monofosfat, ekstraksi enzim pada
invensi ini menggunakan cekaman beku, invensi ini Iarutan
fitase ditambahkan ion Mq'* 10-4 M sebanyak O,2eo dari total
Iarutan sebagai kofaktor fitase, aplikasi pada ternak invensi
30 ini menggunakan ayam, serbuk pakan tambahan menggunakan
sitosan sebagai enkapsulator dan pencampuran pakan sebanyak
1-2% dari total pemberian pakan ayam broiler fase grower.
 3

Invensi ini dibanding paten dengan no. W00200401197

menggunakan sumber mikrobia yang berbeda. Paten no -

W00200401197 menggunakan sumber mikrobia berupa spesies

jamur, dan invensi ini mengggunakan sumber berupa spesies
5 bakteri untuk produksi- fitase.
Invensi ini dibanding paten no. T 7061/08 - 3.3.09/
10.'2.2071, menggunakan sumber enkapsulasl m,enggunak;.n polimer
karbohidrat terl-arut pati dan konsentrasi 15?, sehingga
berbeda dengan invensi ini yang menggunakan sumber
10 karbohidrat berupa sitosan dengan konsentrasi- 0,8% dengan
perbandingan 1 : 1 (v/v) .
Invensi ini menggunakan sumber fitase dari bakteri
rekombinan pEASI-AMP tE. coTi BL27 (DE3) +pET22b+ (+)pEAS7-Al',lPl ,
bekatul jagunE, kofaktor ion logam Mg'*, dan sitosan [berasa]-
15 dari kulit udang, nilai derajat deasetilisasj- (DD) 83,26%,
diberikan dalam kondisi cair t,jeo (b/v) dalam pelarut asam
asetat 0,52, pH 3,3/kisaran 3-41 hasil produksi Unit
Pelayanan Teknis Balai Pengembangan Proses dan Teknologi
Kimia Lembaga Il-mu Pengetahuan Indonesia (UPT BPPTK LIPI)
20 Yogyakarta.
Keunggulan invensi ini dengan menggunakan gen
phyK/pEAS7 dari Kl-ebsiel"l-a pnemoniae, sehinqga dihasilkan
fitase yang dapat menghidrolisis asam fitat sampaj-
mioinositol monofosfat dan tahan asam karena fi-tase masuk
25 dal-am golongan histidin fosfatase asam. Selain itu dengan
enkapsulasi menggunakan sitosan, sehingga produk pakan
tambahan yang dihasllkan tahan terhadap cekaman pH dan
protease di dalam sa.l-uran pencernaan. Aplikasi pada campuran
.
pakan ternak membutuhkan serbuk dengan aktivitas fitase 400
30 unit dengan jumlah pemberian l-2% dari total pakan yang
diberikan sudah dapat meningkatkan kinerja produksi ayam
broiler.
 4

Uraian Singkat Invensi

Invensi yang diusulkan ini pada pri-nsj-pnya adalah proses
produksi dan aplikasi pakan tambahan yang berupa serbuk untuk
ayam broiler fase grower, sehingga invensi ini mempunyai
5 beberapa keunggulan menghasil-kan fitase yang dapal-
menghidrolisis asam fitat sampal mioinositol monofosfat.,
tahan asam, tahan terhadap cekaman pH dan protease di - dalam
saluran pencernaan dan membutr.rhkan serbuk dengan aktivit.as
fj-tase 400 unit dengan 3umIah pemberian 1-2% dari total pakan
10 yang diberikan. Proses produksi untuk menghasilkan pakan
tambahan yang mengandung fitase dengan beberapa tahap:
a. Produksi fitase dari bakteri rekombinan E. col-i
BL27 (DE3) +pEAS7-AMP (induksi IPTG 1,5 mM setelah 94 menit
inkubasi, optimasi produksi pada pH 7 dan temperatur 40"C
15 dan penambahan kofaktor Mg'* konsentrasi 10-4 M pada
fitase).
b. Ekstraksi fit-ase dengan cekaman beku (pembekuan dengan
nitrogen cair, setelah beku kemudian dicairkan pada
penangas air dengan suhu 40"C dengan pengulangan tiga
20 kali).
c. Enkapsulasi fitase menggunakan sitosan [pelarut asam
a-setat konsentrasi 0,2% (b/v), sitosan konsentrasl 0, B%
dal-am asam asetat O,2% (v/v) pada pH 5, perbandingan
fitase dan sitosan l- : 11.
25 d. Pengeringan dengan menggunakan cven (ketebalan maksimum
0,5 cm pada loyang, pada suhu 40"C selama 24 jam, diarneter
granula 1 mm).
e. Aplikasi pada pakan ayam broiler (aktivitas fitase 400
unit, pemberian l-2% pada total pakan, waktu penyimpanan
30 pakan tarrLbahan 3 minggu di kondisi lingkungan) .
 5

Uraian Lengkap Inwensi

Sebagaimana yang tel-ah dikemukakan pada l-atar belakang
invensi bahwa pakan tambahan yang mengandung fitase dari
bakteri rekombinan dapat diqunakan pada campuran pakan ayam
5 broiler fase grower untuk meningkatkan kualitas pakan dan
kinerja produksi dan kinerja produksi fitase pada ayam
brorler. L'itase pada pakan tambahan tersebut teli.rh
dienkapsulasi dengan sitosan agar tahan terhadap pH rendah,
panas dan penyimpanan. EnkapsuJ-asi fitase tersebut dicampur
10 bahan pembawa bekatul jagung sebagai sumber fitat, sehingga
mudah untuk diawetkan dan dicampur pada pakan ayam broiler.
Pakan tambahan tersebut diaplikasikan pada ayam broiler dan
dapat meningkatkan produktivitas ayam broiler dan ramah
lingkungan, karena ekskreta yang dihasilkan rendah asam
15 fitat.
Transformasi, prociuksi bakteri dan produksi enzim
menggunakan metode menurut Sajidan (2002) dan Novagen (2005)
yang dimodif ikasi. Prodr.rksi bakterj- rekombinan dengan cara
transformasi pEAST ke dalam sel kompeten E. coLi BL27 dan E.
20 coli BL27 (DE3) dan untuk memproduksi fitase dengan
menggunakan induksi IPTG 1,5 mM, pH 7 dan temperatur 40oC.
Bahan yang di-gunakan untuk pr:oduksi bakteri rekombinan adalah
pEASI Plasmid-Vektor (Sajidan, 20021, sel kompeten E. coTi
BL27 (Novagen, katalog 10232-3) dan IPTG (Novagen, katalog
25 1052'l-3). Produksi fitase diawali dengan cara mengambil satu
koloni bakterj- rekombinan dari media LB padat yang mengandung
50 p9/m1 rekombinan, dimasukkan ke dalam 5 mI media LB yang
mengandung amfisilin (25 pglml-) dan diinkubasi pada shaker
incubator dengan temperatur 37"C dan kecepatan 100 rpm selama
30 6 jam. Produksi fitase pada kondisi perturnbuhan menuju
eksponensial, dengan cara mengambil kultur cair dari kultur
yang telah diinkubasi selama 6 jam tersebut di atas sebanyak
2eo dari jumlah rnedia LB cair yang mengandung amfisilin 25
 5

p9lm1 yang akan digunakan untuk produksi fitase (v/v),

setelah inkubasi dalam shaket incubator pada suhu 31"C,
kecepatan 1C0 rpm dan waktu 94 menit ditambahkan 1% dari
jumlah media cair 1,5 mM IPTG untuk induksi enzim. Modifikasi
5 dil-akukari pada ekstraksi enzim dengan menggunakan metode
cekaman beku, Iarutan LB cair yang mengandunE bakteri
rekombinan dimasukkan daiam tabung dan dibekukan dalam
Iarutan nitrogen cai-r,, setelah beku ker,rudian dicairkan pada
penangas air dengan suhu 40"C sampai cair dan ha} ini diulang
10 sampai 3 kali - Modifikasj- denEan metode inj- diharapkan dapat
dihasilkan fitase intra dan ekstraseluler. Larutan LB cair
yang mengandung fitase tersebut ditambahkan ion Mg'* 10-4 M
sebanyak 0,2% dari total larutan sebagai kofaktor fitase-
Fitase yang dihasilkan dienkapsulasi menEgunakan sitosan
15 konsentrasi 0,8% dengan pelarut asam asetat 0,2%, dicampur
dengan bekatul jagung dan dikeringkan dengan cven pada suhu
4OoC. Asam aserat diiarutkan dalam air detrgan konsentrasi
O,2eo (b/v) . Sitosan dilarutkan dalam laruta;r asam asetat 0,2%
dengan konsentrasi sitosan 0,8% (v/-,r) secara bertahap deuqan
20 pengadukkan pada suhu 37"C. Larutan yang mengandung sitosan
dicampur dengan larutan media LB cair yang mengandung fi-tase
pada pH 5 derrgan perbandingan Iarutan enzim dan sitosan
adalah 1 : 1 (v/v) secara bertahap sampai homogen. Setelah
homogen Iarutan tersebut dicampur dengan bekatul jagung
25 (diameter granula 1 mm) sedikit demi sedikit dengan
perbandingan bekatul jagung dengan larutan enzim + sitosan
adalah 1 : 3 (v/b) sampai homogen. Campuran tersebut kemudian
dimasukkan dalam loyang dengran ketebalan maksimum 0,5 cm dan
dikerinqkan dalam oven pada suhu 40"C selama 24 jam. Setelah
30 kering, campuran tersebut digerinda dan diayak dengan ayakan
ukuran granula I mm, sehingga didapatkan serbuk pakan
tambahan dengan ukuran 1 mm.
 7

Aplikasi pada ayam broiler fase grower dengan cara

mencampurkan serbuk pakan tambahan pada pakan ayam broiler
(berbasis jagung dan kede.l-ai dengan kandungan P av 0,35%)
dengan jumlah l-2e" dari total pakan yang diberikan setiap
5 pemberian pakan (sehari dua kali, pagi jam 08.00 dan sore
jam 16.00) dan penyimpanan serbuk pakan tambahan tersebut
makslmum 3 minggu pada suhur kainar.
Pakan tambahan berupa campuran fitase dengan bekatul
jagung yang di-enkapsulasi dengan sitosan dan dikeringkan
10 secara oven dapat memperbaiki nilai ECR, PBB,- kecernaan bahan
kering ekskretal, kecernaan P ekskretal, kecernaan kalsium
ekskretal, kecernaan protein kasar ekekretal, kecernaan
glukosa ekskretal, P darah, proteJ-n total darah, glukosa
darah, panjang tibia, Ca tibia, abu tibia dan bobot dada.
L5
 8

KIaim
1. Metode memproduksi fitase dengan bakteri rekombinan E.
coli BL27 (DE3) +pEAS7-Nt'lP dengan cara transformasi pEAST ke
dalam sel kompeten E. coli BL27 (DE3) dengan induksi IPTG
5 1,5 mM setelah 94 menit inkubasi pada pH 7 dan temperatur
40"c.
2. Ektrak fitase yang dihasifxan pada metode klaim 1 dimana
diikuti dengan proses ekst.raksi fitase cekaman beku dengan
cara l-arutan LB cair yang mengandung bakteri rekombinan
10 dimasukkan dalam tabung dan dibekukan dalam farutan
nitrogen cair, setelah beku kemudian dicairkan pada
penanqas air dengan suhu 40"C dan hal ini diulang sampai 3
ka1i.
3. Ekstrak f itase yang dihasil-kan pada kl-aim ke 2 ditambah
15 denqan kofaktor dengan cara farutan LB cair yang
mengandung fitase ditambah ion Mg'* i0-4 M sebanyak Or2%
dari total larutan untuk st.abilisasi dan meningkatkan
aktivitas fitase -
4. Ektrak fitase yang dihasilkan pada klaj-m 3 dienkapsulasi
20 dengan cara:
a. Sitosan dilarutkan dalam larutan asam asetat 0,2%
dengan konsentrasi sitosan 0, Bt (v/v) secara
bertahap.
b. Larutan yang mengandung sitosan dicampur dengan
25 larutan media LB cair yang mengandung fitase pada
pH 5 dengan perband-ingan larutan enzim dan sitosan
adalah 1 : I (v/v') sampai homogen.
c. Setelah homogen larutan tersebut dj-campur dengan
bekatul jagung sedikit demi sedikit dengan
30 perbandingan bekatul jagung dengan larutan enzj-m
dan sitosan adalah 1 : 3 (b/v) sampai homogen.
5. Campuran ekstrak fitase dan bekatuf jagung pada klaim ke 4
dikeringkan dengan cara campuran dimasukkan dalam loyang
 9

dengan ketebafan maksimum 0,5 cm dan dikeringkan dalam

oven pada suhu 40"C selama 24 jam. Setelah kering,
campuran tersebut digerinda, sehingga didapatkan serbuk
pakan tambahan dengan diameter 1 mm.
5 6. Serbuk pakan tambahan yang dihasilkan pada klaim 5
diaplikasi pada ayam broiler fase grower dengan cara
mencampurkan serbuk pakan tambahan pada pakan ayam broiler
dengan jumlah 1,-22 dari total-. pakan yang diberikan seti-ap
pemberian pakan dan penyimpanan serbuk pakan tambahan
10 tersebut maksimum 3 minggu pada suhu kamar.

15
 10

Abstrak

PROSES PRODT KSI DAN APLfKiASI PAKAI{ TAII{BAHAI{ YA}IG MENGAI\TDUNG

EITASE PADA PAI(Ati[ AYA}' BROILER

Invensi ini berhubungan dengan produksi pakan tambahan

yang mengandung fitase dari bakteri rekombinan dan
aplikasinya pada pakan ayam broiler fase grower. Produksi
fitase ciari bakteri rekombinan dengan cara transformasi
10 pEAST-lt4P ke da.Iam seI kompeten E. cof i BL21 (DE3) dengan
menggunakan induksi IPTG 1,5 mM/ pH 1, temperatur 40"C,
penambahan kofaktor dengan menggunakan ion Mq'* l-0-4 M
sebanyak 0,22, extraksi enzim dengan cekaman beku menggunakan
nitrogen cair dan pemanasan suhu 40"C, enkapsulasi
i5 mengEunakan sitosan konsentrasi 0, B? dengan pelarut asam
asetat 0,2%, pencampuran frtase enkapsulasi dengan bekatul
jagurrg dengan perbandingan 3 : 7, dan pengeringan dengan oven
pada suhu 40"C selama 24 jam dengan ketebal-an maksj-mum 0,5 m
tel-ah menghasit-kan serbuk pakan tambahan dengan ukuran
20 granula 1 mm. Aplikas-t dengan cara mencampurkan serbuk pakan
tambahan pada pakan ayam broiler dengan jumlah 1,-2% dari
total pakan ya.ng diberikan setiap pemlcerian pakan dan
penyimpanan serbuk pakan tambahan tersebut maksimum 3 minggu
pada suhu kamar dapat meningkatkan klnerja produksi dan
25 produksi fitase. Serbuk tambahan ini tahan terhadap cekaman
kondisi pencernaan ayam broiler, mudah disimpan dan mudah
dicampurkan pada pakan ayam broiler.