Jurnal AgroBiogen 9(2):49-57
Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri
(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) dan Uji Patogenisitasnya
pada Galur-galur Padi Isogenik
Tasliah*, Mahrup, dan Joko Prasetiyono
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111
Telp. (0251) 8337975; Faks. (0251) 8338820; *E-mail: tasliah1@yahoo.co.id
Diajukan: 5 Maret 2013; Diterima: 19 Juli 2013
ABSTRACT
Molecular Identification of Bacterial Leaf Blight
(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) and Pathogenicity Test
of Rice Isogenic Lines. Tasliah, Mahrup, and Joko
Prasetiyono. Identification of Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (Xoo) based on molecular analysis has been
introduced just few years ago. This method used some
specific primers for Xoo and can be done quickly. The
purposes of this research were to identify isolate Xoo
originated from five locations in Indonesia and to determine
the level of pathogenicity of these bacteria. Studies were
conducted in the greenhouse and the Molecular Biology
Laboratory of ICABIOGRAD, from 2011 to 2012. Bacterial
isolates were taken from five regions in Indonesia, namely:
West Sumatra, West Java, Central Java, South Sulawesi, and
West Kalimantan. The specific primers of Xoo were
Xoo2967, Xoo80, and Xoo. Results showed that 216 isolates
could be grown to form yellow colored colonies, which
belongs to a criterian for Xoo. Molecular analysis
demonstrated that 189 isolates were Xoo and 27 isolates
were not. Amplification of DNA of the isolates resulted a 337
bp PCR product for primer Xoo2976, 700 bp for primer
Xoo80 and 534 bp for primer Xoo. Pathogenicity tests of the
Xoo isolates showed xa5, Xa7, and Xa21 resistance genes
were still effective againts BLB pathogens originated from
those five regions, with percentage of resistance were 93.57,
77.49, and 85.37%, respectively.
Keywords: Rice, Xanthomonas oryzae pv. oryzae, specifik
primers, test of patogenicity.
ABSTRAK
Identifikasi Molekuler Bakteri Hawar Daun (Xanthomo-
nas oryzae pv. oryzae) dan Uji Patogenisitasnya pada
Galur-Galur Padi Isogenik. Tasliah, Mahrup, dan Joko
Prasetiyono. Identifikasi bakteri Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (Xoo) berdasarkan analisis molekuler telah diperke-
nalkan beberapa tahun yang lalu. Metode ini menggunakan
beberapa primer spesifik untuk bakteri hawar daun khusus
patovar oryzae dan dapat dikerjakan secara cepat. Tujuan
penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi isolat Xoo dari
lima wilayah di Indonesia dan mengetahui tingkat patogeni-
sitas bakteri tersebut. Isolat bakteri diambil dari tanaman
padi yang terserang bakteri hawar daun dari lima wilayah di
Hak Cipta © 2013, BB Biogen
Indonesia, yakni Sumatera Barat, Jawa Barat, Jawa Tengah,
Sulawesi Selatan, dan Kalimantan Barat. Primer spesifik
untuk Xoo adalah primer Xoo2967, Xoo80, dan Xoo. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa sebanyak 216 isolat berhasil
ditumbuhkan membentuk koloni berwarna kuning, yaitu
suatu kriteria bagi Xoo dan berdasarkan analisis molekuler
sebanyak 189 isolat adalah positif Xoo, dan 27 isolat bukan
Xoo. Amplifikasi DNA isolat-isolat HDB tersebut menghasil-
kan produk berukuran 337 pb untuk primer Xoo2976, 700 pb
untuk primer Xoo80, dan 534 pb untuk primer Xoo. Uji pato-
genisitas dari isolat-isolat Xoo menunjukkan bahwa gen
resisten pada tanaman xa5, Xa7, dan Xa21 masih cukup
efektif menangkal serangan penyakit hawar daun bakteri
padi dari lima wilayah pertanaman padi yang menjadi target
penelitian ini, dengan persentase ketahanan berturut-turut
sebesar 93,57; 77,49; dan 85,37%.
Kata kunci: Padi, Xanthomonas oryzae pv. oryzae, primer
spesifik, uji patogenisitas.
PENDAHULUAN
Penyakit hawar daun bakteri (HDB) yang di-
sebabkan oleh Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)
adalah salah satu penyakit utama pada padi sawah.
Hampir seluruh daerah pertanaman padi di Indonesia
telah terpapar penyakit HDB (Direktorat Perlindungan
Tanaman Pangan, 2012). Daerah endemik HDB di
Indonesia adalah Jawa Barat dan Jawa Tengah, de-
ngan tingkat serangan yang beragam. Menurut data
dari Direktorat Perlindungan Tanaman Pangan tahun
2011, serangan HDB pada tahun 2011 mencapai
115.257 ha dan 62 ha mengalami puso.
Untuk mengenali bakteri hasil isolasi dari tanam-
an sakit apakah HDB atau bukan, biasanya dilakukan
beberapa tahapan kegiatan yang dinamakan “Postulat
Koch”. Postulat ini memerlukan waktu yang lama
untuk menentukan apakah bakteri yang diperoleh
adalah Xoo atau bukan (Kadir, 2009). Saat ini sudah
dikembangkan deteksi secara molekuler untuk me-
lengkapinya. Deteksi secara molekuler ini dapat di-
lakukan pada tahap awal isolasi bakteri dari sampel
daun yang diduga terserang HDB. Deteksi secara
molekuler menggunakan primer-primer spesifik untuk
bakteri Xoo yang relatif lebih cepat dan akurat dalam
50 JURNAL AGROBIOGEN VOL. 9 NO. 2

mendapatkan bakteri Xoo murni (Lang et al., 2010).
Beberapa primer spesifik telah dibuat oleh beberapa
peneliti. Primer-primer tersebut didesain berdasarkan
kajian sekuen lengkap dari beberapa isolat bakteri
Xoo (Lee et al., 2005; Ochiai et al., 2005; Salzberg et
al., 2008).
Dari data sekuensing yang sudah terdaftar di
bank gen, beberapa peneliti mendesain primer spesi-
fik pada daerah konservatif (conserved region) dari
bakteri Xoo (Onasanya et al., 2010; Furuya et al.,
2012). Penggunaan primer spesifik Xoo sangat mem-
bantu untuk identifikasi HDB dalam jumlah sangat
banyak. Biasanya isolat HDB berwarna kuning, namun
koloni warna kuning terjadi juga pada bakteri X. ory-
zae pv. oryzicola (Xoc) dan kelompok Xanthomonas
lainnya, seperti Pseudomonas fuscovaginae, P. syri-
ngae pv. syringae, Ralstonia solanacearum, Burkhol-
deria andropogonis, dan Erwinia herbicola (Lang et
al., 2010; Onasanya et al., 2010).
Penelitian ini bertujuan untuk (1) menguji efekti-
vitas primer spesifik untuk identifikasi dini bakteri Xoo
dari lima lokasi sampling di Indonesia dan (2) menguji
respon gen-gen ketahanan HDB terhadap serangan
patogen Xoo dari isolat yang berasal dari lima lokasi
sampling di Indonesia. Informasi ini dapat digunakan
sebagai strategi untuk merakit galur-galur baru yang
tahan terhadap serangan HDB di masing-masing
lokasi.
BAHAN DAN METODE
(Desa Kubu Apar dan Desa Maninjau, Kecamatan
Empat Angkat Candung, Kabupaten Agam), (2) Jawa
Barat (Desa Warung Nangka, Kecamatan Ciasem dan
Desa Ciberes, Kecamatan Patok Beusi, Kabupaten
Subang dan Desa Ciranjang, Kabupaten Cianjur), (3)
Kalimantan Barat (Desa Senakin, Kecamatan Sing-
kawang), (4) Jawa Tengah (Desa Duwet, Kecamatan
Pekalongan Selatan, Kabupaten Pekalongan dan Desa
Sawahan, Kecamatan Tulis, Kabupaten Batang), dan
(5) Sulawesi Selatan (Desa Borong Lowe, Kecamatan
Bonto Morana, Kabupaten Gowa dan Desa Batang
Kaluku, Kecamatan Maros, Kabupaten Makasar).
Pengambilan sampel dalam satu tempat bervariasi
tergantung pada insiden serangan pada padi serta
keparahannya terhadap HDB di lokasi tersebut. Pada
lokasi persawahan yang terserang banyak HDB,
sampel daun yang terserang diambil mengikuti pola
seperti huruf “W” (Bustamam et al., 1997).
Sampell daun yang telah dikumpulkan diisolasi
bakterinya menggunakan media tumbuh Wakimoto
Agar (WA) (Bustamam et al., 1997) pada cawan petri.
Setelah single colony (koloni tunggal) (Gambar 1A dan
1B) tumbuh kemudian dipindahkan ke media WA
miring untuk pemurnian. Bakteri-bakteri yang diduga
adalah Xoo (yang berwarna kuning) kemudian Diana-
lisis secara molekuler. Bakteri yang positif setelah dila-
kukan analisis PCR kemudian diperbanyak dan diuji-
kan ke tanaman dan untuk penyimpanan bakteri da-
lam jangka lama dilakukan dalam 5% skim milk dan
disimpan di dalam freezer -20°C.

Penelitian dilakukan di rumah kaca dan
Laboratorium Biologi Molekuler, BB Biogen, mulai
Agustus 2011 sampai Juli 2012.
Koleksi dan Isolasi Hawar Daun Bakteri
Sampel daun yang digunakan dalam penelitian
ini diambil dari lima lokasi, yaitu (1) Sumatera Barat
Identifikasi Bakteri Xoo Menggunakan PCR
Identifikasi bakteri secara molekuler mengguna-
kan sel bakteri secara langsung sebagai template/
cetakan PCR. Primer-primer yang digunakan untuk
deteksi dini bakteri Xoo secara molekuler terdiri dari 3
pasang primer spesifik untuk bakteri Xoo yakni:
Xoo2976F (5’-GCCGTTTTTCTTCCTCAGC-3’) dan

A B

Gambar 1. Koloni bakteri Xanthomonas oryzae pada media WA (Wakimoto Agar). A = isolat Xoo12-
177 diisolasi dari varietas yang tidak diketahui dari Desa Kauman, Batang, Jawa Tengah;
B = isolat Xoo12-269 diisolasi dari padi IR64 dari Desa Ciberes, Patok Beusi, Subang,
Jawa Barat; tanda panah menunjukkan koloni tunggal.
2013 TASLIAH ET AL.: Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri 51

Xoo2976R (5’-AGGAAAGGGTTTGTGGAA-GC-3’), Tabel 1. Genotipe padi yang digunakan pada pengujian patogenisi-
tas isolat Xoo.
Xoo80F (5’-GCCGCTGGAATGAGCAAT-3’) dan Xoo80R
(5’-GCGTCCTCGTCTAAGCGATA-3’) (Lang et al., 2010), No. Genotipe Gen ketahanan dan informasi genotipe
dan XooF (5’-TGGTAGTCCACGCCCTAAAC-3’) dan 1. Nipponbare Padi genjah, Jepang
XooR (5’-CCTGAGCTACAGACCCGA-3’) (Onasanya et 2. Ciherang Varietas populer, tidak tahan HDB
al., 2010). Primer Xoo2976 didesain dari Dual 3. Code Mengandung Xa7 dan Xa4
4. IR64 Varietas populer, tidak tahan HDB
specificity phosphatase, catalytic domain protein. 5. Kuriak Putiah Varietas populer di Sumatera Barat
Primer Xoo80 didesain dari Hypothetic protein. 6. Cisadane Tanaman cek rentan HDB
7. Kencana Bali Tanaman cek rentan HDB
Sebanyak 100 μl suspensi bakteri dipanaskan 8. IRBB1 Xa1
pada suhu 98°C selama 8 menit dan disentifugasi 9. IRBB2 Xa2
pada 10.000 rpm selama 3 menit, supernatan tersebut 10. IRBB3 Xa3
11. IRBB4 Xa4
digunakan sebagai cetakan DNA (Dafa’alla et al., 2000; 12. IRBB5 xa5
IRRI, 1995; George et al., 1997; Furuya et al., 2012). 13. IRBB7 Xa7
Kondisi PCR dilakukan di dalam volume total 20 μl, 14. IRBB10 Xa10
yang terdiri dari 2 μl 10× bufer PCR, 0,4 μl 10μM dNTP 15. IRBB11 Xa11
16. IRBB14 Xa14
mix, 1 μl 5 μM primer mix (F+R), 1 μl GC rich dan 1 17. IRBB21 Xa21
unit enzim Taq DNA polimerase. Profil PCR dilakukan 18. IR24 Varietas penerima galur isogenik IRBB
berdasarkan Lang et al. (2010), yaitu (i) denaturasi
awal (initial denaturing) pada suhu 94°C selama 3
menit, (ii) denaturasi (denaturing) pada suhu 94°C lum dilakukan dengan cara 1 ose koloni bakteri di-
selama 30 detik, (iii) penempelan (annealing) primer tumbuhkan dalam 10 ml media NB cair, digoyang se-
pada suhu 60°C selama 30 detik, (iv) perpanjangan malam pada suhu ruang. Konsentrasi inokulum bak-
(extention) primer pada suhu 68°C selama 2 menit, teri yang digunakan diatur sekitar 109 sel/ml. Inokulasi
diulang sebanyak 31 kali, dan (v) perpanjangan akhir dilakukan dengan cara memotong ujung daun kedua
(final extension) pada suhu 68°C selama 10 menit. dan ketiga menggunakan gunting yang sebelumnya
Hasil PCR diwarnai dengan penanda migrasi sudah dicelupkan ke dalam biakan bakteri dalam
(loading dye) dan selanjutnya bersama-sama dengan media nutrient broth (NB) (=clipping method).
1 kb ladder sebagai penanda (marker) berat molekul, Pengamatan dilakukan 18 hari dan 25 hari sete-
diseparasi dalam elektroforesis pada gel agarose 2% lah inokulasi (hsi) menggunakan Standard Evaluation
dalam bufer 1× TAE, kemudian gel agarose diwarnai System for Rice (IRRI, 1996). Peubah yang diamati
dengan EtBr dan divisualisasi di bawah sinar UV pada adalah panjang area daun sakit (Disease Leaf Area)
alat Chemidoc Bio-Rad. dan panjang daun total. Data tersebut digunakan
untuk menghitung intensitas penyakit dari setiap
Uji Patogenisitas
genotipe yang diuji menggunakan rumus berikut:
Uji patogenisitas menggunakan rancangan Acak Panjang serangan (cm)
Lengkap dengan tiga ulangan. Genotipe padi yang di- Intensitas Penyakit (IP) = x 100%
Panjang daun (cm)
gunakan untuk pengujian isolat bakteri terdiri dari 18
genotipe seperti tertera pada Tabel 1. Benih padi di- Kategori ketahanan tanaman ditentukan meng-
kecambahkan di dalam cawan petri selama 10 hari, gunakan standar IRRI (IRRI, 1996).
setelah itu dipindah ke dalam bak pertanaman dan 1. Sangat tahan (ST) apabila 0% bagian daun yang
dipelihara dengan pemupukan untuk masing-masing terserang HDB.
bak: SP36 0,18 g, urea 0,2555 g, dan KCl 0,045 g. 2. Tahan (T) apabila 1-5% bagian daun terserang
Tanaman diinokulasi pada umur 30 hari setelah semai HDB.
(20 hari di bak pertanaman) menggunakan isolat bak- 3. Agak tahan (AT) apabila 6-12% bagian daun
teri Xoo yang telah dimurnikan dan telah diuji secara terserang HDB.
molekuler. Sebanyak 10 isolat dari masing-masing 4. Sedang (S) apabila 13-25% bagian daun terserang
daerah diujikan pada setiap set tanaman uji. Satu set HDB.
tanaman uji (ada tiga ulangan) memerlukan dua bak, 5. Agak rentan (AR) apabila 26-50% bagian daun
di mana setiap bak berisi sembilan genotipe padi dan terserang HDB.
masing-masing genotipe terdiri dari 10 tanaman. Per- 6. Rentan (R) apabila 51-75% bagian daun terserang
banyakan inokulum dan inokulasi dilakukan meng- HDB.
ikuti metode yang dikembangkan oleh Kauffman et al. 7. Sangat rentan (SR) apabila 76-100% bagian daun
(1973) dalam Goto et al. (2009). Perbanyakan inoku- terserang HDB.
52 JURNAL AGROBIOGEN VOL. 9 NO. 2

Dari nilai rerata intensitas penyakit untuk masing-
masing lokasi, dilakukan perhitungan rerata untuk
kelima lokasi. Rerata untuk kelima lokasi untuk me-
nentukan gen ketahanan (Xa) mana yang paling ber-
peran untuk mengendalikan penyakit HDB di lokasi
penelitian. Jenis gen Xa yang masih memiliki ketahan-
an terhadap isolat-isolat HDB dapat direkomendasikan
sebagai acuan dalam merakit tanaman padi yang ta-
han terhadap HDB, khususnya untuk lokasi peng-
ambilan sampel patogen HDB.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi Isolat Menggunakan Primer Spesifik
Hasil isolasi bakteri dari daun padi yang terserang
menghasilkan koloni yang berwarna kuning (Gambar
1). Hal ini merupakan salah satu ciri morfologi bakteri
Xoo (Nino-Liu et al., 2006). Koloni bakteri Xanthomo-
nas berwarna kuning karena mengandung xanthomo-
din. Setelah dilakukan proses PCR menggunakan
primer spesifik untuk pv. oryzae ternyata Gambar 1A
adalah Xoo, sedangkan Gambar 1B bukan Xoo.
Contoh hasil amplifikasi PCR dari koloni HDB
menggunakan primer spesifik khusus untuk Xoo di-
sajikan pada Gambar 2. Tabulasi isolat HDB yang di-
peroleh pada penelitian ini disajikan pada Tabel 2.
Hasil uji PCR dari 216 isolat bakteri yang diuji, 189 me-
rupakan bakteri Xoo dan 27 isolat bukan bakteri Xoo.
Pada primer Xoo2976, koloni yang menghasilkan pita
berukuran 337 pb berarti positif bakteri Xoo (Lang et
al., 2010), sedangkan yang tidak menghasilkan pita
337 pb berarti bukan bakteri Xoo. Demikian pula pada
primer Xoo80 yang menghasilkan pita berukuran 700
pb dan primer Xoo yang menghasilkan pita berukuran

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
A

337 pb

Primer Xoo2976 Primer Xoo2976

700 pb

Primer Xoo80 Primer Xoo80

534 pb

Primer Xoo Primer Xoo

Gambar 2. Pola pita hasil amplifikasi beberapa koloni HDB berwarna kuning menggunakan tiga primer spesifik untuk bakteriXoo. A = primer
Xoo2976, B = primer Xoo80, C = primer Xoo; M = 1 kb DNA ladder, 1 = Xoo12-0218 (Jateng), 2 = Xoo12-0211 (Jateng), 3 = Xoo12-
0179 (Jabar), 4 = Xoo12-0180 (Jabar), 5 = Xoo12-0200 (Jateng), 6 = Xoo12-0219 (Jateng), 7 = Xoo12-0225 (Jateng), 8 = Xoo12-0198
(Jateng), 9 = Xoo12-0224 (Jateng), 10 = Xoo12-0199 (Jateng), 11 = Xoo12-0192 (Jateng), 12 = Xoo12-0189 (Jateng), 13 = Xoo12-
0215 (Jateng), 14 = Xoo12-0214 (Jateng), 15 = Xoo12-0217 (Jateng), 16 = Xoo12-0181 (Jabar), 17 = Xoo12-0210 (Jateng),
18 = Xoo12-0183 (Jabar), 19 = Xoo12-0178 (Jabar), 20 = Xoo12-0184 (Jabar), 21 = Xoo12-0221 (Sulsel), 22 = Xoo12-0205 (Jateng),
23 = Xoo12-0220 (Jateng), 24 = Xoo12-0212 (Jateng), 25 = Xoo12-0204 (Jateng), 26 = Xoo12-0229 (Jateng), 27 = Xoo12-0254
(Jateng), 28 = Xoo12-0233 (Jateng), 29 = Xoo12-0240 (Jateng), 30 = Xoo12-0252 (Jateng), 31 = Xoo12-0230 (Jateng), 32 = Xoo12-
0250 (Jateng), 33 = Xoo12-0255 (Jateng), 34 = Xoo12-0236 (Jateng).
2013 TASLIAH ET AL.: Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri
Tabel 2. Isolat-isolat HDB dari lima lokasi di Indonesia.
No. Asal hawar daun bakteri Jumlah koloni berwarna kuning*)
1. Kabupaten Agam (Sumbar)
2. Kabupaten Cianjur dan Subang
(Jabar)
3. Kabupaten Senakin (Kalbar)
4. Kabupaten Gowa dan Makasar
(Sulsel)
5. Kabupaten Batang dan Pekalongan
(Jateng)
* koloni berwarna kuning menunjukkan warna koloni HDB. Seluruh koloni yang berwarna kuning digunakan sebagai cetakan PCR,
** berdasarkan PCR menggunakan primer-primer spesifik Xoo.
534 pb (Lang et al., 2010). Dari Gambar 2A, 2B dan 2C
semuanya konsisten untuk sampel yang sama. Seperti
sampel nomor 3, 4, 16, 18, 19, dan 20 ternyata memi-
liki pita yang berbeda dengan standar, sama untuk
ketiga primer spesifik tersebut, sehingga isolat-isolat
tersebut diduga bukan Xoo. Penggunaan primer spe-
sifik untuk identifikasi HDB ini telah digunakan secara
luas. Furuya et al. (2012) bahkan hanya memakai satu
jenis primer spesifik saja, yaitu primer XO, untuk me-
nyeleksi bakteri Xoo dari bakteri lain pada penelitian
keragaman genetik HDB di Vietnam Selatan. Pasang-
an primer yang digunakan, yaitu primer XO-F-
GCATGACGTCATCGTCCTGT, XO-R-
CTCGGAGCTATATGCCGTGC yang didesain dari
Internally transcribed spacer region of ribosomal DNA
(Adachi dan Oku, 2000).
Amplifikasi menggunakan primer spesifik
Xoo2976 dan Xoo80 sudah dilakukan oleh Lang et al.
(2010) dengan menggunakan isolat Xoo yang berasal
dari beberapa negara, termasuk Indonesia. Isolat mur-
ni Xoo MAFF311018 digunakan sebagai kontrol positif.
Isolat Xoo dari Indonesia yang digunakan adalah
IXO16 (Ciranjang, Cianjur), IXO56 (Pusakanegara),
IXO58 (Kuningan), dan IXO60. Digunakan juga banyak
Isolat Xanthomonas spp. (X. oryzae pv. oryzicola/Xoc,
X. axonopodis, X. campestris, X. cucurbitae, X. fraga-
riae, X. horotum, X. translucens) dan beberapa isolat
dari famili lain seperti Acidivorax avenae, Bulkhol-
deria, Erwinia, Pseudomonas dan Ralstonia. Isolat-
isolat bakteri selain Xoo tersebut digunakan sebagai
pembanding. Terjadi amplifikasi pada ukuran pasang
basa tertentu pada isolat Xoo, dan tidak ada amplifi-
kasi pada isolat bakteri yang bukan Xoo.
Melihat konsistensi dari setiap primer spesifik
Xoo untuk menyeleksi bakteri Xoo, penggunaan ha-
nya satu primer saja mungkin cukup untuk identifikasi
dini bakteri Xoo. Kemampuan primer spesifik Xoo di
dalam menyeleksi HDB dari lapang cukup dapat di-
andalkan. Sebagai contoh untuk isolat HDB dari
Kabupaten Subang (Jabar), walaupun koloninya ber-
warna kuning, hasil uji PCR menunjukkan ternyata
53
Jumlah Koloni yang positif Xoo**) Koloni yang positif Xoo (%)
30 29 96,66
46 20 43,48
22 22 100
44 44 100
74 74 100
seluruh koloni dari isolat tersebut bukan bakteri Xoo.
Berarti sampel daun tanaman sakit yang diambil dari
daerah Subang bukan isolat Xoo, padahal daerah
Subang sering dijumpai serangan HDB (Kadir, 2011).
Hal ini menunjukkan di daerah Subang yang berkem-
bang selain Xoo juga Xanthomonas spp. yang lain.
Persentase tertinggi koloni berwarna kuning yang
positif bakteri Xoo diperoleh dari isolat yang berasal
dari Kabupaten Senakin (Kalbar), Kabupaten Gowa
dan Makasar (Sulsel), dan Kabupaten Batang dan
Pekalongan (Jateng) masing-masing 100%. Persentase
terendah ditunjukkan oleh isolat bakteri yang dikolek-
si dari Kabupaten Subang (0%).
Uji Patogenisitas pada Galur-galur Isogenik dan
Beberapa Varietas Padi
Untuk mengetahui tingkat patogenisitasnya,
isolat-isolat bakteri yang positif Xoo diuji pada galur-
galur isogenik dan beberapa varietas populer serta
satu varietas kontrol. Sepuluh isolat Xoo dipilih secara
acak dari masing-masing lokasi. Pada penelitian, ini
isolat yang digunakan berasal dari 5 lokasi, sehingga
jumlah isolat Xoo yang diuji berjumlah 50 isolat. Hasil
uji patogenisitas tersebut disajikan pada Tabel 3 dan
Gambar 3.
Hasil pengujian menunjukkan, dari 10 galur iso-
genik (IRBB1 s.d. IRBB21), ternyata tujuh di antaranya
menunjukkan reaksi rentan dan agak rentan (Tabel
3). Dengan hasil evaluasi patogenisitas terhadap popu-
lasi Xoo merupakan langkah awal dalam program
pemuliaan padi tahan penyakit HDB. Hasil evaluasi ini
akan bisa dipahami struktur dan penyebaran populasi
Xoo dalam kaitannya dengan resistensi tanaman padi
yang ditanam di lahan pertanian.
Berdasarkan data pada Tabel 3 varietas Code
bereaksi tahan untuk isolat Xoo yang berasal dari ke-
lima lokasi. Code merupakan hasil silang balik antara
IR64 dengan IRBB7, sehingga Code membawa gen
Xa7. Namun, ternyata Xa7 pada IRBB7 bereaksi se-
dang dan agak rentan pada semua isolat Xoo yang di-
isolasi dari kelima lokasi. Hal ini membuktikan bahwa
54 JURNAL AGROBIOGEN VOL. 9 NO. 2

Tabel 3. Rerata hasil uji patogenisitas 50 isolat Xoo pada 10 galur isogenik dan 8 varietas padi.

Asal isolat yang diuji

Galur/Varietas Sumatera Barat Jawa Barat Jawa Tengah Sulawesi Selatan Kalimantan Barat
Rerata* Reaksi** Rerata Reaksi Rerata Reaksi Rerata Reaksi Rerata Reaksi
Nipponbare 11,37 AT 19,44 S 18,04 S 21,61 S 30,17 AR
Ciherang 29,53 AR 39,14 AR 33,66 AR 37,29 AR 42,47 AR
Code 3,84 T 3,18 T 3,57 T 5,21 T 4,21 T
IR64 39,15 AR 54,82 R 34,34 AR 36,07 AR 48,51 AR
Kuriak Putiah*** 52,40 R 67,89 R 36,13 AR 38,91 AR 71,91 R
Cisadane 20,81 S 42,98 AR 35,44 AR 40,51 AR 29,75 AR
Kencana Bali 54,82 R 65,77 R 34,56 AR 38,91 AR 63,89 R
IRBB1 60,48 R 70,40 R 41,92 AR 39,92 AR 85,98 SR
IRBB2 60,05 R 70,03 R 45,04 AR 40,43 AR 82,36 SR
IRBB3 47,57 AR 56,89 R 38,32 AR 36,93 AR 71,10 R
IRBB4 52,86 R 78,14 SR 42,52 AR 43,09 AR 74,03 R
IRBB5 6,05 AT 6,72 AT 5,54 T 6,13 AT 7,72 AT
IRBB7 36,59 AR 14,82 S 15,22 S 14,24 S 31,67 AR
IRBB10 61,77 R 79,88 SR 41,66 AR 40,36 AR 83,20 SR
IRBB11 59,56 R 74,89 R 40,51 AR 41,79 AR 84,18 SR
IRBB14 65,66 R 78,55 SR 43,01 AR 45,01 AR 90,09 SR
IRBB21 10,07 AT 18,34 S 13,85 S 15,75 S 15,16 S
IR24 50,40 AR 73,67 R 38,67 AR 43,21 AR 73,09 R
AT = agak tahan, T = tahan, S = sedang, AR = agak rentan, R = rentan, SR = sangat rentan. * rerata intensitas penyakit (IP) (%), ** kriteria
berdasarkan IRRI (2006), *** padi lokal yang dikembangkan di Sumatera Barat.

Code tidak hanya mengandung gen Xa7, namun me-
ngandung gen ketahanan lain. Menurut Arif et al.
(2008) dan Bustamam et al. (1997) IR64 memiliki gen
ketahanan Xa4, maka dengan adanya kombinasi gen
Xa4 dari IR64 dan Xa7 dari IRRB7 menjadikan varietas
Code lebih tahan terhadap beberapa isolat Xoo diban-
dingkan galur IRBB7 itu sendiri. Nafisah et al. (2007)
menyebutkan tanaman padi yang memiliki lebih ba-
nyak gen ketahanan Xa di dalam satu tanaman me-
miliki ketahanan yang lebih tinggi, sehingga tingkat
ketahanan tanaman bisa lebih panjang.
Gen ketahanan Xa7 dapat direkomendasikan
untuk digunakan dalam pengendalian penyakit HDB
di kelima lokasi pertanaman padi yang diteliti dalam
penelitian ini. Dalam program pemuliaan, gen Xa7
dapat ditransfer ke varietas populer yang belum me-
miliki gen ketahanan HDB, seperti ke dalam varietas
Ciherang, Inpari 13, Fatmawati, dan lain-lain.
Untuk gen xa5 didapatkan hasil reaksi agak ta-
han dan tahan, yaitu di bawah 10% kerusakan setelah
diuji dengan isolat-isolat dari kelima daerah. Gen xa5
pada IRBB5 ini juga bisa digunakan untuk dipindah-
kan ke varietas-varietas populer yang akan diperbaiki
ketahanannya terhadap HDB, bahkan berdasarkan pe-
nelitian ini gen xa5 lebih efektif dibandingkan dengan
gen Xa7 yang terdapat pada galur isogenik IRBB7.
Untuk gen ketahanan Xa21 yang sebelumnya dilapor-
kan termasuk efektif, pada penelitian ini termasuk
agak tahan dan sedang ketahanannya. Dari penelitian
ini diduga ada kemungkinan di lapang telah terjadi
mutasi HDB sehingga muncul strain Xoo baru yang
mematahkan gen ketahanan sebelumnya.
Apabila rerata intensitas penyakit (IP) tiap
provinsi dibuat rerata lagi, ternyata gen xa5, Xa7, dan
Xa21 masih efektif di lima lokasi tersebut (Gambar 4).
Persentase ketahanan pada gen tersebut berurutan
sebesar 93,57; 77,49; dan 85,37%. Ketiga gen memiliki
persentase yang cukup tinggi dibandingkan dengan
gen yang lain. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian
yang dilaporkan oleh Hifni et al. (1998) bahwa gen
ketahanan yang efektif di Indonesia adalah xa5, Xa7,
dan Xa21. Rentang waktu selama tahun 1997-2012 (15
tahun) membuktikan bahwa ketiga gen tersebut ma-
sih efektif untuk melawan serangan HDB jenis oryzae
(Xoo). Gabungan ketiga gen ke dalam satu tanaman
diharapkan bisa menjadi solusi tingkat ketahanan
yang lebih lama. Xoo dikenal sebagai bakteri yang
sangat mudah beradaptasi. Varietas padi yang baru di-
lepas biasanya hanya dapat bertahan dalam waktu 6
musim tanam terhadap serangan bakteri ini (Kadir,
2009).
Gen ketahanan terhadap HDB yang efektif ber-
beda-beda untuk setiap lokasi suatu negara. Di Korea,
Nepal, dan Vietnam, gen ketahanan Xa21 adalah yang
paling efektif dibandingkan dengan gen ketahanan
lainnya (Lee et al., 1999; Furuya et al., 2012). Shanti et
al. (2010) melaporkan empat gen (Xa4, xa5, Xa13,
dan Xa21) cukup efektif di India. Hasil penelitian ini
mengindikasikan tiga gen (xa5, Xa7, Xa21) efektif di
lima lokasi di Indonesia untuk mengatasi penyakit
HDB.
2013 TASLIAH ET AL.: Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri 55

A B C D

E K. Bali IRBB21
IRBB7
IRBB5

Code

Gambar 3. Uji patogenisitas HDB pada beberapa galur/varietas uji. A, B, C, D = daun yang terserang HDB dari Provinsi Sumbar pada varietas
Code, Ciherang, Cisadane, dan IR64; E= gejala HDB pada daun seluruh galur uji yang diinokulasi dengan Xoo11-023 yang berasal
dari Sumbar (nomor 1-18 merujuk pada Tabel 1).

70
Rerata intensitas penyakit (%)

60

50

40

30

20

10

0
Ciherang (AR)

Code (T)

IR64 (AR)

Cisadane (AR)

K. Bali (R)

IRBB1 (R)

IRBB2 (R)

IRBB3 (R)

IRBB4 (R)

IRBB5 (AT)

IRBB7 (S)

IRBB10 (R)

IRBB11 (R)

IRBB14 (R)

IRBB21 (R)
K. Putiah (R)

IR24 (R)
Nipponbare (S)

Gambar 4. Histogram rerata intensitas penyakit dari lima lokasi sampling di Indonesia. T = tahan, AT = agak tahan, S = sedang,
AR = agak rentan, R = rentan. Persentase ketahanan = 100% - persentase intensitas penyakit.
56 JURNAL AGROBIOGEN
KESIMPULAN
Penggunaan primer spesifik Xoo2976, Xoo80, dan
Xoo, sangat efektif untuk identifikasi dini bakteri X.
oryzae pv. oryzae. Dari 216 isolat yang diuji, 189 isolat
merupakan bakteri Xoo dan 27 isolat bukan bakteri
Xoo. Uji patogenisitas dari isolat Xoo menunjukkan
bahwa gen resisten pada tanaman xa5, Xa7, dan Xa21
masih cukup efektif menangkal serangan penyakit
HDB padi di lima wilayah pertanaman padi yang men-
jadi target penelitian ini, dengan persentase ketahan-
an berturut-turut sebesar 93,57; 77,49; dan 85,37%.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dibiayai oleh Proyek Program Riset
Insentif Peningkatan Kapasitas Penelitian dan
Perekayasa (RIPP TA 2011 dan PKPP TA 2012). Terima
kasih juga disampaikan kepada Indra Kurniawan
Saputra dan Ahmad Irvan Arrasyid mahasiswa S1
Biokimia, FMIPA-IPB, yang telah membantu dalam
penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Adachi, N. and T. Oku. 2000. PCR-mediated detection of
Xanthomonas oryzae pv. oryzae by amplification of the
16S-23S rDNA spacer region sequence. J. Gen. Plant
Pathol. 66(4):303-309.
Arif, M., M. Jaffar, M. Babar, M.A. Sheikh, S. Kousar, A. Arif,
and Y. Zafar. 2008. Identification of bacterial blight
resistance genes Xa4 in Pakistani rice germplasm using
PCR. Afr. J. Biotechnol. 7(5):541-545.
Bustamam, M., M. Yunus, A. Warsun, Suwarno, H.R. Hifni,
dan T.S. Kadir. 1997. Penggunaan marka molekuler
dalam perbaikan ketahanan varietas padi terhadap pe-
nyakit hawar daun bakteri di Indonesia. hlm. 174-184.
Dalam S. Moeljopawiro, M. Herman, S. Saono, B.
Purwantara, dan H. Kasim (eds.) Prosiding Seminar
Perhimpunan Bioteknologi Pertanian Indonesia.
Surabaya, 12-14 Maret 1997.
Dafa’alla, T.H., G. Hobom, and H. Zahner. 2000. Direct
colony identification by PCR-miniprep. Mol. Biol. 1:65-
66.
Direktorat Perlindungan Tanaman Pangan. 2012. Serangan
BLB pada Padi di Indonesia Masa Tanam 2002 s.d.
2009. Tidak dipublikasi.
Furuya, N., S. Taura, T. Goto, B.T. Thuy, P.H. Ton, K.
Tsuchiya, and A. Yoshimura. 2012. Diversity in virulence
of Xanthomonas oryzae pv. oryzae from Northern
Vietnam. JARQ 46(4):329-338.
George, M.L.C., M. Bustamam, W.T. Cruz, J.E. Leach, and
R.J. Nelson. 1997. Movement of Xanthomonas oryzae
pv. oryzae in Southeast Asia detected using PCR-based
DNA fingerprinting. Phytopathology 87(3):302-309.
VOL. 9 NO. 2
Goto, T., T. Matsumoto, N. Furuya, K. Tsuchiya, and A.
Yoshimura. 2009. Mapping of bacterial blight resistance
gene Xa11 on rice chromosome 3. JARQ 43(3):221-
225.
Hifni, H.R. dan M.K. Kardin. 1998. Pengelompokan isolat
Xanthomonas oryzae pv. oryzae dengan menggunakan
galur isogenik padi IRRI. Hayati 5(3):66-72.
International Rice Research Institute. 1995. DNA
Fingerprinting Techniques for the Bacterial Blight
Pathogen. Asian Rice Biotechnology Network (ARBN).
International Rice Research Institute. Manila. 22p.
International Rice Research Institute. 1996. Standard
th
Evaluation System for Rice. 4 edition. Philipphines.
52 p.
Kadir, T.S. 2009. Menangkal HDB dengan menggilir varietas.
Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian
31(5):1-3.
Kadir, T.S. 2011. Penyakit bakteri pada padi. http://
pangan.litbang.deptan.go.id/-berita/penyakit [25 Sep-
tember 2013].
Lang, J.M., J.P. Hamilton, M.G.Q. Diaz, M.A.V. Sluys, M.R.G.
Burgos, C.M.V. Cruz, C.B. Buell, N.A. Tiserat, and J.E.
Leach. 2010. Genomics-based diagnostic marker
development for Xanthomonas oryzae pv. oryzae and X.
oyzae pv. oryzicola. Plant Dis. 94:311-319.
Lee, B.M., Y.J. Park, D.S. Park, H.W. Kang, J.G. Kim, E.S.
Song, I.C. Park, U.H. Yoon, J.H. Hahn, B.S. Koo, G.B.
Lee, H. Kim, H.S. Park, K.O. Yoon, J.H. Kim, C.H. Jung,
N.H. Koh, J.S. Seo, and S.J. Go. 2005. The genome
sequence of Xanthomonas oryzae pathovar oryzae
KACC10331, the bacterial blight pathogen of rice. Nuc.
Acids Res. 33(2):577-586.
Nafisah, A.A. Daradjat, B. Suprihatno, dan T.S. Kadir. 2007.
Heritabilitas karakter ketahanan hawar daun bakteri dari
tiga populasi tanaman padi hasil seleksi daur ulang
siklus pertama. Pen. Pert. Tan. Pangan 26:100-105.
Nino-Liu, D.O., P.C. Ronald, and A.J. Bogdanove. 2006.
Xanthomonas oryzae pathovars: Model pathogens of a
model crop. Mol. Plant Pathol. 7(5):303-324.
Ochiai, H., V. Inoue, M. Takeya, A. Sasaki, and H. Kaku.
2005. Genome sequence of Xanthomonas oryzae pv.
oryzae suggests contribution of large numbers of
effector genes and insertion sequences to its race
diversity. JARQ 39:275-287.
Onasanya, A., A. Basso, E. Somado, E.R. Gasore, F.E.
Nwilene, I. Ingelbrecht, J. Lamo, K. Wydr, M.M.
Ekperigin, M. Langa, O. Oyelakin, Y. Sete, S. Winter,
and R.O. Onasanya. 2010. Development of combined
molecular diagnostic and DNA fingerprinting technique
for rice bacteria pathogens in Africa. Biotechnology
9(2):89-105.
Salzberg, S.L. D.D. Sommeri, M.C. Schatzi, A.M. Philippy,
P.D. Rabinowicz, S. Tsuge, A. Furutani, H. Ochiai, A.L.
Delcher, D. Kelley, R. Madupu, D. Puiu, D. Radune, M.
Shumway, C. Trapnell, G. Aparnas, G. Jha. A. Pandeys,
2013 TASLIAH ET AL.: Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri 57

P.B. Patils, H. Ishihara, D.F. Meyer, B. Szureki, V.
Verdier, R. Koebnik, J.M. Dow, R.P. Ryan, H. Hirata, S.
Tsuyumu, S.W. Lee, P.C. Ronald, R.V. Sontis, M.V.
Sluyo, J.E. Leach, F.F. White, and A.J. Bogdanove.
2008. Genome sequence and rapid evolution of the rice
pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae PXO99A.
BMC Genomics 9(204):1-16.
Shanti, M.L., V.V. Shenoy, G.L. Devi, V.M. Kumar, and P.
Premalatha. 2010. Marker-assisted breeding for
resistance to bacterial leaf blight in popular cultivar and
parental lines of hybrid rice. J. Plant Pathol. 92(2):495-
501.