6.

ELEKTROFORESIS GEL
Elektroforesis gel merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas
ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya, teknik ini tidak hanya digunakan sebagai
metode analisis tetapi juga digunakan untuk persiapan memurnikan fragmen-fragmen DNA
tertentu. Selain dapat memunculkan fragmen-fragmen DNA yang panjangnya berbeda-beda,
elektroforesis gel juga dapat digunakan untuk memisahkan konfigurasi molekul yang berbeda-
beda dari suatu molekul DNA. Hal ini disebabkan tiap konfigurasi molekul DNA mempunyai
kecepatan gerak yang berbeda-beda, baik itu konfigurasi berbentuk lingkaran tertutup kovalen,
lingkaran longgar (relaks), lurus, dll. Keuntungan metode ini adalah pita DNA dapat dideteksi
dengan tingkat kepekaan yang tinggi.

Gel yang digunakan pada teknik ini tersusun atas poliakrilamida atau agarosa. Agarosa
banyak digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang mempunyai rentang beberapa
ratus hingga 20.000 pasangan basa, sedangkan poliakrilamida lebih disukai untuk fragmen DNA
yang berukuran lebih kecil. Untuk fragmen DNA yang sangat besar (1000-2000kb) telah
dikembangkan elektroforesis dalam agarosa dengan bidang listrik bergetar.
Cara pembuatan gel agarose yaitu:

1. Tentukan konsentrasi atau presentase agarose yang dibutuhkan dan hal ini tergantung dari
ukuran fragmen DNA yang dianalisis. Presentase gel agarose yang direkomendasikan, adalah
sebagai berikut:
a. 0,5% agarose untuk fragmen DNA berukuran 1000-30.000pb
b. 0,7% agarose untuk fragmen DNA berukuran 800-12.000pb
c. 1,5% agarose untuk fragmen DNA berukuran 200-3.000pb
d. 2,0% agarose untik fragmen DNA berukuran 50-20.000pb
2. Pilih tipe agarose yang digunakan. Kebanyakan tipe yang digunakan adalah standart agarose.
Misalnya telah ditentukan akan dibuat 2% gel agarose dalam volume 200 ml 1x buffer TAE,
maka jumlah agarose yang akan ditimbang yaitu: 2 gram/100ml x 200ml=4 gram.
3. Tempatkan 4 gram agarose ke dalam labu erlenmeyer dan isi dengan larutan 1X Buffer TAE
sampai volume 200ml, kemudian kocok sampai merata.
4. Panaskan dalam microwave sampai mendidih sampai larutan menjadi jernih.
5. Didinginkan agarose kira-kira sampai 600C dan tambahkan 5µl ethidium bromide (10mg/ml)
dan campur hingga merata.
6. Setelah itu larutan dituang ke dalam tray dan pasang well-forming combs, tunggu kurang lebih
30 menit atau sampai gel mengeras. Lepaskan well-forming combs secara perlahan-lahan dan
gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis.
 Gambar X. Gel Agarosa untuk Elektroforesis DNA
(Sumber: Yuan & Hoon Kim, Yong. (2012). Agarose Gel Electrophoresis
for the Separation of DNA Fragments)

Mekanisme Elektroforesis DNA

Molekul DNA memiliki muatan negatif dan di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui
matriks gel menuju kutub positif (anode). Laju migrasi ini bergantung pada ukuran DNA, molekul
DNA yang berukuran kecil dapat dengan mudah melewati gel dan karenanya bergerak lebih cepat
dibanding molekul berukuran lebih besar. Menurut Aaij & Borst (1972) harga laju migrasi molekul
DNA berbanding terbalik dengan harga logaritma berat molekulnya. Pada penerapan teknik ini
pasti akan selalu digunakan DNA penanda yang ukurannya sudah diketahui, agar dapat ditemukan
ukuran yang tepat untuk DNA yang sedang dicari. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di
bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel direndam di dalam larutan etidium
bromid.

Gambar X. Mekanisme Elektroforesis Gel Agarose

(Sumber: MolecularStation.Com)
4. Transformasi DNA
Transformasi DNA merupakan suatu metode untuk memasukkan DNA ke dalam genom
suatu organisme, sehingga organisme tersebut nantinya akan menampilkan karakter yang dikode
DNA tersebut. Sebagai contoh, Green Fluorescent Protein (GFP) pada kunang-kunang yang
menyebabkan kunang-kunang tersebut bercahaya ketika malam hari. Ketika gen GFP tersebut
ditransformasikan ke tanaman dan berhasil terinsersi ke dalam kromosom, maka tanaman tersebut
akan mempunyai sifat yang mirip dengan kunang-kunang (berpendar). Definisi lain dari
transformasi adalah ekspresi materi genetik asing yang masuk melalui dinding sel. Pada dasarnya
dinding sel berfungsi melindungi sel dari masuknya benda-benda asing termasuk DNA, tapi dalam
kondisi tertentu, dinding sel ini bisa memiliki semacam celah atau lubang yang bisa dimasuki
DNA.
Tidak semua bakteri mampu mentransformasi DNA eksogenous kedalam genom mereka.
Bakteri disebut kompeten secara alami apabila memiliki kemampuan mengambil DNA
eksogenous kedalam sel dan mentransformasikannya dalam genom. Mekanisme transformasi
DNA umumnya terjadi dengan langkah berikut:
1. Terjadi pengenalan dan penempelan dsDNA (double strand) eksogen pada dinding sel
bakteri
2. dsDNA masuk kedalam dinding dan membran sel via protein channel
3. dsDNA mengalami pendegradasian pada salah satu untainya, sisa berupa ssDNA (single
stranded) akan masuk kedalam sitoplasma
4. Dalam sitoplasma, ssDNA eksogen tersebut menjadi template untuk sintesis dsDNA baru
yang akan terintegrasi dalam kromosom atau menjadi plasmid baru

Gambar X. Proses transformasi pada sel bakteri

(Sumber: www.genetika.biol.pmf.unizg.hr)
Metode Transformasi DNA
Terdapat perbedaan metoda untuk prokariot dan eukariot. Heat shock adalah metoda yang
paling umum dipakai untuk prokariot. Karena eukariot lebih kompleks sruktur dinding sel yang
artinya lebih keras, maka lebih banyak metode yang dapat dipakai. Beberapa Metode yang biasa
digunakan pada trasnformasi DNA adalah:
1. Metode Kejutan Panas (Heat Shock)

Merupakan metode transformasi pada bakteri E.coli yang pertama kali dikembangkan pada tahun
1970 oleh M. Mandel dan A. Higa. Metode ini merupakan metode paling sederhana di mana
bakteri E.coli yang akan ditransformasi diinkubasi pada larutan yang mengandung kation divalen
(umumnya magnesium klorida, kemudian kalsium klorida pada kondisi dingin, yang kemudian
dipaparkan pada pulsa heat shock). Membran sel E.coli mempunyai ratusan pori-pori yang disebut
dengan zona adisi, dan tersusun dari molekul-molekul negatif. Bakteri E.coli memiliki permukaan
yang bermuatan negatif akibat adanya fosfolipid dan lipopolisakarida, sehingga digunakan kation
divalen yang berfungsi untuk melindungi muatan negatif DNA agar dapat melekat pada
permukaan E.coli. Walaupun ukuran zona adisi terbilang cukup besar untuk DNA yang akan
masuk, karena DNA juga bermuatan negatif, maka akan terjadi tolakan. Penggunaan larutan CaCl2
sebagai medium akan menyumbangkan ion kalsiumnya yang bermuatan positif, sehingga keadaan
menjadi netral. Penurunan temperatur sampai 00C menyebabkan molekul lipid menjadi lebih diam
dan keadaan menjadi lebih stabil. Selain itu, pemaparan E.coli pada larutan kation divalen yang
bertemperatur dingin akan melemahkan struktur permukaan E.coli dan mempengaruhi porositas
membran sel sehingga pada saat terjadi lonjakan temperatur, membran selnya menjadi tidak
selektif terhadap molekul asing (dan permeabel terhadap DNA plasmid). Akan terjadi induksi
untuk membuat celah sehingga DNA plasmid superkoil dapat masuk ke bagian dalam sel.
Selanjutnya, pemaparan heat shock akan membentuk ketidakseimbangan termal pada kedua sisi
membran sel, sehingga DNA plasmid dapat masuk melalui pori-pori sel atau dinding sel yang
dirusak tersebut.

Gambar X. Mekanisme Metode Heatshock

(Sumber: libguides.stonehill.edu)
2. Elektroporasi

Metode elektroporasi merupakan metode yang menggunakan kejutan listrik untuk

membentuk lubang-lubang pada membran sel, sehingga DNA plasmid dapat memasukinya. Aliran
listrik yang digunakan dalam elektroporasi akan menyebabkan membran sel mengalami kerusakan
dan terbentuknya pori sementara pada lapisan hidrofobik sekitar 2 nm, sehingga sel bakteri dapat
menyerap DNA eksogenus dari larutan suspensi. Sebagian sel akan bertransformasi dengan stabil,
sehingga dapat diseleksi selanjutnya. Dua mekanisme yang konsisten dalam elektroporasi adalah:
pembukaan kompartemen baru (interior dari sel) agar DNA dapat berdifusi secara pasif ke dalam
sel bakteri, dan aliran ruah dari medium yang mengandung DNA plasmid, menuju ke sel bakteri.
Difusi molekul DNA memang akan sedikit lambat, tetapi jarak antara sel dan DNA sangat kecil
sehingga mekanisme ini memungkinkan DNA plasmid untuk masuk dalam sel bakteri. Sel bakteri
juga dapat menerima 10% dari volume aliran ruah yang dipengaruhi oleh kekuatan osmotik
mediumnya.
Elektroporasi dilakukan dengan mengintroduksikan suspensi sel terkonsentrasi dan
plasmid DNA rekombinan pada medan listrik dengan amplitudo yang sangat tinggi. Proses
elektroporasi sangat bergantung pada dua karakteristik pulsa listrik: kekuatan medan listrik dan
panjang pulsa (konstanta waktu-hambatan-kapasitas). Sedangkan, efisiensi elektroporasi
bergantung pada banyak faktor, seperti temperatur, parameter medan listrik (voltase, resistansi dan
kapasitansi), bentuk topologis DNA, dan faktor sel inang (latar belakang genetik, kondisi tumbuh,
dan kondisi setelah kejutan listrik). Frekuensi transformasi menunjukkan fungsi yang linear
dengan konsentrasi DNA dalam enam tingkat orde. Sedangkan, efisiensi transformasi merupakan
fungsi dari konsentrasi sel bakteri. Sebagian besar sel bakteri yang tetap hidup merupakan bakteri
yang kompeten, dan 80% di antaranya bertransformasi pada konsentrasi DNA yang tinggi.

Gambar X. Cara Kerja Metode Elektroforasi pada sel

(Sumber: www.quizover.com)

3. Polyethylen glycol-mediated protoplast (PEG)

Merupakan proses introduksi DNA yang dilakukan tanpa melalui vektor perantara.
Transformasi protoplas umumnya dilakukan pada tanaman monokotil jenis serealia. Teknik ini
menggunakan senyawa polyethylen glycol (PEG) sebagai perantara masuknya DNA ke dalam
kromosom tanaman. Keberhasilan teknik transformasi dengan PEG masih rendah karena
regenerasi protoplas sangat bergantung pada jenis genotipe yang dipakai dan tidak dapat
diaplikasikan pada semua sel tanaman.
4. Transformasi biolistik (microprojectile bombardment)
Metode biolistik (biolistic), particle bombardment, atau biolistic particle delivery system
merupakan metode transfer gen yang digunakan untuk melakukan transformasi sel secara in situ.
Metode ini diawali dengan proses pelapisan partikel macroprojectiles (seperti emas atau tungsten
atau logam berat lainnya) dengan plasmid DNA sebagai microprojectiles. DNA target akan
diletakkan diatas permukaan emas sekitar 0.5-1.5 μm, kemudian dilakukan penembakan dengan
berangkat gene gun yang menembak dengan tekanan tinggi. Materi genetik yang dimasukkan ke
dalam sel disebut sebagai trans gene. DNA yang sudah terlapisi dengan emas akan masuk ke dalam
jaringan dan melakukan integrasi ke dalam DNA kromosom secara acak. Metode ini dirancang
untuk transformasi sel tumbuhan, dan mampu mentransformasi hampir semua jenis sel dan tidak
terbatas pada materi genetik dari nukleus, tetapi plastida dan organel yang memiliki materi genetik
lainnya juga dapat ditransformasi.

Gambar X. Metode biolistik (microprojectile bombardment)

(Sumber: Brooks, 2015)

5. Mediasi Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri Gram positif yang bersifat fitopatogen pada
tanaman dikotil. Bakteri tersebut mempunyai kemampuan yang secara alami dapat mentransfer
potongan DNA (transfer DNA) ke dalam genom tanaman dan menyebabkan terbentuknya tumor
(crown gall), yang merupakan sumber karbon bagi A. tumefaciens. Kemampuan A. tumefaciens
tersebut digunakan untuk menyisipkan gen bermanfaat ke dalam tanaman seperti gen yang
berperan dalam perbaikan sifat. Transformasi dengan A. tumefaciens memiliki beberapa
keuntungan, seperti mudah dilakukan, integrasi ke dalam genom DNA yang stabil, dan efisiensi
transformasi yang cukup tinggi. Transformasi dengan A. tumefaciens juga memiki efisiensi
transformasi dengan salinan gen tunggal yang dihasilkan lebih tinggi. Akan tetapi, keberhasilan
transformasi A. tumefaciens masih terbatas pada genotipe tanaman tertentu.
6. Lipofeksi
Sel-sel binatang, dan protoplas khamir sel tanaman dan bakteri rentan terhadap
transformasi oleh liposom (Deshayes dkk, 1985). Suatu sistem transformasi sederhana sudah
dikembangkan yang memanfaatkan liposom yang diambil dari lipida kationik (Filgner dkk, 1987).
DNA dalam lautan secara spontan dan efisien akan membentuk kompleks dengan liposom ini.
Liposom yang bermuatan positif tidak hanya membentuk kompleks dengan DNA, tetapi juga
melekat pada sel-sel hewan yang dikultur dan lapisan-lapisan itu efisien melakukan transformasi
atas sel-sel tersebut, yang mungkin terjadi melalui fusi dengan membran plasma. Pemanfaatan
liposom sebagai suatu sistem transformasi atau transfeksi disebut sebagai Lipofeksi.

Gambar X. Metode Lipofeksi

(Sumber: www.ozbiosciences.com)