BJ 

OURNAL OF 
ACTERIOLOGY 
, 
Maret 1998, hlm. 1533–1539 Vol. 180, No. 6 0021-9193 / 98 / $ 04.00 0 Hak Cipta © 1998, 
Masyarakat Amerika untuk Mikrobiologi 

Karakterisasi Cassette Gene Diperlukan untuk Biosintesis dari 

(136) -Link N-Acetyl- 
D 

-Mannosamine-1-Phosphate Capsule of 

Serogroup Neisseria meningitidis 
JOHN S. SWARTLEY, 1,2,3 LI-JUN LIU, 1,3 YOON K. MILLER, 1,3 LARRY E. MARTIN, 1,3 
SRILATHA EDUPUGANTI, 1,3 
DAN 
DAVID S. STEPHENS1,2 , 3 * Departemen Medicine1 dan Mikrobiologi dan Imunologi, 2 Emory University School of Medicine, 
dan Department of Veterans Affairs Medical Center, 3 Atlanta, Georgia 
Diterima 21 Agustus 1997 / Diterima 13 Desember 1997 
The (136) -linked N-acetyl 
D 
Kapsul meningokokus -mannosamin-1-fosfat serogrup A Neisseria meningitidis secara biokimia berbeda dari kapsul 
yang mengandung asam sialic yang diproduksi oleh serogrup meningokokus yang terkait dengan penyakit lainnya 
(misalnya, B, C, Y, dan W-135). Kami mendefinisikan kaset genetik yang bertanggung jawab untuk ekspresi kapsul A 
serogrup. Kaset tersebut terdiri dari urutan nukleotida 4,701-bp yang terletak di antara gen transporter kapsul kapsul 
luar, ctrA, dan galE, yang mengkodekan UDP-glukosa-4-epimerase. Empat kerangka baca terbuka (ORFs) tidak 
ditemukan dalam genom dari serogroup meningokokus lainnya diidentifikasi. Serogrup pertama A ORF dipisahkan dari 
cTRA oleh wilayah intergenik 218-bp. Reverse transcriptase (RT) PCR dan studi ekstensi primer serogrup A mRNA 
menunjukkan bahwa semua empat ORFs ditranskripsikan dalam orientasi yang berlawanan dengan ctrA dan bahwa 
transkripsi ORFs dimulai dari wilayah intergenik oleh promotor -70-tipe yang tumpang tindih cTRA promotor. ORF 
pertama menunjukkan 58% identitas asam amino dengan UDP-N- 
D- 
acetyl-glukosamin (UDP-GlcNAc) 2-epimerase Escherichia coli, yang bertanggung jawab untuk 
konversi UDP-GlcNAc menjadi UDP-N-acetyl- 
D 
-mannosamin.  Polar  atau  nonpolar  mutagenesis  dari  masing-masing 
ORFs  menghasilkan  penghentian  produksi  kapsul  A  serogrup  sebagaimana  ditentukan  oleh  immunoblots  koloni  dan 
immunosorbent  assay  terkait  enzim.  Penggantian  gen  serogrup  A  gen  biosintetik  dengan  kaset  sero-grup  B  dengan 
transformasi  menghasilkan  penggantian  kapsul  dari  kapsul  A  serogrup  ke  kapsul  serogroup  B.  Data  ini  menunjukkan 
bahwa  perakitan  kapsul  serogrup  A  kemungkinan  dimulai  dengan  monomeric UDP-GlcNAc dan membutuhkan protein 
yang  dikodekan  oleh  tiga  gen  lain  yang  ditemukan  di  serogrup A N. meningitidis-spesifik operon yang terletak di antara 
ctrA dan galE. 
 Epidemi  meningitis  dan  septikemia  yang  berulang  dan  menghancurkan  akibat  serogrup  A  Neisseria  meningitidis  terus 
menjangkiti  banyak  bagian  di  negara  berkembang  (2,  28,  29,  31,  32,  42,  43)  dan  dapat  menghasilkan  tingkat  serangan  yang 
mendekati  1%  dari  populasi.  Spesifitas serogrup N. meningitidis ditentukan oleh struktur polisakarida kapsul. Kapsul serogrup A 
terdiri dari unit pengulang (136) -linked N-acetyl- 
D 
kapsul-mengekspresikan  serogrup.  Berdekatan  dengan  5  ujung  ctrA  dalam  serogrup  B,  C,  Y,  dan  W-135  adalah  wilayah 
intergenik  134-bp  memisahkan  ctrA ke -D klaster transportasi dari biosintesis asam sialat dan gen polymerase kapsul, synA ke-D 
(E  ,  F,  G)  (37,  38).  Dalam  laporan  ini  kami  mencirikan  kaset genetik segera di hulu dari ctrA di serogrup A N. meningitidis dan 
menetapkan perannya dalam (136) -linked N- 
D 
acetyl--mannos- 
-mannosamine-1-fosfat 
amine-1-fosfat kapsul biosintesis. (26). Struktur ini secara 
kimia berbeda dari yang ada pada kapsul dari penyakit utama lainnya yang terkait dengan penyakit meningokokus 
BAHAN DAN METODE serogrup, 
B, C, Y, dan W-135, yang tersusun dari atau mengandung asam sialic. Gen yang diperlukan untuk biosintesis 
Strain, plasmid, dan kondisi pertumbuhan. Serogrup Sebuah strain meningokokus F8229 dan F8239 pada awalnya diisolasi 
selama wabah di Nairobi, kapsul asam sialic Kenya yang mengandung N. meningitidis baru-baru ini telah dikarakterisasi (38), 
tetapi dasar genetik untuk biosintesis polisakarida kapsul serogrup A belum ditentukan. 
Kami dan yang lain (15, 38) sebelumnya telah menunjukkan sero- 
pada tahun 1989 (32) dan disediakan oleh Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit (CDC), Atlanta, Georgia. Strain F8229 
(CDC1750) dienkapsulasi dan terisolasi secara klinis dari funtul serebrospinal pasien dengan meningitis. Strain F8239 
(CDC16N3) adalah varian yang tidak dienkapsulasi awalnya diisolasi sebagai strain sero-grup A dari faring pembawa 
asimtomatik. Strain grup A N. meningitidis ini berisi homolog ctrA, yang pertama dari empat gen polikistronik, ctrA ke-D, 
ditemukan pada serogrup meningokokus B, C, Y, dan W-135. Gen cTRA to -D adalah anggota keluarga transporter ABC dan 
protein encode 
milik klonal grup III-1 dan terkait erat dengan strain yang telah menyebabkan epidemi di Arab Saudi, Chad, Ethiopia, dan bagian 
lain dunia (2, 28, 31, 32). F8229-ORF1, F8229-ORF2, F8229-ORF2aphA-3, F8229-ORF3, dan F8229-ORF4 adalah mutan 
serogrup A yang dibuat oleh mutagenesis insersional, seperti dijelaskan di bawah ini. Strain F8229-43 dan F8229-43R diciptakan 
oleh transfor-terlibat dalam pengangkutan kapsul dirakit melintasi membran dalam dan luar (14). Serogrup A ctrA ho-molog, 
bagaimanapun, berbeda dalam ukuran fragmen Southern ClaI (38) dan 5 urutan nukleotida (15) dari ctrA dalam asam sialat 
dari strain F8229 dengan DNA kromosom yang diperoleh dari serogrup B meningococcal mutan strain 43 (37 ). 
Escherichia coli InvF (Invitrogen, San Diego, Calif.) Digunakan sebagai strain inang untuk semua produk PCR hasil kloning dan 
plasmid rekombinan yang dibuat selama penelitian ini. Plasmid pHP45 (33) adalah sumber dari spectinomycin-resistant 
-fragments yang digunakan untuk mutagenesis gen polar (lihat di bawah), dan plasmid pUC18K (27) adalah sumber dari kaset 
resistansi kanamycin aphA-3 yang digunakan untuk non- * Koresponden penulis. Alamat surat: Divisi Penyakit Infeksi, Fakultas 
Kedokteran Universitas Emory, Jalan Butler 69, SE, Atlanta, GA 30303. Telepon: (404) 728-7688. Faks: (404) 329-2210. E- 
polar mutagenesis (lihat di bawah). 
Strain meningokokus ditumbuhkan pada gloococcal (GC) base agar (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) Atau dalam GC broth 
(30) pada 37 ° C dengan 3,5% CO 
2 
mail: DSTEP01@Emory.edu. 
1533 
,  dengan  pengecualian  dari  mutan  meningokokus  yang  tumbuh  di 
bawah seleksi kanamisin, yang dilakukan pada otak agar dasar infus jantung (Becton Dickinson dan 
 
Co, Cockeysville, Md.) Mengandung 2,5% janin bovine serum (GIBCO BRL, Gaithersburg, Bertani (LB) Md.) Pada kaldu 37 ° 
C atau pada LB dengan agar 3,5% pelat CO 
2 
. (GIBCO E. coli strain adalah BRL) pada saat tumbuh di Luria- 37 ° C. Antibiotik (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) 
digunakan pada konsentrasi akhir berikut: kanamisin, 60 g / ml; spectinomycin, 100 g / ml; ampisilin, 100 g / ml; dan tetrasiklin, 
5 g / ml. 
Pemurnian  asam  nukleat.  DNA kromosom diisolasi dari N. meningidis dengan prosedur yang dijelaskan oleh DiLella dan Woo 
(12).  RNA  disiapkan oleh modifikasi yang dijelaskan sebelumnya dari metode yang diterbitkan oleh Baker dan Yanofsky (3, 37). 
DNA dicerna dengan endonuklease restriksi yang diperoleh dari New England Biolabs, Beverly, Mass. 
Standard  PCR  dan  SSP-PCR.  PCR  standar  dilakukan  seperti  yang  dijelaskan  sebelumnya  (39).  Amplitaq  DNA  polymerase 
(Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.) Digunakan untuk reaksi ini, dan dalam beberapa reaksi, aditif Taq Extender PCR (Stratagene, La 
Jolla,  Calif.)  Digunakan  untuk  meningkatkan  efisiensi  dan  reliabilitas.  Primer oligonukleotida yang digunakan ditunjukkan pada 
Tabel  1.  Produk  yang  diamplifikasi  divisualisasikan  oleh  elektroforesis  gel  agarose  1,2%  dan  deteksi  UV  setelah  pewarnaan 
ethidium  bromide.  Produk  PCR  dimurnikan  melalui  bagian  melalui kolom spin pemurnian PCR QIAquick (Qiagen, Chatsworth, 
Calif.)  Sebelum  manipulasi  lebih  lanjut.  Kromosom  berjalan  melalui  PCR  tunggal  spesifik  (SSP) dilakukan dengan teknik yang 
dijelaskan oleh Shyamala dan Ames (34) dan sebelumnya digunakan oleh kami (37). 
Ekstensi  primer  dan  RT-PCR.  Kami menggunakan AMV Reverse Transcriptase Primer Extension System (Promega, Madison, 
Wis.)  Sesuai  dengan  petunjuk  pabrikan.  Sebuah  tes  transkripsi  terbalik (RT) PCR yang dikembangkan di laboratorium kami dan 
sebelumnya dijelaskan digunakan untuk studi ini (37). 
PCR  Koloni.  Satu  koloni  dari  kultur  berlapis  dikumpulkan  dengan  loop  steril  dan  diresuspensi  dalam  20  l  air  suling  steril. 
Suspensi  koloni  kemudian  mengalami  dua  putaran  freeze-thawing  menggunakan  mandi  es-etanol  dan  mandi  air  37  °  C.  Satu 
mikroliter dari campuran freeze-thaw kemudian digunakan sebagai template dalam PCR standar. 
Kloning  produk  PCR.  Produk  DNA  yang  diperkuat  oleh  PCR  standar  atau  SSP-PCR  dikloning  dengan  TA  Kloning  Kit 
(Invitrogen) atau Sistem Vector pGEM-T (Promega). 
Sekuensing  nukleotida.  Produk  DNA  plasmid  dan  PCR  yang  dimurnikan  dilakukan  dengan  menggunakan  cara  manual  dan 
otomatis.  Untuk  sekuensing  manual  kami  menggunakan  AmpliCycle  Cycle  Sequencing  Kit  (Perkin-Elmer)  sesuai  dengan 
petunjuk  pabrikan.  Sekuensing  DNA  otomatis  dilakukan  dengan  Prism  Dye-Deoxy  Terminator  Cycle  Sequencing  Kit  (Applied 
Biosystems, Inc. [ABI], Foster City, Calif.), Dan reaksi selesai dijalankan pada ABI model 377 Automated DNA Sequencer. 
Analisis  sekuens  nukleotida  dan  asam  amino  dilakukan  dengan  menggunakan  paket  analisis  sekuens  DNASTAR  (Madison, 
Wis.)  Atau  paket  perangkat  lunak  analisis  Genetika  Com-  puter  Group (GCG), versi 7.3.1-UNIX (11). Kami juga menggunakan 
alat  pencarian  dan  database nukleotida dan asam amino yang tersedia di Internet; situs yang dikunjungi termasuk Pusat Informasi 
Bioteknologi  Nasional  (http://www.ncbi.nlm.nih.gov),  pangkalan  data  genom  gonokokal  FA1090  di  Pusat  Advanced  Genome 
Technology Universitas Oklahoma (http: //www.genome .ou.edu), dan Lembaga Penelitian Genomik (http: //www.tigr.org). 
Prosedur  transformasi  DNA.  Serogroup Strain meningokokus F8229 diubah oleh transformasi semiquantitative dari Janik et al. 
(18). Transformasi kimia E. coli dilakukan dengan metode yang dijelaskan oleh Chung et al. (6). 
Hibridisasi  DNA  Selatan.  Kami  menggunakan  sistem  pendeteksi  DNA  Genius  nonradioactive  dan  pendeteksian  (Boehringer 
Mannheim,  Indianapolis,  Ind.).  Pemeriksaan  DNA  spesifik  diamplifikasi  PCR,  diberi  label  dengan  digoxigenin,  dan  digunakan 
untuk menyelidiki 
. 
1534 SWARTLEY ET AL. J. B 
ACTERIOL 
TABLE 1. Oligonucleotide primer yang digunakan dalam penelitian ini 
Primer Nucleotide sequence (5 33) 
LJ4 ............................. ........... CCACCACCAATACTGCCG SE26 ..................................... 
.GCGTTTAACAAGCGTTCTAAGCC SE33 ...................................... GTCAACTCAGAAGATAAGAATTGG SE40 ....... 
............................... GAATAGCACTACATGCACTTCCC SE41 ................. ..................... CAGGGCGAGTGCCAAAGACG 
SE46 ........................... ........... GAAGCTGTAGCTGCAGGAACTG SE56 ..................................... 
.AATCATTCAATATCTTCACAGCC SE57 ...................................... TTACCTGAATTTGAGTTGAATGGC SE61 ....... 
............................... CAAAGGAAGTTACTGTTGTCTGC SE63 ................. ..................... 
TTCATATAACTTGCGGAAAAGATG JS102 ........................... .......... GAGCCTATTCGAAATCAAAGCTG JS103 
..................................... AGATACCATTAGTGCATCTATGAC JS104 ..................................... 
CATGAAACTCAGCACAGATAGAAC JS105 .......... ....................... .... GTTATTTAAATCTAGCCATGCTGG GalE1 
.................................... CGTGGCAGGATATTGATGCTGG 
Southern DNA blots (35) di bawah kondisi ketat-tinggi sesuai dengan protokol pabrikan. 
Polaresis  sisipan  polar dan nonpolar. Polar mutagenesis dari gen yang ditentukan dilakukan dengan memasukkan resistansi pita 
-spektinomisin  yang  berasal  dari  pHP45.  Brieffy,  wilayah  genetik  yang  akan  terganggu  diamplifikasi  oleh  PCR  dari  DNA 
kromosom  dan  kemudian  dikloning  ke  E. coli InvF. Plasmid yang mengandung produk PCR kloning kemudian dilinierisasi pada 
tempat  yang  unik,  situs  pembatasan  tumpul  yang  ada  di  insert.  Sebuah  fragmen  SmaI  tumpul  berasal  dari  pHP45,  yang 
mengandung  seluruh  kaset  resit-spektinomisin,  kemudian  diligasi  ke  dalam  produk  hasil  kloning  dan  diubah  menjadi  E.  coli 
dengan  seleksi  untuk  resistensi  spectinomisin.  Transformatif  putatif  diperiksa  oleh  PCR koloni untuk mengkonfirmasi perakitan 
konstruk  yang  sesuai.  DNA  plasmid  disiapkan  dari  koloni  yang  dikonfirmasi  dan  digunakan  untuk mengubah serogrup A strain 
F8229  dengan  seleksi  untuk  resistensi  spectinomycin.  Transformasi  meningokokus  putatif  diperiksa  oleh  PCR  koloni  dan 
hibridisasi  DNA  Selatan  untuk  mengkonfirmasi  akuisisi  dari  mutasi  polar  -insertion  oleh  rekombinasi  homolog.  Primer  JS102 
dan  JS103  (Tabel  1)  digunakan  untuk  memperkuat  fragmen  PCR 600-bp dari ujung 5 F8229 open reading frame 1 (ORF1) yang 
kemudian  dikloning  dalam  E.  coli.  Produk  ini  berisi  situs  pembatasan  StuI  yang  unik  yang  terletak 356 bp hilir dari kodon start 
ORF1  yang  diprediksi.  Sebuah  fragmen  SmaI  dari  pHP45,  pengkodean  kaset  resistensi  -spectinomycin,  dimasukkan  ke  dalam 
situs  StuI  yang  unik,  dan  plasmid  rekombinan  yang  dihasilkan  digunakan  untuk  mentransmisikan  wild-type  serogrup  A  strain 
F8229.  Transformator  yang  resisten-Spectinomycin  dipilih,  dan  akuisisi  -insertion  dikonfirmasi  oleh PCR koloni dan hibridisasi 
Selatan. 
Pendekatan  yang  sama  digunakan  untuk  memperkenalkan  kaset  resistensi  -spectinomycin  ke  ORF2, ORF3, dan ORF4. Untuk 
menonaktifkan  ORF2,  fragmen  DNA  451-bp  yang  berasal  dari  ORF2  adalah  PCR  yang  diamplifikasi  dari  strain  F8229 dengan 
primer  JS104  dan  JS105  (Tabel  1).  Sebuah  -fragment  dimasukkan  ke  dalam  situs  HincII  unik  hadir dalam produk PCR kloning 
(terletak  729  bp  dari  kodon  putatif  ORF2  putatif),  dan  plasmid  yang  dihasilkan  diubah  menjadi  strain  F8229.  Primer SE57 dan 
SE61  (Tabel  1)  digunakan  untuk  memperkuat  produk  858-bp  dari  ORF3,  berisi  situs  SspI unik yang terletak 507 bp hilir kodon 
start  ORF3.  Sekali  lagi,  sebuah  -fragment  dimasukkan  ke  situs  kloning  ini,  dan  struct  diubah menjadi F8229. Akhirnya, produk 
765-bp  diamplifikasi  dari ORF4 dengan primer SE63 dan SE56 (Tabel 1). Situs kloning SspI yang unik dalam produk ini terletak 
159  bp  dari  kodon  putatif  ORF4  yang  diduga.  Sebuah  -fragment  dimasukkan  ke  dalam  situs  kloning, dan konstruksinya diubah 
menjadi F8229. 
Mutan  nonpolar  diciptakan  oleh  teknik  pertukaran  alelik  yang  dijelaskan  di  atas;  Namun, bukannya polar -fragment, nonpolar 
aphA-3  kanamycin  resistance  cassette  yang  berasal  dari  pUC18K  (27)  dimasukkan  ke  dalam  wilayah  genetik  untuk  bermutasi. 
Orientasi  penyisipan  aphA-3  diperiksa  oleh  PCR  koloni  dan  sekuensing  DNA  langsung  dari  produk  untuk  memastikan  bahwa 
situs awal ATG pada akhir kaset berada dalam bingkai ke urutan hilir. 
Seleksi  serum  untuk  pengembalian  kapsul.  Strain  F8229-43  terpapar  dengan  serum  manusia  normal  (NHS)  untuk  menyaring 
reaktan  kapsul  serogrup  B.  100%  aliquot  yang  mengandung  25%  NHS  dan  3,75  104  meningokokus,  diencerkan  dalam  media 
esensial  HEPES-minimal,  diinkubasi  pada  37  °  C  selama  30  menit.  Seluruh  alikuot  kemudian  disepuh  pada  lempeng  agar  GC 
yang  mengandung  5  g  tetrasiklin  /  ml,  dan  yang  selamat  (mis.,  Pengganti  kapsul  putatif)  dikumpulkan  setelah  pertumbuhan 
semalam.  Revertants  dipelajari  untuk  fenotipe  kapsul  serogrup-spesifik  dengan  menggunakan  immunoblots  koloni  dan  uji 
immunosorbent enzyme-linked enzyme-linked (ELISA), seperti dijelaskan di bawah ini. 
Kuantisasi  kapsul  oleh  imunoblot  koloni  dan  ELISA  seluruh  sel.  Immunoblots  koloni  dilakukan  seperti  yang  dijelaskan 
sebelumnya  (36)  dengan  menggunakan  antibodi  monoklonal  anti-serogrup  A  14-1-A  (45)  (yang  diberikan  secara  murah  oleh 
Wendell  Zollinger,  Institut Penelitian Tentara Walter Reed). ELISA sel seluruh dilakukan dengan metode Abdillahi dan Poolman 
(1).  Brieffy,  strain yang akan diuji ditanam semalam di piring agar GC. Pertumbuhan plat kemudian dipelihara dan disuspensikan 
dalam  5  ml  salin  fosfat-buffered  yang  mengandung  0,02%  natrium  azida  (Sigma Chemical Co.). Sel-sel panas yang diinaktivasi 
pada 56 ° C selama 30 menit, 1 minggu kemudian. disesuaikan Untuk melakukan ke A 
650 
ELISA, 0,1 100 dan disimpan pada 4 ° C untuk digunakan dalam tes l dari suspensi sel ditambahkan ke piring microtiter 
ffat-bottom (Maxi-sorp atau Poly-sorp [Nalge Nunc Interna - tional, Naperville, Ill.]) dan menguap semalam pada 33 ° C. Plat 
kemudian dicuci tiga kali dengan larutan Tween 80 (Sigma Chemical Co.) 0,05% dalam air steril. Seratus mikroliter antibodi 
monoklonal 14-1-A (diencerkan 1: 30.000 dalam salin fosfat-buffered mengandung 0,01% Tween 80 dan 0,3% Asam Casamino 
[Difco Laboratories]) ditambahkan ke masing-masing dengan baik, dan pelat diinkubasi pada 33 ° C selama 1 jam. Setelah tiga 
kali pencucian, 100 l antibodi anti-tikus imunoglobulin A (IgA), IgG, dan IgM antibodi fosfatase-terkonjugasi (ICN 
Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, Calif.) Ditambahkan (diencerkan 1: 10.000 dalam di atas buffer), dan pelat diinkubasi selama 
90 menit pada 33 ° C. Piring dicuci tiga kali, 200 l substrat (1 mg p-nitrophenyl fosfat [Sigma Chemical Co.] dilarutkan per ml 
0,5 M diethanolamine buffer yang mengandung 0,5 suhu mM MgCl 
selama 2 
[pH 9,8]) ditambahkan, dan piring dibiarkan berdiri di kamar 20 hingga 45 menit. Reaksi dihentikan oleh penambahan 50 l 
(Winooski, 3 N NaOH, Vt.) Dan model A 
EL 405 
312e masing-masing Sumur Otomatis dibaca Plate with Reader. Nilai rata-rata Instrumen BIO-TEK adalah rata-rata dari 3 hingga 
10 nilai densitas optik untuk standar devisa sumur individu (SD). 
 
Nomor  aksesi  nukleotida.  Urutan  nukleotida  dan  terjemahan  asam  amino  pra-didikte  dijelaskan  dalam  artikel  ini  telah 
disampaikan kepada GenBank dan tersedia di bawah aksesi no. AF019760. 
HASIL 
Serogrup  Urutan  nukleotida  ctrA-to-galE.  Urutan  nukleotida  yang  mencakup  wilayah  antara  ctrA  dan  galE  dalam  serogrup 
yang  dienkapsulasi.  Strain  meningokokus  F8229  ditentukan  oleh  kombinasi  PCR  standar  dan  SSP-PCR.  Primer  LJ4,  yang 
anneals  ke  urutan  pelengkap  ke  5  akhir  cTRA,  dan  primer  SE26,  yang  anil  untuk  urutan  hulu  ctrA  (Tabel  1;  Gambar.  1), 
digunakan  untuk  "kromosom berjalan" 2,2 kb hulu dari cTRA di saring F8229 oleh SSP-PCR. Urutan yang diperoleh dari produk 
ini  digunakan  untuk  membangun  primer  SE33,  yang  dirancang  untuk anneal ke 3 akhir wilayah 2.2-kb. Primer SE33 dan primer 
GalE1,  dirancang  untuk  anneal  ke  urutan  pelengkap  ke  5  akhir  galE,  digunakan  untuk PCR memperkuat tambahan 2,5 kb DNA 
memisahkan  ctrA  dan  galE.  Urutan  double-stranded  dari  4,701-bp  stretch  memisahkan  ctrA  dari  galE  di  serogrup  A  N. 
meningitidis  ditentukan  dari  produk-produk  ini  dengan  kombinasi  metode  sekuensing  DNA  manual  dan  otomatis.  Urutan 
selanjutnya dikonfirmasi oleh analisis produk PCR yang tumpang tindih (Gambar 1). 
Analisis  komputer  dari  urutan  4.7-kb  menunjukkan  adanya  empat  ORF  yang  ditranskripsi  dalam  orientasi  yang  berlawanan 
dari  ctrA  (Gambar  1).  ORF  pertama  (ORF1)  dipisahkan  dari  cTRA  oleh  wilayah  intergenik  218-bp.  ORF1  adalah  1.119 
nukleatide  dan  diprediksi  untuk  menyandi  asam  372-amino  (aa).  ORF1  dipisahkan  oleh  sepasang basa tunggal dari ORF kedua, 
yang  ditunjuk  ORF2,  yang  1.638  bp dan diperkirakan untuk menyandikan protein 545-aa. ORF2 pada gilirannya dipisahkan oleh 
72  bp  dari  ORF3  744-bp,  yang  ditunjuk  ORF3,  diprediksi  untuk  menyandikan  247-aa protein. Akhirnya, ORF3 dipisahkan oleh 
nukleotida tunggal dari ORF4 864-bp, yang ditunjuk ORF4, yang diprediksi untuk menyandikan protein 287-aa. 
Selain  urutan  yang  berasal  dari  strain  wild-type  yang  dienkapsulasi  F8229,  kami  juga  mengurutkan  2.330  bp  pertama  dari 
daerah  antara ctrA dan galE dalam sero-grup A varian strain F8239 yang tidak terkapsulasi. Perbandingan urutan nukleotida yang 
berasal  dari  F8239  dan  F8229  menunjukkan  bahwa  mereka  hampir  identik  (11  perbedaan  nukleotida  [7  penghapusan  atau 
penambahan,  2  transversi,  dan  2  transisi])  di  atas seluruh bentangan 2.2-kb. Namun, dalam strain F8239, ORF1 diprediksi hanya 
744  nukleotida  (pengkodean  247-aa  diprediksi  protein).  Komputerisasi  keselarasan  terjemahan  asam  amino  putatif  dari  F8239 
dan F8229 ORF urutan menunjukkan 
V 
OL 
. 180, 1998 DASAR GENETIKA SEROGROUP A MENINGOKOCCAL KAPSUL 1535 
Gambar.  1.  Organisasi  genetik  dari  wilayah  4.7-kb  yang  memisahkan  ctrA  dan  galE  dalam  serogrup  Sebuah  regangan 
meningokokus  F8229.  Panah  terbuka,  ditarik  ke  skala,  mewakili  lokasi  dan  orientasi  ORF1  ke  -4.  Panah  terbuka  bertitik 
menunjukkan  gen  ffanking  ctrA  dan  galE  saja,  bagian  yang  ditampilkan.  Buka  segitiga  menunjuk  ke  lokasi  mutasi  penyisipan 
yang dibuat dalam ORF1 ke ORF4 (lihat teks). Lokasi primer (Tabel 1) ditunjukkan oleh panah padat. 
bahwa pada F8239, ORF1 dipotong secara prematur oleh mutasi frame-shift. 
Analisis  serogrup  A  ORFs  ctrA-to-galE.  Nukleotida  dan  prediksi  urutan  asam  amino  dari ORFs diduga dibandingkan dengan 
GenBank  /  EMBL  dan  database  proyek  genom  lainnya,  termasuk  database  genom  gonokokal  FA1090  (lihat Bahan dan Metode 
untuk  alamat Internet). Produk ORF1 menunjukkan homologi (57,8% identitas asam amino dan 73,9% kesamaan) dengan protein 
sitoplasma E. coli yang ditunjuk NfrC. Gen nfrC 1,131-bp mengkodekan protein 377-aa yang diprediksi menjadi UDP-N- 
D- 
acetyl-glukosamin 2-epimerase (21). ORF2 menunjukkan nukleotida dan prediksi histologi asam amino dengan tiga ORF 
terpisah dari fungsi yang tidak diketahui, 1,632-bp cpsY dari Mycobacterium leprae (30,6% identitas dan 51,7% kesamaan) 
(GenBank / EMBL aksesi no. U15182), ORF serupa di Mycobacterium tuberculosis genome, dan 1,125-bp ORF (ORF5) 
menemukan hilir galE / rfbBCD di serogrup B N. meningitidis (GenBank / EMBL aksesi no. L09188) (16). ORF3 tidak 
menunjukkan nukleotida atau prediksi homologi protein dengan gen atau protein yang saat ini ada dalam database. ORF4 
memamerkan homologi jauh dengan protein XcpS dari Pseudomonas putida (19,4% identitas lebih dari 129-aa tumpang tindih 
[GenBank / EMBL aksesi no. X81085] [10]) dan muncul untuk berbagi motif asam amino (aa 123 hingga 168) dengan presenilin 
(8) kelas protein eukariotik. Kecuali untuk histologi ORF2 dengan ORF5 yang tidak diketahui dalam serogrup B N. meningitidis, 
ORF1 ke -4 tidak ditemukan dalam genom dari serogroup meningokokus lainnya atau Neisseria gonorrhoeae oleh pencarian 
database atau Southern hybridizations (data tidak ditampilkan). ORF1 hingga -4 ditranskripsi sebagai operon. Untuk menentukan 
apakah ORF1 ke ORF4 diatur sebagai operon, kami melakukan percobaan RT-PCR pada RNA sel utuh yang diperoleh dari strain 
F8229. Hasilnya, ditunjukkan pada Gambar. 2, menunjukkan bahwa ORF1 ke ORF4 adalah cotranscribed pada pesan mRNA 
yang sama. Situs awal transkripsi ORF1 hingga ORF4 operon, sebagaimana didefinisikan oleh ekstensi primer (Gambar 3), 
terletak di dalam wilayah intergenik 218-bp memisahkan ctrA dan ORF1 (Gambar 4). Situs awal transkripsional ini didahului 
oleh urutan promotor -70 khas (17). 35 wilayah promotor ORF1, TTTATT, memiliki tiga dari enam pertandingan dengan 
konsensus -70 35 urutan pengikatan promotor dan 18 bp dari 10 wilayah (kotak Pribumi) urutan, TATATT. Serogroup A ctrA 
transcriptional start site juga hadir di wilayah intergenik 218-bp, seperti yang ditunjukkan oleh ekstensi primer (Gambar 4). 
Promotor serogrup A ctrA tumpang tindih promotor ORF1 pada untaian DNA komplementer. Namun demikian, 
 
 35 wilayah promotor cTRA, TTGTGT, memiliki sedikit perubahan pada urutan pengusutan -70 konsensus 35 promotor. Mutasi 
ORF1 ke ORF4. Untuk mengkonfirmasi peran ORF1 ke ORF4 dalam ekspresi kapsul A, kami menciptakan mutasi insersi di 
masing-masing ORFs dalam strain encapsullated tipe liar F8229 (Gambar 1). Strain F8229-ORF1, F8229- ORF2, F8229-ORF3, 
dan F8229-ORF4 diciptakan oleh -spectinomycin insersional mutagenesis dari masing-masing ORFs. PCR dan Southern 
hybridizations (data tidak ditampilkan) mengkonfirmasi penyisipan yang benar dari fragmen -spectinomycin di masing-masing 
mutan (Gambar 1). Immunoblots, ditunjukkan pada Gambar. 5, menunjukkan bahwa polar mutagenesis dari keempat ORF pada 
strain wild type F8229 menghasilkan pengurangan atau kehilangan enkapsulasi. Data ini dikonfirmasi oleh ELISA seluruh sel 
kapsul kuantitatif di mana strain encapsulated tipe liar F8229 [mean adalah SD]). digunakan sebagai Strain 100% F8239, standar 
F8229-ORF1 (A 
405 
0,939 0,16, dan F8229- ORF2 menunjukkan pengurangan 100% versus pengurangan strain wild type Kami (A 
juga 450 
(A 
mencoba 450 
0), sementara 0,101 hingga F8229 -ORF4 membuat 0,007), 
nonpolar menunjukkan gangguan 89% ORF1 dan ORF2 dengan mengintegrasikan kaset aphA-3 ke dalam situs unik yang sama 
yang digunakan untuk mutagenesis-karkas, tetapi, meskipun berulang kali mencoba, kami mampu mengintegrasikan fragmen ini. 
hanya ke ORF2, menghasilkan F8229-ORF2aphA-3. Seperti mutan polar -spektinomisin, gangguan nonpolar ORF2 juga 
mengakibatkan hilangnya lengkap ekspresi kelompok A kapsul, seperti yang ditunjukkan oleh ELISA sel keseluruhan.Untuk 
lebih lanjut mengkonfirmasi 
Gambar 2. RT-PCR mRNA disiapkan dari serogrup tipe liar A strain F8229 untuk mendeteksi ORF1 untuk ORF4 polycistronic 
transcript  Primer  SE56  (Tabel  1;  Gambar  1), yang melengkapi 3 ujung ORF4, digunakan sebagai perpanjangan RT primer untuk 
menghasilkan  cDNA  dalam  reaksi  RT  [RT  ()].  ​Kontrol  tanpa  RT  a  dded  [RT  ()]  termasuk  dalam  kondisi  yang  identik.  Primer 
SE46 dan SE61 digunakan untuk amplifikasi PCR sekitar 2,8-kb ORF1-to-ORF4 produk. Jalur 1, tangga 1-kb (Gibco-BRL); jalur 
2,  kontrol  positif  menggunakan  DNA  kromosom  F8229  sebagai  template;  jalur 3, hasil PCR menggunakan template RT (); jalur 
4, kontrol negatif menggunakan template RT (). Standar ukuran DNA (dalam pasangan basa) ditunjukkan. 
1536 SWARTLEY ET AL. J. B 
ACTERIOL 
fungsi  kaset  ini  dalam  produksi  kapsul  A  serogrup,  kami  memperbaiki  mutasi  F8229-ORF1  dengan  produk  PCR  4.7-kb  yang 
dihasilkan  oleh  primer  SE40  dan  GalE1.  Transforman  yang  diberi kapsul dipilih oleh kelangsungan hidup dalam 25% NHS, dan 
ekspresi  serogroup  kapsul  A  dikonfirmasi  oleh  imunoblot  koloni.  Perbaikan  mutasi  ORF1  pada  transduser  ini  selanjutnya 
dikonfirmasi oleh PCR dengan primer JS102 dan JS103. 
Penggantian kapsul. Kami mencoba untuk menentukan apakah penempatan kaset kaset ctrA-galE dalam serogrup A strain 
F8229 dengan kaset serogrup B cukup untuk mengganti ekspresi kapsul. DNA kromosom dari serotipe B Tn916 strain mutan 
meningokokus 43 (37) telah dipersiapkan dan digunakan untuk mengubah serogrup encapsulated A strain F8229. Strain 43 berisi 
penyisipan Tn916 kelas I "utuh" dalam gen polimerase kapsul sintetik dari kaset gen biosintetik gen kelompok B. Transformasi 
resisten tetrasiklin dari strain F8229 diperoleh pada frekuensi 1 10 7. Transforman diperiksa oleh imunoblot koloni untuk 
kehilangan serogrup produksi kapsul A, dan satu mutan unencap- sulated, yang ditunjuk F8229-43, disimpan untuk lebih lanjut. 
analisis. Strain F8229-43 disaring oleh bagian melalui NHS 25% untuk mengidentifikasi pengembalian kapsul yang dihasilkan 
dari eksisi yang tepat dari penyisipan Tn916 dari synD (diprediksi terjadi pada frekuensi 10 4), menghasilkan pemulihan produksi 
kapsul dan resistensi serum. Seekor penyintas serum, yang dirancang F8229-43R, diuji oleh imunoblot koloni menggunakan 
antibodi anti-serogrup A dan anti-serogrup B monoklonal. Strain F8229-43R tidak lagi mengekspresikan kapsul serogrup A, 
tetapi malah menyatakan polisakarida serogrup B kapsular. PCR menegaskan bahwa strain F8229-43R tidak mengandung gen 
serogrup A gen biosintetik tetapi menyimpan kaset serogrup B utuh (data tidak ditampilkan). 
PEMBAHASAN 
 Biosintesis  dari  kapsul  serogrup  A  N.  meningi-  tidis  membutuhkan  gen  yang  tidak  ditemukan  pada  serogrup  meningokokus 
lainnya.  Namun,  keseluruhan  organisasi  genomik  dari  transport  dan  biosintesis  kapsul  serogrup  A-ningococci  dan  asam  serin 
yang mengandung asam sialat 
.  3.  Autoradiograf  yang  menunjukkan  produk  ekstensi  primer  untuk  sero-  grup  A  gen  meningokokus  ctrA  dan ORF1. Reaksi 
ekstensi  primer  dimuat  bersama  dengan  reaksi  double-stranded  DNA-sequencing  standar  (orientasi  beban  G,  A,  T,  C)  yang 
diperoleh  dengan  sekuensing  template  DNA  kontrol  ctrA  dan  ORF1  dengan  ekstensi  primer  SE40  (ctrA)  dan  SE41  (ORF1). 
Urutan  DNA  di  sekitar  pita  ekstensi  primer  telah  diperluas.  Nukleotida  yang  sesuai  dengan  titik  awal  transkripsi  diduga 
dilingkari. 
. 
 
kelompok  (B,  C,  Y,  dan  W-135)  serupa.  Dalam  semua  serogrup,  gen  dari  operon  transpor  kapsul  trans  didahului  oleh  daerah 
intergenik  yang  memisahkan  operon  ini  dari  operon  berbeda  yang  diperlukan  untuk  biosintesis  kapsul.  Para  operon  biosintetik 
kapsul  adalah  kaset  genetik yang berbeda yang terletak antara ctrA dan galE yang menyandikan UDP-glukosa-4- epimerase yang 
terlibat dalam biosintesis lipooligosakarida (24). 
Berdasarkan  data  yang  disajikan  di  sini,  penelitian  sebelumnya  dari  kaset  biosintetik  serogrup  B,  C,  Y,  dan  W-135 (38), dan 
pengamatan  epidemiologi,  kaset  gen  biosintetik  meningokokus  dapat  mengalami  pertukaran  rekombinan  yang  menghasilkan 
perpindahan  kapsul.  Mekanisme  genetik  di  mana  pertukaran  kaset  terjadi  tidak  didefinisikan  tetapi  mungkin  hasil  rekombinasi 
homolog  antara  daerah  identik  di  operon  ctr  dan  galE.  Penggantian  kaset  kapsul  dan,  mungkin,  dari  gen  yang  berdekatan 
(misalnya,  ctrA)  tampaknya  cukup untuk beralih kapsul di N. meningitidis. E. coli, Streptococcus pneumoniae, dan Haemophilus 
influenzae  juga  mengandung  kaset  gen  kapsul  jenis-spesifik  yang  dapat  ditransfer  oleh  transformasi  dan  rekombinasi  kejadian, 
yang menghasilkan peralihan dari tipe kapsul yang dinyatakan (5, 7, 20, 22). 
Dalam  serogrup  meningokokus  B,  C,  Y,  dan  W-135, daerah inter-genic memisahkan ctrA dari operon biosintesis (synA ke -D 
[E,  F,  G]) adalah 134 bp dan mengandung ctrA ke -D promotor, sinX divergen menjadi -D (E, F, G) biosintesis promotor operon, 
dan  elemen  regulasi  transkripsional  lainnya  (37,  38).  The  218-bp  intergenic  wilayah  serogrup  A  N. meningitidis tidak memiliki 
homologi  dengan  wilayah  134-bp  ditemukan  di  serogroup  kapsik  asam  sialat.  Namun,  kedua  daerah  intergenik  mengandung 
promotor  tumpang  tindih  yang  memulai  transkripsi  operon  transportasi  kapsul  dan  operon  biosintetik  yang  berbeda, 
menunjukkan  bahwa  enkapsulasi  semua  serogrup  mungkin  diatur  secara  terkendali  melalui  kontrol  transkripsi  promotor  yang 
terletak di daerah intergenik. Baik serogrup A dan biosintetik asam sialic 
V 
OL 
. 180, 1998 DASAR GENETIKA SEROGROUP A KASUS MENINGOKOCCAL 1537 
Gambar. 4. Urutan nukleotida dari wilayah intergenik 218-bp yang memisahkan kodon start untuk serogrup A ctrA dan ORF1 
loci. Titik awal dan arah transkripsi sebagai putative dari Shine-Dalgarno ORF1 dan ctrA ribosom mRNA mengikat adalah situs 
yang ditunjukkan (RBS). oleh The t 
i 
dan panah, masing-masing. Predicted 10 and 35 promoter predicted initiation codons for ctrA and ORF1 are binding sequences 
are indicated, as well 
shown in boxes. 
operon  promoters  (37)  resemble  -70  promoters  and  thus  may  be  constitutively  transcribed.  However,  the  ctrA  promoters  are 
different, do not resemble -70 promoters, and may require activators. 
For  N.  meningitidis  producing sialic acid-containing cap- sules, the first three genes of the biosynthetic cassette, synA, -B, and 
-C, convert N-acetyl- 
D 
-glucosamine-6-phosphate  (GlcNAc-  6-P)  into  CMP-N-acetylneuraminic  acid.  The  fourth  gene, 
synD  (E,  F,  G),  is  the  distinct  capsule  polymerase  which  links  the  capsule  sugar  monomers  together, thereby defining the sero- 
group  (38).  In  the  serogroup  A  N.  meningitidis biosynthetic cassette, ORF1 has significant homology with the E. coli gene nfrC, 
which  encodes a cytoplasmic protein required for bacte- riophage N4 adsorption (21), and with rffE (o389) (23), which encodes a 
UDP-N-acetyl- 
D 
-glucosamine 2-epimerase responsi- ble for converting UDP-N-acetyl- 
D 
-glucosamine (UDP-GlcNAc) into UDP-N-acetyl- 
D 
-mannosamine  (UDP-ManNAc).  Imme-  diately  downstream  of  rffE  in  E.  coli  is  rffD  (o379),  which  en- 
codes a UDP-N-acetyl- 
D 
-mannosamine  dehydrogenase  (9,  25).  Both  rffE  and  rffD  are  required  for  the  biosynthesis  of  the 
enterobacterial  common  antigen,  a  tricyclic,  polysaccha-  ride  structure  present  on  the  cell  surfaces  of  most  entero-  bacterial 
species  (23).  ORF1  also  has  amino  acid  homology  with  other  UDP-GlcNAc  2-epimerases  from  H.  influenzae  (13) and humans 
(GenBank/EMBL  accession  no.  AA210747).  Thus,  ORF1  likely  encodes  the  epimerase  which  converts  UDP-  GlcNAc  to 
UDP-ManNAc. 
UDP-ManNAc,  in  addition  to  its  role  in  enterobacterial  common  antigen  biosynthesis  in  gram-negative  species  (23),  is  a 
common  biosynthetic  precursor  in the formation of several cell wall structures in gram-positive organisms such as Micro- coccus 
luteus  (19)  and  numerous  Bacillus  species  (44),  includ-  ing  Bacillus  pumilus  (41).  Thus,  in  contrast  to  the  sialic  acid  capsule 
pathway, which utilizes GlcNAc-6-P (40), the sero- group A capsule biosynthetic pathway utilizes UDP-GlcNAc 
 
as  the  starting  substrate.  Interestingly,  the  first  genes  of  all  meningococcal  capsule  biosynthetic  gene  cassettes  encode 
2-epimerases converting either UDP-GlcNAc or GlcNAc-6-P to UDP-ManNAc or N-acetyl- 
D 
-mannosamine-6-phosphate, respectively. 
ORF2  has  the  greatest  amount  of  homology  with  a  pair  of  uncharacterized  mycobacterial  genes,  in  terms  of both amino acid 
identity  and  protein  length,  and  with another gene of un- known function, designated ORF5, that has been identified downstream 
of  galE  and rfbBCD in serogroup B meningococci (16). The homology of ORF2 with the mycobacterial gene products and ORF5 
is  concentrated  towards  the  C  termini  of  the  predicted  proteins.  We  hypothesize  that  ORF2  may  be  the  polymerase  linking 
individual  UDP-ManNAc  monomers  to-  gether.  This  is  likely  to  occur  through  the  release of UMP from UDP-ManNAc, which 
provides  the  requisite  energy  for  the  creation  of  a  phosphodiester  bond  between  the  1  and 6 posi- tions of individual monomers 
(26).  The  large  size  of  the  ORF2  gene  may  support  this  proposed  function.  In  the  sialic  acid-  producing  serogroups,  the  ORFs 
encoding the capsule polymer- ases are significantly larger than the other biosynthetic genes (38). 
Polar  and  nonpolar  insertional mutagenesis of ORF1-4 demonstrated that each of these genes is involved in the pro- duction of 
the  serogroup  A  capsule.  However,  the  functions  of  ORF3  and  ORF4  are  unclear.  ORF3  does  not  have  homology  with  other 
genes  or  predicted  proteins  in the computerized nucleotide and amino acid databases but is transcribed as part of the serogroup A 
biosynthetic  cassette  operon.  In  studies of the composition and chemical properties of the group A cap- sule, Liu et al. (26) noted 
that the polysaccharide was not completely N-acetylated and that the 136 phosphodiester 
. 
1538 SWARTLEY ET AL. J. B 
ACTERIOL 
bond  was  not  the  only  linkage  present.  Cross-linking  of the polysaccharide chains was predicted from their analyses. ORF3 may 
be involved in these modifications to the serogroup A polysaccharide. 
ORF4  demonstrated  distant  homology  with  the  XcpS  pro-  tein  of  Pseudomonas  aeruginosa  (4) and P. putida (10). ORF4 also 
exhibited  homology  with  a  46-aa  motif  shared  by  members  of  the presenilin class of eukaryotic proteins (8). Presenilins contain 
multiple  transmembrane  domains  and  are  thought to be involved in sensory transduction or in the formation of ion channels. The 
46-aa  presenilin  motif  found  in  ORF4  is  thought  to  contain  two  transmembrane  domains  separated  by  a  hydro-  philic  loop (8). 
Interestingly,  the insertion mutation affecting ORF4 resulted in only an 89% reduction in serogroup capsule production compared 
with  the  complete  abrogation  seen  with  interruptions  of  the  other  ORFs. This suggests that ORF4 is not directly required for the 
biosynthesis of the ( 136)-linked N-acetyl- 
D 
-mannosamine-1-phosphate  polymers.  Consider-  ing  the  homology  to membrane-associated proteins, the ORF4 gene 
product  may  be  involved  in  membrane  transport,  assem-  bly, or cross-linking of the serogroup A capsule to the menin- gococcal 
cell surface. 
In  summary,  an  operon  of  four  genes,  ORF1  to  -4,  located  between  ctrA  and  galE  in  the  serogroup  A  N.  meningitidis  ge- 
nome, is required for the production of serogroup A ( 136)- linked N-acetyl- 
D 
-mannosamine-1-phosphate  capsule.  We  pro-  pose  that  ORF1  to  ORF4  be  designated  mynA,  mynB,  mynC, 
and  mynD  (for  mannosamine  capsule  biosynthesis  genes),  re-  spectively.  The  first  biosynthetic  step in the pathway is likely the 
production  of  UDP-ManNAc  from  UDP-GlcNAc,  a  func-  tion  that is likely performed by the gene product of mynA. The mynB 
gene  may  encode  the  (  136)  UDP-ManNAc  polymer-  ase,  and  mynC  and  mynD  may  be  involved  in  further  modifi- cation and 
assembly of the serogroup A capsule. 
The  data  also  support  the  model  that  meningococcal  capsu-  lar  serogroups  are  determined  by  specific  biosynthesis  genetic 
cassettes  that  insert  between  the  ctrA  operon  and  galE.  We  have  previously  shown  (38)  that the cassettes determining the sialic 
acid  serogroups  can  recombine  to  switch  the  type  of  capsule  expressed.  In  this  report  we  have  shown  that  the  sero-  group  A 
capsule  can  be  switched  by  a  similar  recombinational  exchange  of  biosynthetic  cassettes.  Our  data  should  prove  use-  ful in the 
design  of  improved  meningococcal  vaccines,  in  de-  velopment  of  rapid  diagnostic  approaches  for  the  detection  of  serogroup A 
disease, and for understanding of the molecular basis of serogroup A meningococcal pathogenesis. 
ACKNOWLEDGMENTS 
We thank Lane Pucko for manuscript preparation. This work was supported by National Institutes of Health R01 grant 
(AI40247-01). 
REFERENCES 1. Abdillahi, H., and JT Poolman. 1987. Whole-cell ELISA for typing Neis- seria 
meningitidis with monoclonal antibodies. FEMS Microbiol. Lett. 48: 367–371. 2. Achtman, M. 1990. Molecular epidemiology of 
epidemic bacterial meningi- 
tis. Pdt. Med. Mikrobiol. 1:29–38. 3. Baker, RF, and C. Yanofsky. 1968. Periodicity of RNA polymerase initia- tions: a new 
regulatory feature of transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:313–320. 4. Bally, M., A. Filloux, M. Akrim, G. Ball, A. 
Lazdunski, and J. Tommassen. 1992. Protein secretion in Pseudomonas aeruginosa: characterization of seven xcp genes and 
processing of secretory apparatus components by prepilin peptidase. Mol. Mikrobiol. 6:1121–1131. 5. Boulnois, GJ, and K. Jann. 
1989. Bacterial polysaccharide capsule synthe- sis, export and evolution of structural diversity. Mol. Mikrobiol. 3:1819–1823. 6. 
Chung, CT, SL Niemala, and RH Miller. 1989. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of 
bacterial cells in 
FIG.  5.  Colony  immunoblots  of  wild-type  serogroup  A  meningococcal  strain  FA8229,  its  ORF1  to  -4  mutants,  and 
unencapsulated  variant  F8239.  Strains  were  grown  overnight  on  GC  base  agar,  transferred  to  nitrocellulose,  and  probed  with 
anti-serogroup  A monoclonal antibody 14-1-A (45). (A) Wild-type encapsulated strain F8229; (B) unencapsulated variant F8239; 
(C) F8229-ORF1 ; (D) F8229- ORF2 ; (E) F8229-ORF2aphA-3; (F) F8229-ORF3 ; (G) F8229-ORF4 . 
 
the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2172–2175. 7. Coffey, TJ, CG Dowson, M. Daniels, J. Zhou, C. Martin, BG 
Spratt, and JM Musser. 1991. Horizontal transfer of multiple penicillin-binding pro- tein genes and capsular biosynthetic genes in 
natural populations of Strep- tococcus pneumoniae. Mol. Mikrobiol. 5:2255–2260. 8. Cruts, M., L. Hendriks, and C. 
VanBroeckhoven. 1996. The presenilin genes: a new gene family involved in Alzheimer disease pathology. Bersenandung. Mol. 
Genet. 5:1449–1455. 9. Daniels, DS, G. Plunkett III, V. Burland, and FR Blattner. 1992. Analysis of the Escherichia coli 
genome: DNA sequence of the region from 84.5 to 86.5 minutes. Science 257:771–778. 10. deGroot, A., JJ Krijger, A. Filloux, 
and J. Tommassen. 1996. Character- ization of type II protein secretion (xcp) genes in the plant growth-stimulat- ing 
Pseudomonas putida, strain WCS 358. Mol. Gen. Genet. 250:491–504. 11. Devereaux, J., P. Haeberli, and O. Smithies. 1984. A 
comprehensive set of 
sequence analysis programs for the VAX. Asam Nukleat Res. 12:387–395. 12. DiLella, AG, and SLC Woo. 1987. Cloning 
large segments of genomic 
DNA using cosmid vectors. Metode Enzymol. 152:199–212. 13. Fleischmann, RD, et al. 1995. Whole-genome random 
sequencing and 
assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269:496–512. 14. Frosch, M., U. Edwards, K. Bousset, B. Krauße, and C. 
Weisgerber. 1991. Evidence for a common molecular origin of the capsule gene loci in Gram- negative bacteria expressing group 
II capsular polysaccharides. Mol. Micro- biol. 5:1251–1263. 15. Frosch, M., D. Müller, K. Bousset, and A. Müller. 1992. 
Conserved outer membrane protein of Neisseria meningitidis involved in capsule expression. Menulari. Immun. 60:798–803. 16. 
Hammerschmidt, S., C. Birkholz, U. Zahringer, BD Robertson, J. van Putten, O. Ebeling, and M. Frosch. 1994. Contribution of 
genes from the capsule gene complex (cps) to lipooligosaccharide biosynthesis and serum resistance in Neisseria meningitidis. 
Mol. Mikrobiol. 1:885–896. 17. Hawley, DK, and WR McClure. 1983. Compilation and analysis of Escherichia coli promoter 
DNA sequences. Asam Nukleat Res. 11:2237– 2255. 18. Janik, A., E. Juni, and GA Heym. 1976. Genetic transformation as a 
tool 
for detection of Neisseria gonorrhoeae. J. Clin. Mikrobiol. 4:71–81. 19. Kawamura, T., N. Ichihara, S. Sugiyama, H. 
Yokota, N. Ishimoto, and E. Ito. 
1985. Biosynthesis of UDP-N-acetyl- 
D 
-glucosaminuronic acid and UDP-N- acetyl- 
D 
-mannosaminuronic acid in Micrococcus luteus. J. Biochem. 98:105– 116. 20. Kelly, T., JP Dillard, and J. Yother. 1994. 
Effect of genetic switching of capsular type on virulence of Streptococcus pneumoniae. Menulari. Immun. 62: 1813–1819. 21. 
Kiino, DR, R. Licudine, K. Wilt, DHC Yang, and LB Rothman-Denes. 1993. A cytoplasmic protein, NfrC, is required for 
bacteriophage N4 adsorp- tion. J. Bacteriol. 175:7074–7080. 22. Kroll, JS, and ER Moxon. 1990. Capsulation in distantly related 
strains of Haemophilus influenzae type b: genetic drift and gene transfer at the capsulation locus. J. Bacteriol. 172:1374–1379. 
23. Kuhn, H.-M., U. Meier, and H. Mayer. 1988. ECA, the enterobacterial 
common antigen. FEMS Microbiol. Rev. 54:195–222. 24. Lee, FKN, DS Stephens, BW Gibson, JJ Engstrom, D. Zhou, and 
MA Apicella. 1995. Microheterogeneity of Neisseria lipooligosaccharide: analysis of a UDP-glucose 4-epimerase mutant of 
Neisseria meningitidis NMB. Menulari. Immun. 63:2508–2515. 25. Lew, H., H. Nikaido, and PH Mäkela. 1978. Biosynthesis of 
uridine diphos- phate-N-acetylmannosaminuronic acid in rff mutants of Salmonella typhi- murium. J. Bacteriol. 136:227–233. 
V 
OL 
. 180, 1998 GENETIC BASIS OF SEROGROUP A MENINGOCOCCAL CAPSULES 1539 
26. Liu, T.-Y., EC Gotschlich, EK Jonssen, and JR Wysocki. 1971. Studies on the meningococcal polysaccharides. 1. 
Composition and chemical prop- erties of the group A polysaccharide. J. Biol. Chem. 246:2849–2858. 27. Menard, R., PJ 
Sansonetti, and C. Parsot. 1993. Nonpolar mutagenesis of the ipa genes defines IpaB, IpaC, and IpaD as effectors of Shigella 
flexneri entry into epithelial cells. J. Bacteriol. 175:5899–5906. 28. Moore, PS, LH Harrison, EE Telzak, GW Ajello, and CV 
Broome. 1988. Group A meningococcal carriage in travelers returning from Saudi Arabia. JAMA 260:2686–2689. 29. Moore, 
PS, J. Hierholzer, W. DeWitt, K. Gouan, D. Djore, T. Lippeveld, et al. 1990. Respiratory viruses and mycoplasma as cofactors 
for epidemic group A meningococcal meningitis. JAMA 264:1271–1275. 30. Morse, SA, and L. Bartenstein. 1974. Factors 
affecting autolysis of Neisseria 
gonorrhoeae. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145:1418–1421. 31. Novelli, VM, RG Lewis, and ST Dawood. 1987. Epidemic 
group A 
meningococcal disease in Haj pilgrims. Lancet ii:863. 32. Pinner, RW, F. Onyango, BA Perkins, NB Mirza, DM Ngacha, M. 
Reeves, et al. 1992. Epidemic meningococcal disease in Nairobi, Kenya, 1989. J. Infect. Dis. 166:359–364. 33. Prentki, P., and 
HM Krisch. 1984. In vitro insertional mutagenesis with a 
selectable DNA fragment. Gene 29:303–313. 34. Shyamala, V., and GF-L. Ames. 1989. Genome walking by single-specific- 
primer polymerase chain reaction: SSP-PCR. Gene 84:1–8. 35. Southern, EM 1975. Detection of specific sequences among 
DNA frag- 
ments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503–517. 36. Stephens, DS, JS Swartley, S. Kathariou, and SA 
Morse. 1991. Inser- tion of Tn916 in Neisseria meningitidis resulting in loss of group B capsular polysaccharide. Menulari. 
Immun. 59:4097–4102. 37. Swartley, JS, JH Ahn, L.-J. Liu, CM Kahler, and DS Stephens. 1996. Expression of sialic acid and 
polysialic acid in serogroup B Neisseria menin- gitidis: divergent transcription of biosynthesis and transport operons through a 
common promoter region. J. Bacteriol. 178:4052–4059. 38. Swartley, JS, AA Marfin, S. Edupuganti, L.-J. Liu, P. Cieslak, B. 
Perkins, JD Wenger, and DS Stephens. 1997. Capsule switching of Neisseria meningitidis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 
94:271–276. 39. Swartley, JS, CF McAllister, RA Hajjeh, DW Heinrich, and DS Stephens. 1993. Deletions of Tn916-like 
transposons are implicated in tetM- mediated resistance in pathogenic Neisseria. Mol. Mikrobiol. 10:299–310. 40. Swartley, JS, 
and DS Stephens. 1994. Identification of a genetic locus 
involved in the biosynthesis of N-acetyl- 
D 
-mannosamine, a precursor of the ( 238)-linked polysialic acid capsule of serogroup B 
Neisseria meningitidis. J. Bacteriol. 176:1530–1534. 41. Vann, WF, T.-Y. Liu, and JB Robbins. 1976. Bacillus pumilus polysac- 
charide cross-reactive with meningococcal group A polysaccharide. Menulari. Immun. 13:1654–1662. 42. World Health 
Organization. 1996. Meningitis in Africa—the constant chal- lenge of epidemics, press release 21. World Health Organization, 
15 March 1996. 43. World Health Organization. 1997. Meningitis control in Africa in 1997: a successful international effort. 
World Health Organization press release 49, 24 June 1997. 44. Yoneyama, T., Y. Koike, H. Arakawa, K. Yokoyoma, Y. Sasaki, 
T. Kawa- mura, Y. Araki, E. Ito, and S. Takao. 1982. Distribution of mannosamine and mannosaminuronic acid among cell walls 
of Bacillus species. J. Bacteriol. 149:15–21. 45. Zollinger, WD, J. Boslego, LO Froholm, JS Ray, EE Moran, and BL Brandt. 
1987. Human bactericidal antibody response to meningococcal outer membrane protein vaccines. Antonie Leeuwenhoek 
53:403–411.