Pengukuran Orthophosphate Anorganik dalam Bahan Biologis: Ekstraksi Sifat Butil Asetat1

HISASHI SANUI
Departemen Fisiologi-Anatomi, Universitas California, Berkeley, California 94720
Diterima pada tanggal 11 Oktober 1973; diterima 4 Maret 1974
Sifat beberapa pelarut organik diselidiki untuk menentukan kesesuaiannya untuk digunakan dalam
prosedur ekstraksi phosphomolybdic acid (PMA) untuk pengukuran anorganik ortofosfat (Pi). Butil
asetat menunjukkan sifat yang paling memuaskan untuk pengukuran pada 310 nm, yang merupakan
puncak absorpsi untuk PMA yang tidak dikurangi. Butil asetat secara esensial tidak memberikan
penyerapan pada 310 nm, sangat selektif untuk PMA selama molibdat dan silicomolybdate, tidak
mengekstrak molibdat dengan adanya asam trikloroetat (TCA), menunjukkan perubahan volume yang
dapat diabaikan bila disequilibrasi dengan volume fasa air yang sama. , dan merupakan salah satu
pelarut organik yang paling tidak beracun. Kondisi optimum keasaman, konsentrasi molibdat, dan waktu
reaksi dan ekstraksi ditentukan untuk pembentukan PMA dan ekstraksi menjadi butil asetat. Prosedur
untuk pengukuran Pi dalam bahan biologis yang menggunakan TCA 8% untuk pengendapan bahan
organik pada O "C, reaksi supernatan dengan asam molibdat, ekstraksi PMA dengan butil asetat dan
pembacaan PMA yang tidak diperkuat pada 310 nm dijelaskan. . Prosedurnya sederhana, cepat, akurat,
selektif, dan memiliki kepekaan tinggi. Karena paparan sampel singkat (20 set) terhadap asam molibdat,
disarankan agar prosedur ini juga berguna dalam pengukuran PI dengan adanya adenosin trifosfat
seperti untuk uji aktivitas adenosinetriphosphatase.

Bahan biologis mengandung senyawa organofosfat labil yang melepaskan anorganik ortofosfat (Pi)
dalam kondisi tertentu dan menginduksi kesalahan dalam pengukuran Pi. Dalam sampel ini, tindakan
pencegahan diperlukan untuk meminimalkan paparan sampel terhadap kondisi hidrolisis seperti
keasaman tinggi, adanya asam molibdat, suhu tinggi dan paparan panjang terhadap kondisi ini (1,2).
Terlepas dari kenyataan bahwa sejumlah in- vestigator (misalnya, 2-4) telah menunjukkan bahwa jenis
metode Fiske dan SubbaRow (5) tidak sesuai untuk pengukuran Pi dengan adanya senyawa fosfat
mudah terhidrolisis karena relatif,
"Investigasi ini didukung oleh Grant No. GM 18819-02 dari National Institutes of Health. 489 Hak Cipta 0
1974 oleh Academic Press, Inc. Semua hak reproduksi dalam bentuk apapun dicadangkan.
HISASHI SANUI
Sampel sampel yang lama terhadap asam molibdat, masih merupakan salah satu prosedur yang paling
sering digunakan, terutama dalam studi aktivitas membran adenosinetri-fosfatase (ATPase). Prosedur
ekstraksi pelarut organik yang diimplikasikan oleh Berenblum dan Chain (6) menghasilkan hasil yang
sangat baik dengan meminimalkan paparan sampel terhadap kondisi hidrolisis dan dengan mengurangi
interferensi secara selektif dan dengan cepat menghilangkan kompleks asam fosforolibdat (PMA) dari
larutan berair. Metode ini mengambil keuntungan dari kelarutan tinggi kompleks PMA pada pelarut
organik tertentu, yang banyak diuji oleh berbagai penyidik untuk kesesuaiannya sebagai agen penggali
untuk PMA (7-9). Meskipun ester merupakan salah satu ekstraktan PMA yang paling selektif (7,9),
banyak alkohol telah diuji dan sejumlah 4 sampai 8 alkohol karbon telah ditemukan sebagai agen
pelepas yang efektif (8). Isobutanol telah digunakan secara ekstensif dalam prosedur ekstraksi pelarut
untuk pengukuran Pi (l-3, 6, lo), namun alkohol ini menunjukkan beberapa sifat yang tidak
menguntungkan. Yang menjadi perhatian khusus adalah pengamatan (7,8,11) bahwa ia mengeluarkan
sejumlah besar asam molibdat (MA) yang hadir secara berlebihan dalam fasa berair dan menyerap
dengan kuat pada 310 nm, puncak penyerapan PMA. Dalam pengukuran PMA yang tidak dikurangi, ini
menghasilkan tingkat kekosongan yang tinggi, sangat mengurangi kisaran konsentrasi analitis dan
mengenalkan ketidakpastian tambahan pada hasilnya. Selain itu, isobutanol juga memiliki sifat kelarutan
yang buruk (12,13) sehingga terjadi perubahan besar dalam volume fase organik pada ekstraksi PMA
dari fasa berair (14) dan menyebabkan hasil yang salah. Campuran isobutanol dengan benzena (14-16))
xilena (17)) atau kloroform (7) mengurangi ekstraksi molibdat dan juga perubahan volume pada kondisi
percobaan yang diberikan. Namun, kesulitan masih diatasi sehingga rasio pelarut yang berbeda telah
digunakan oleh peneliti yang berbeda (G-17), dan campuran ini masih mengekstrak sejumlah besar
molibdat dengan adanya asam trikloroasetat (TCA) yang sering digunakan sebagai protein presipitant
Karena keuntungan penting dari prosedur ekstraksi pelarut organik untuk pengukuran Pi dengan adanya
senyawa organophosfat labil, saya menyelidiki sifat dan kesesuaian beberapa pelarut yang umum
digunakan, dengan penekanan khusus pada studi ester, butil asetat, yang tampaknya menunjukkan
keuntungan yang signifikan dibanding t, dia lebih sering menggunakan alkohol. Butil asetat, yang sangat
selektif untuk ekstraksi PMA (7) dan telah digunakan4 dalam pengukuran PMA yang dikurangi (18))
ditunjukkan secara unik sesuai untuk digunakan dalam ekstraksi dan pengukuran PMA yang tidak
diperkaya. Mengikuti penelitian tentang faktor penting termasuk pengendapan protein
PENGUKURAN FOSFAT INORGANIK 491
agen, asam dan konsentrasi molibdat, dan bentuk PMA yang akan diukur, metode yang menggunakan
TCA sebagai presipitat protein dan butil asetat sebagai pelarut organik untuk ekstraksi PMA
diformulasikan dan ditunjukkan agar memuaskan untuk memperkirakan Pi dalam bahan biologis.
METODE DAN BAHAN Reagen. Larutan stok untuk TCA dan amonium molibdat dibuat dari bahan kimia
kelas reagen dan disimpan dalam bot polietilen. Reagen grade H, SO ,, sp gr 1,84, digunakan untuk
mempersiapkan semua larutan asam sulfat. Kelas reagen atau standar utama KH, PO, dikeringkan
semalam pada suhu 100 ° C dan diberi pupuk sebelum ditimbang dan digunakan dalam pembuatan
standar ortofosfat anorganik. Nilai spektrum butil asetat (Eastman) dan kelas reagen analitik isobutanol,
xilena, toluena, benzena, oktanol, dan heksanol digunakan sebagai pelarut. Semua bahan kimia lainnya
bervolume. Peralatan. Spektrum serapan dan pembacaan absorpsi pada 310 nm diperoleh dengan
spektrofotometer Beckman DU menggunakan lampu hidrogen atau DU Beckman dengan lampiran
Gilford model 222. Spektrum penyerapan juga berjalan pada spektrofotometer balok ganda Cary model
14. Semua bacaan dibuat dengan menggunakan cuvettes kuarsa kuadrat 1 cm yang sesuai. Sentrifugasi
kecepatan rendah yang diperlukan dalam prosedur analitik dilakukan dengan sentrifus klinis
internasional. Persiapan homogenat hati dan mikrosom. Hati tikus yang disembuh dihomogenkan pada
larutan sukrosa 0,25 M dan dialisis secara ekstensif terhadap air suling sampai tidak ada jumlah Pi yang
terukur yang tersisa dalam partikel. Mikrosom diisolasi dalam larutan sukrosa 0,25 M dengan
sentrifugasi diferensial seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (19). Prosedur: 1. Spektrum
penyerapan. Spektrum serapan untuk butil asetat dijalankan pada kisaran 250-400 nm dengan air suling
sebagai referensi. Spektrum penyerapan untuk PMA dijalankan dengan mengekstraksi 5 ml larutan
berair yang mengandung 0,6 NH, SO ,, 6,1 rnM ammonium molibdat, 390 mM TCA, dan 0,02 rnM KH,
PO, dengan 5 ml berbagai pelarut organik dan menjalankan ekstrak ini terhadap residu reagen yang
sesuai. . Spektrum untuk MA diperoleh dengan pengukuran pada bahan reagen kosong terhadap
pelarut. Larutan pelarut pada SlO nm. Penyerapan oleh berbagai pelarut pada 310 nm diukur terhadap
air suling. 2. Karakteristik ekstraksi soluents. Untuk membandingkan karakteristik eksemplar dari pelarut
yang diuji, larutan berair 5 ml yang mengandung Hanya 6,1 mM amonium molibdat dan 0,6 N H, SO,
atau wit] 1
HISASHI SANUI
ditambahkan natrium silikat 0,83 mM atau 0,02 mM KH, FO, diekstraksi dengan 5 ml pelarut dengan
mengocok 20 set dan sentrifugasi 1 menit. Penyerapan fasa organik kemudian diukur pada 310 nm
terhadap hamparan yang sesuai. Karena sampel mikrosom yang digunakan dalam percobaan pengikatan
kation kami secara rutin diendapkan dengan TCA, ekstraksi dari berbagai sistem juga dilakukan dengan
penambahan 390 mM TCA. 3. Butil asetat sebagai alat samping PMA. Berdasarkan hasil penelitian dan
informasi dari literatur (misalnya, 7, 9, 12, 13), butil asetat dipilih sebagai pelarut yang paling
memuaskan untuk digunakan sebagai agen ekstraksi untuk FMA. Investigasi selanjutnya dilakukan pada
berbagai sistem yang menggunakan pelarut ini. Setiap sampel terdiri dari 5 ml fasa berair yang
diekstraksi pada suhu kamar (2 & 22 ° C) dengan 5 ml butil asetat. Absorbansi PMA yang tidak
diekstraksi diukur pada 310 nm. Tingkat reaksi dan ekstraksi. Tingkat pembentukan FMA diukur pada
suhu kamar dengan mengocok fasa berair yang mengandung 0,02 mM KH, PO, untuk rentang waktu
yang bervariasi dalam kontak dengan asam molibdat (6,1 mM ammonium molibdat ditambah 0,6 NH,
SO, dan 390 mM TCA) Selanjutnya ekstraksi dengan gemetar selama 20 set dengan butil asetat. Tingkat
ekstraksi PMA diukur dengan membiarkan Pi dan asam molibdat bereaksi selama 1 menit (pada saat
pembentukan PMA selesai) dan bergetar untuk waktu yang berbeda dengan butil asetat.
Ketergantungan konsentrasi molibdat. Sampel yang mengandung 390 mM TCA, 0,6 N H & SO ,, 0,02 mM
KH, PO, dan konsentrasi ammonium molybdate atau sodium molybdate yang berbeda dalam fasa berair
total 5 ml diekstraksi selama 20 set dengan butil asetat. Ketergantungan konsentrasi asam. Untuk
menguji konsentrasi ion hidrogen ketergantungan formasi PMA, sampel yang mengandung konsentrasi
TCA, H, SO ,, atau HCI yang berbeda diekstraksi dengan butil asetat. Pengaruh bahan biologis. Sampel
yang mengandung homogenat hati tikus atau mikrosom diobati dengan 5 ml es dingin 8% TCA. Setelah
pemberian natrium, 4 ml supernatan dibuat 6,1 mM dalam amonium molibdat dan 0,6 N dalam H, SO,
dalam total volume 5 ml dan diekstraksi dengan butil asetat. Dalam beberapa seri, langkah ekstraksi TCA
dihilangkan dan sampel biologis yang mengandung F ditambahkan, dan 390 mM TCA, 6,1 mM amonium
molibdat, dan 0,6 NH, SO, terguncang selama 20 set dengan butil asetat dan disentrifugasi selama 1
menit. HASIL 1. Spektrum penyerapan. Butil asetat menunjukkan titik potong pada sekitar 255 nm,
dengan absorbansi turun tajam pada 260 nm dan
FIO. 1. Spektrum penyerapan. Spektrum untuk butil asetat dijalankan terhadap air yang disebarkan
sebagai rujukan. Spektrum untuk asam molibdat diperoleh dengan mengekstraksi 5 ml larutan berair
yang mengandung 0,6 N H & SO ,, 390 rnM TCA, dan 6,1 m & r amonium molibdat dengan 5 ml
isobutanol dan menjalankan fase organik melawan isobutanol. Spektrum untuk asam fosfigolibdat
(PMA) diperoleh dengan mengekstraksi 5 ml larutan berair yang mengandung 0,6 N HZSO ,, 6,1 mM
ammonium molibdat, 390 mM TCA, dan 0,02 rnM KI-I, PO, dengan 5 ml butil asetat dan menjalankan
fasa organik terhadap residu reagen.
mendekati nol pada 320 nm (Gambar 1). Asam molibdat yang diekstraksi menjadi isobutanol
memberikan spektrum dengan puncak pada 275 nm dan pembacaan 0,600 pada 310 nm; butil asetat
tidak menghasilkan asam molibdat terukur. PMA yang tidak dikoordinasikan memberikan spektrum
absorpsi dengan puncak pada 310 nm, kurva serupa diperoleh dengan butil asetat, isobutol atau 1: 1 (v /
v) heksanol: toluena sebagai pelarut. Pengukuran absorbansi PMA yang tidak diperkuat dilakukan pada
310 nm. Tabel 1 merangkum data absorbansi yang diperoleh untuk beberapa pelarut yang diuji
kesesuaiannya sebagai pengekstraksi PMA. Karakteristik kelarutan yang diperoleh dari literatur untuk
pelarut murni juga terdaftar. Larutan pelarut pada 310 nm. Butil asetat memberi penyerapan paling
rendah (0,009) pada 310 nm pelarut yang diuji. Isobutanol memberikan absorbansi 0,123 dan heksanol
absorbansi 0,023. Octanol memberikan pembacaan tinggi 1.867 dan tidak diuji lebih lanjut karena
pembentukan larutan keruh dengan adanya asam molibdat.
502 HISASHI SANUI
Butil asetat menunjukkan sifat yang umumnya lebih tinggi dari pada alkohol (Tabel 1) yang memiliki
penyerapan rendah pada 310 nm, menunjukkan selektivitas PMA tinggi pada molibdat dan
silicomolybdate dan menghasilkan ekstraksi PMA yang cepat dan kuantitatif. Yang penting adalah
ekstraksi molibdat dasarnya tanpa adanya TCA, properti yang tidak ada dalam campuran alkohol-
benzena, -toluena, atau campuran-xena. Jadi, dalam prosedur yang diusulkan yang menggunakan TCA
untuk pengendapan bahan biologis dan butil asetat untuk ekstraksi PMA, secara khusus kosong nol
diperoleh, sehingga menghilangkan kebutuhan untuk mencuci fase organik dengan H, campuran pelarut
SOrorganic (6,16) pada untuk mengurangi latar belakang kosong. Karena kelarutan rendah butil asetat
dalam air (1 g / 100 ml air pada 2O "C), dan kira-kira sama saling solubilitas dengan air (12)) tidak ada
perubahan volume yang signifikan diamati bahkan dengan adanya asam molibdat dalam air tahap. Hal
ini meminimalkan kesulitan dari perubahan volume. Selain itu, dari sudut pandang praktis, butil asetat
memiliki bau buah yang menyenangkan dan merupakan salah satu pelarut termodifikasi yang paling
tidak beracun (12). Sebaliknya, beberapa alkohol seperti oktanol memiliki bau tajam dan tajam, dan
pelarut seperti benzena dan analognya sangat toksik. Butil asetat juga tersedia dalam tingkat kualitas
spektra absorbansi rendah pada 310 nm. Dengan demikian, dari pelarut yang diselidiki, butil asetat
nampaknya menunjukkan kualitas yang paling sesuai untuk digunakan sebagai alat pengangkut PMA
dalam pengukuran Pi. Pertanyaan penting mengenai apakah lebih baik mengukur PMA dalam bentuk
berkurang pada 66CW300 nm atau dalam bentuk yang tidak diperkuat pada 310 nm tampaknya menjadi
titik beberapa kontroversi dan kebingungan. Dalam prosedur yang tidak termasuk ekstraksi pelarut
organik PMA, adanya konsentrasi tinggi asam molibdat dalam campuran reaksi menentukan untuk
pengukuran PMA yang berkurang pada panjang gelombang yang panjang karena penyerapan yang kuat
oleh asam molibdat pada panjang gelombang pendek di dekat 310 nm. Dalam media alkohol tanpa
ekstraksi, pengukuran PMA yang tidak diperkaya pada panjang gelombang (390 nm) di mana perbedaan
penyerapan antara molibdat dan PMA sangat besar (Gambar 1) menghasilkan sensitivitas yang sangat
berkurang sejak PMA dibaca pada panjang gelombang jauh dari resistansi maksimumnya pada 310 nm
(25). Bahkan dalam prosedur yang menggunakan ekstraksi pelarut organik PMA, banyak pelarut
memiliki absorbansi latar belakang yang tinggi pada 310 nm atau mengekstrak sejumlah molibdat SO
sehingga pembacaan PMA yang dikurangi atau tidak diperkaya pada panjang gelombang lebih lama dari
sekitar 380 nm tampaknya diinginkan (1, 6,14,24). Laporan yang tampaknya kontradiktif bahwa
kepekaan untuk Pi lebih penting bila PMA diukur dalam bentuk dikurangi (mis., 24) atau tidak dikurangi
(mis., 15) dicatat oleh fakta bahwa beberapa investigiga-