BIOTEKNOLOGI FARMASI

REVIEW JURNAL KLONING GEN

“KLONING GEN Pab MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

KE VEKTOR EKSPRESI pQE30 SEBAGAI ANTIGEN UNTUK
KIT DIAGNOSTIK TUBERKULOSIS LATEN”

Nama : Efeline Freliana Zainudin

NIM : 15040074

Semester : V.B

SEKOLAH TINGGI FARMASI MUHAMMADIYAH TANGERANG

Jl. Raya Pemda KM.4 No.13, Mata Gara, Tigaraksa, Tangerang, Banten 15720, Indonesia

2017

1
 KLONING GEN Pab MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
KE VEKTOR EKSPRESI pQE30 SEBAGAI ANTIGEN UNTUK
KIT DIAGNOSTIK TUBERKULOSIS LATEN

A. TUJUAN PENELITIAN

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkloning gen Pab ke vektor ekspresi,
sehingga dapat diproduksi menjadi antigen untuk pengembangan kit diagnosis TB
laten berbasis imunologi.

B. Latar Belakang PENELITIAN

TBC (Tuberculosis) termasuk dalam 10 besar penyakit yang menyebabkan
kematian di dunia. Data WHO menunjukkan bahwa pada tahun 2015, Indonesia
termasuk dalam 6 besar negara dengan kasus baru TBC terbanyak. Ketersediaan
reagen diagnostik untuk TBC sangat diperlukan yang secara ideal dapat
mengidentifikasi individu terinfeksi baru dan laten dengan resiko tinggi untuk
berkembang menjadi tuberkulosis aktif. Maka berdasarkan penjelasan di atas maka
kami akan melakukan kloning gen Pab pengkode 38 kDa dari M,tuberculosis ke
vektor ekspresi. Diharapkan klon rekombinan tersebut dapat diekspresi dan
diproduksi menjadi protein, sehingga dapat dipakai sebagai antigen untuk melengkapi
uji imunodiagnostik TB yang sudah ada di Indonesia.

C. Tinjauan Pustaka

a. Definisi

Tuberkulosis (TB) yang juga dikenal dengan singkatan TBC, adalah penyakit
menular paru-paru yang disebabkan oleh basil Mycobacterium tuberculosis. Penyakit
ini ditularkan dari penderita TB aktif yang batuk dan mengeluarkan titik-titik kecil air
liur dan terinhalasi oleh orang sehat yang tidak memiliki kekebalan tubuh terhadap
penyakit ini.

2
Gambar.1 Koloni bakteri M. Tuberculosis
Klasifikasi Ilmiah

Kerajaan : Bacteria

Filum : Actinobacteria

Ordo : Actinomycetales

Upaordo : Corynebacterineae

Famili : Mycobacteriaceae

Genus : Mycobacterium

Spesies : M. tuberculosis

b. Penyebab dan Faktor Risiko Tuberkulosis

Penyebab tuberkulosis adalah Mycobacterium tuberculosis. Basil tersebut menyebar

di udara melalui semburan titik-titik air liur dari batuk pengidap TB aktif. Terdapat
sejumlah orang yang memiliki risiko penularan TB yang lebih tinggi. Kelompok-
kelompok tersebut meliputi:

3
  Orang dengan sistem kekebalan tubuh yang lemah, seperti pengidap HIV/AIDS,
diabetes, atau orang yang sedang menjalani kemoterapi.
 Orang yang mengalami malnutrisi atau kekurangan gizi.
 Perokok.
 Pecandu narkoba.
 Orang yang sering berhubungan dengan pengidap TB aktif, misalnya petugas
medis atau keluarga pengidap.

c. Proses Diagnosis Tuberkulosis

Tuberkulosis termasuk penyakit yang sulit untuk terdeteksi. Dokter biasanya

menggunakan beberapa cara untuk mendiagnosis penyakit ini, antara lain:

 Rontgen dada.
 Tes Mantoux.

Tes Mantoux / tuberculin (tuberculin skin test) merupakan alat diagnostik yang
sampai saat ini mempunyai sensitivitas dan spesifisitas cukup tinggi untuk
mendiagnosis adanya infeksi tuberkulosis. Test mantoux adalah suatu cara yang
digunakan untuk mendiagnosis TBC. Tes mantoux itu dilakukan dengan
menyuntikan suatu protein yang berasal dari kuman TBC sebanyak 0,1 ml dengan
jarum kecil di bawah lapisan atas kulit lengan bawah kiri.

 Tes darah.
 Tes dahak.

d. Pengobatan dan Pencegahan Tuberkulosis

Penyakit yang tergolong serius ini dapat disembuhkan jika diobati dengan benar.
Langkah pengobatan yang dibutuhkan adalah dengan mengonsumsi beberapa jenis
antibiotik dalam jangka waktu tertentu.

4
Sementara langkah utama untuk mencegah TB adalah dengan menerima vaksin BCG
(Bacillus Calmette-Guerin). Di Indonesia, vaksin ini termasuk dalam daftar imunisasi
wajib dan diberikan sebelum bayi berusia 2 bulan.

- Vaksin BCG

Vaksin BCG ini mengandung kuman hidup Mycobacterium bovis yang telah
dilemahkan (live atteuated). Efektifitasan vaksin BCG:

 Mengurangi resiko berbagai bentuk penyakit tuberkulosis sekitar 50%

 Mengurangi bentuk berat penyakit TBC di organ lain, seperti meningitis

tuberkulosis anak hingga paling sedikit 70%

 Efek perlindungan ini berlangsung hingga 10 tahun lamanya, tetapi tidak

diketahui apakah masih terdapat efek perlindungan ini setelah jangka waktu
tersebut
 Catatan Tambahan (10 September 2015) : Menurut Wikipedia tentang daya
proteksi vaksin BCG ini bisa berlangsung hingga 15 tahun lamanya. Tapi ini
tergantung dari 2 hal, yaitu : Letak geografis negara dan dari laboratorium yang
mana strain kuman pembuat vaksin BCG ini berasal

 Vaksin BCG diketahui kurang efektif pada orang dewasa, terutama untuk mereka
yang mempunyai resiko penularan yang tinggi, vaksin ini tidak cukup melindungi.

e. Risiko Komplikasi Tuberkulosis

Apabila tidak diobati, bakteri TB dapat menyebar ke bagian tubuh lain dan berpotensi
mengancam jiwa pengidap. Beberapa komplikasi yang mungkin terjadi adalah:

 Nyeri tulang punggung.

 Meningitis.
 Kerusakan sendi.
 Gangguan hati, ginjal, atau jantung.

5
D. Metodelogi Kerja Penelitian
 Alat dan bahan
1. Bahan : primer Pab, agarosa, pQE30, E.coli BL 21, ampisilin, Qiagen Kit,
GFX Kit, enzim restriksi, PCR mix (Polymerase Chain Reaction)

2. Alat : elektroforesis gel agarosa,

 Cara Kerja

a. Subklon gen target Pab ke vektor ekspresi pQE30 pada E.coli BL21
(DE3)
1. Plasmid rekombinan pGEM-T-pQE30 yang telah diuji
kebenarannya, ditumbuhkan dalam medium Lowenstein Jensen
dengan ampisilin.
2. Selanjutnya dilakukan isolasi plasmid menggunakan Qiagen Kit.
3. Selanjutnya plasmid rekombinan dan vektor ekspresi pQE30
dipotong dengan enzim restriksi NcoI dan BamHI.
4. Hasil pemotongan dikarakterisasi dengan analisis elektroforesis gel
agarosa.
5. DNA sisipan dimurnikan dari gel agarosa dengan kit dan
diligasikan ke vektor ekspresi.
6. Hasil ligasi kemudian di transformasi ke sel host E.coli BL21
(DE3), sehingga dihasilkan transforman E.coli BL 21 (DE3) yang
mengandung plasmid rekombinan pQE30-Pab.
7. Transforman diseleksi pada media yang mengandung ampisilin.

6
 b. Karakterisasi klon rekombinan pQE30-Pab
1. Plasmid rekombinan ditumbuhkan pada medium LB cair dengan
ampisilin.
2. Selanjutnya dilakukan isolasi plasmid untuk dikarakterisasi
kebenaran DNA sisipannya.
3. Karakterisasi dilakukan dengan PCR dan pemotongan dengan
enzim restriksi.

E. Hasil dan Pembahasan Penelitian

a. Subklon gen target Pab ke vektor ekspresi pQE30 pada E.coli BL21
(DE3)
Hasil isolasi plasmid rekombinan pGEM-T-Pab yang diperoleh pada
penelitian sebelumnya dapat dilihat pada gambar 1.

5000

1000

Gambar 1. Klon rekombinan pGEM-T-Pab

Dari gambar 1 terlihat bahwa ada 7 klon rekombinan pGEM-T-Pab yang
berukuran 4993 bp. Hal ini disebabkan karena ukuran pGEM-T adalah 3000 bp
dan gen Pab 1993 bp. Setelah klon rekombinan dan vektor ekspresi pQE30
dipotong dengan enzim restriksi NcoI dan BamHI, diperoleh hasil terlihat bahwa

7
vektor pQE30 telah berhasil dipotong dengan sempurna. Hal ini tampak dari
terbentuknya 2 pita.
Demikian pula setelah klon rekombinan dipotong, diperoleh dua pita yaitu
vektor pGEM-T dan DNA sisipan Pab. Selanjutnya gen Pab diligasi ke vektor
ekspresi pQE30 dan ditransformasi ke sel E.coli BL 21, yang dapat terlihat adanya
3 koloni putih yang di dalamnya membawa plasmid rekombinan pQE30-Pab.

Gambar.2 Restriksi pQE30 dan pGEM-T-Pab (R1)

Gambar.3 Transformasi pQE30-Pab ke E.coli BL 21

b. Karakterisasi klon rekombinan pQE30-Pab

Karakterisasi terhadap klon rekombinan dilakukan untuk mengetahui
kebenaran DNA sisipan yang telah dikloning. Karakterisasi dilakukan dengan
PCR dan pemotongan dengan enzim restriksi .

8
 Gambar 4. Karakterisasi DNA sisipan dengan PCR

Setelah klon rekombinan pQE30-Pab dikarakaterisasi dengan PCR, diperoleh pita

ukuran 1994 bp yang merupakan gen Pab.
Karakterisasi klon rekombinan dilakukan pula dengan pemotongan dengan enzim
restriksi, yang terlihat pada gambar berikut. Dari gambar 5 terlihat klon rekombinan G1
dan G2 sebelum dan sesudah dipotong enzim restriksi, Setelah terpotong diperoleh DNA
sisipan yang merupakan gen Pab.

Gambar.5 Karakterisasi DNA sisipan dengan pemotongan enzim restriksi

9
 F. Kesimpulan
Kloning gen Pab Mycobacterium tuberculosis ke vektor ekspresi pQE30 telah
berhasil dilakukan dan dikarakterisasi kebenaran DNA sisipannya. Dengan cara
melakukan pemotongan gen Pab dan vektor ekspresi pQE30 dengan enzim restriksi yang
sama, meligasi ke vektor ekspresi dan mentransformasi ke sel host E.coli BL 21.
Karakterisasi kloning dengan PCR dan sekuensing. Hasil penelitian diperoleh klon
rekombinan pQE30-Pab dan setelah dikarakterisasi dengan PCR dan sekuensing,
diperoleh bahwa DNA yang disisipkan adalah benar gen Pab.

G. DAFTAR PUSTAKA

JBFMU Hasanuddin - repository.unhas.ac.id diakses pada tanggal 29 September

2017

http://www.alodokter.com/tuberkulosis diakses pada tanggal 02 September 2017

http://selukbelukvaksin.com/vaksin-penyakit-paru-tbc/ diakses pada tanggal 02

September 2017

Agus, R (2014), Isolasi dan karakterisasi antigen M.tuberculosis asal Makassar

yang reaktif terhadap serum penderita tuberkulosis dan kontak sebagai
imunodiagnostik tuberkulosis laten, Jurnal Ilmu Alam dan Lingkungan, Volume
5, No 10, Agustus

Andersen A.B and Egon Bech Hansen, (1989), Structure and Mapping of
Antigenic Domains of Protein Antigen b, a 38,000-Molecular-Weight Protein of
Mycobacterium tuberculosis, Infection and Immunity, Vol 57 No 8

Diel R., Robert Loddenkemper, Karen Meywald-Walter, Rene Gottschalk, and

Albert Nienhaus, (2009), Comparative Performance of Tuberculin Skin Test,

10
QuantiFERON-TB-Gold In Tube Assay, and T-Spot.TB Test in contact
Investigations for Tuberculosis, American College of Chest Physicians, Chest,
135 :1010-1018

Flynn J.L and John Chan, (2001), Tuberculosis: Latency and Reactivation,
Infection and Immunity, Vol 69 No.7, p. 4195–4201

Jasmer R.M, Payam Nahid, and Philip C.Hopewell, (2002), Latent Tuberculosis
Infection, The New England Journal of Medicine, Vol.347

Kadival G.V., C.D’ Souza, M. Kameswaran and A.M Samuel, (1997),

Mycobacterium tuberculosis 38 kDa Antigen and Its Encoding Gene-Experience
In Diagnostic Applications, Indian Journal of Clinical Biochemistry, 12 (Suppl),
68 -71

STIC APPLICATIONS
Menzies D, Madhukar Pai, and George Comstock, (2007) Meta-analysis: New
Tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: Areas of Uncertainty and
Recommendations for Research, Ann Intern Med. 146 : 340-354

Pinxteren L.A.H, Pernille Ravn, Else Marie Agger, John Pollock and Peter
Andersen, Diagnosis of Tuberculosis Based on the Two Specific Antigens
ESAT-6 and CFP10, (2000), Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology,
Vol 7 No 2, p.155-160

Rosales-Borjas, D.M., Sergio Zambrano-Villa, Martha Elinos, Harum Kasem,

Antonio Osuna, Raul Mancilla, and Librado Ortiz-Ortiz, 1998, Rapid Screening
Test for Tuberculosis Using a 38 kDa Antigen From Mycobacterium tuberculosis,
Journal of Clinical Laboratory Analysis 12 : 126-129

11