BAB II

ISI

A. Manipulasi DNA murni

Setelah sampel DNA murni di buat, langkah selanjutnya dalam eksperimen

kloning gen adalah pembentukan molekul DNA rekombinan. Untuk menghasilkan

molekul rekombinan, vektor dan DNA yang akan diklon harus di potong pada tempat-

tempat tertentu kemudian di gabungkan menjadi satu dengan cara terkontrol.

Pemotongan dan penyambungan adalah sua contoh teknik manipulasi DNA. Berbagai

macam teknik ini telah dikembangkan sejak dua puluh tahun terakhir. Seperti halnya

di potong dan di sambung kembali, molekul DNA dapat di perpendek, diperpanjang,

di buat kopi menjadi molekul RNA atau molekul DNA baru, dan dimodifikasi dengan

penambahan atau pengambilan gugus kimiawi tertentu. Manipulasi tersebut, yang

semuanya dapat dikerjakan dalam tabung percobaan, memberi dasar tidak hanya untuk

kloning gen tapi juga untuk penelitian dasar biokimia DNA, struktur grn dan juga

pengaturan ekspresi gen.

Hampir semua teknik manipulasi DNA menggunakan enzim yang dimurnikan.

Dalam sel enzim-enzim ini berperan serta dalam proses-pross penting seperti replika

dan transkripsi DNA, penghancuran DNA asing atau tidak di ketahui (misalnya DNA

virus yang masuk dalam sel), replikasi DNA yang mengalami mutasi, serta

remkombinasi antara molekul-molekul DNA yang berbeda. Setelah pemurnian dari

ekstrak sel, enzim-enzim tersebut dapat di coba melaksanakan reaksi dalam kondisi-

kondisi yang artifisial. Walaupun reaksi enzimatik ini biasanya dapat langsung berjalan
tapi kebanyakan tidak mungkin berjalan dangan cara-cara kimia standar. Oleh karena

itu, enzim yang murni sangat penting dalam rekayasa genetik dan suatu industri yang

penting telah mengembangkan preparasi, karakterisasi dan pemasarannya.

Manipulasi pemotongan dan penyambungan DNA dilakukan oleh enzim yang

disebut endonuklease restriksi (untuk pemotonhan) dan ligase (untuk penyambungan).

B. Enzim-enzim untuk manipulasi DNA

Enzim-enzim ini dapat dikelompokkan menjadi lima golongan besar tegantung

pada jenis reksi yang dikatalis:

1. Nuklease, adalah enzim yang memotong, memendekkan atau mendegradasi

molekul asam nukleat.

2. Ligase, menyambung asam nukleat menjadi satu.

3. Polimerase, membuat kopi dari molekul.

4. Enzim modifikasi (modifying enzymes), menghilangkan atau menambah gugus

kimiawi.

5. Topoisomerase, membuat atau mengubah DNA berlilitan (supercoil) dari DNA

sirkular yang tertutup secara kovalen.

Walaupun kebanyakan enzim dapat digolongkan pada kelompok tertentu,

beberapa enzim mempunyai aktivitas yang bemacam-macam sehingga dapat

dimasukkan dalam dua golongan atau lebih. Banyak polimerase yang mempunyai

aktivitas kombinasi yaitu membuat DNA baru disertai aktivitas degradasi DNA

(nuklease). Seperti halnya enzim untuk manipulasi DNA, banyak enzim serupa yang

mempunyai aktivitas pada RNA. Ribonuklease yang dipakai untuk menghilangkan

RNA kontaminan pada preparasi DNA mrupakan salah satu contoh dari enzim tersebut.

1. Nuklease

Nuklease mendegradasi molekul DNA dengan memecah molekul fosfodiester

yang menghubungkan satu nukleotid dengan nukleotid berikutnya pada untai DNA.

Ada dua macam nuklase yang berbeda:

a. Eksonuklease, yng menghilangkan nukleotid satu per satu dari ujung molekul

DNA.

b. Endonuklase, yang memecah ikatan fosfodiester internal pada molekul DNA.

Perbedaan utama di antara macam-macam endonuklease terletak pada jumlah

untaian yang di degredasi dalam DNA untai ganda. Suatu enzim yang dimurnikan dari

bakteri Alteromonas espejiana adalah salah contoh enzim endonuklase yang memecah

nukleotid pada kedua untai molekul DNA beruntai ganda. Semakin lama waktu yang

dipakai untuk bekerja pada molekul DNA maka semakin pendek faragmen DNA yang

di hasilkan. Sebaliknya, enzim seperti eksonuklease III E. coli hanya mendegradasi

satu untai dari molekul DNA beruntai ganda, yang menghasilkan DNA untai tunggal,

seperti pada gambar.

Gambar 1. Reaksi yang dikatalis oleh dua macam nuklease yang berbeda
 Kriteri yang sama dapat dipakai klasifikasi endonuklease. Endonuklease S1

(dari jamur Aspergillus oryzae) hanya akan memotong untai tunggal. Dnase I adalah

nonspesifik, dalam arti bahwa enzim ini memotong DNA pada semabarang tepat ikatan

fosfodiester internal. Oleh karena itu, hasil akhir kerja Dnase I yang lama adalah

campura mononukleotid dan oligonukleotid yang sangat pendek. Sebaliknya kelompok

enzim khusus yang disebu endonuklease restriksi memotong DNA untai ganda hanya

pada tempat pengenal spesifik yang jumlahnya terbatas.

2. Ligase

Dalam sel fungsi ligase DNA adalah untuk mereparasi tempat putusnya untai

tunggal yang terjadi pada molekul DNA untai ganda yang mungkin terjadi pada waktu

replikasi DNA. Ligasi DNA yang berasal dari kebanyakan organisme juga akan

menyambung dua fragmen DNA untai ganda.

3. Polimerase

DNA polimerase adalah enzim yang mensintesis untai baru DNA yang

komplementer terhadap cetakan DNA atau RNA. Kebanyakan poliemrase hanya dapat

berfungsi jika cetakan mempunyai daerah untai ganda yang berlaku sbagai primer atau

permulaan polimerisasi.

Tiga macam polimerisasi DNA di gunakan secara rutin dalam rekayasa genetik.

Pertama adalah polimerase DNA I yang biasa di hasilkan dari E. coli. Enzim ini

melekat pada daerah untai tunggal pendek pada molekul DNA yang terutama beruntai

ganda dan kemudian mensintesis untai yang sama sekali baru dengan

mendegradasiuntai yang telah ada ketika proses berlangsung. Oleh karena itu,
polimerase DNA I adalah contoh dengan enzim aktivitas ganda, yaitu polimerase dan

degradasi DNA.

Gambar 2. Reaksi yang dikatalis oleh bermacam-macam endonuklease berbeda

Pada kenyataannya aktivitas polimerase an nuklease pada polimerase DNA I di

kontrol oleh bagian-bagian yang berbeda pada molekul enzim dan bagia-bagian ini

dapat dipisahkan jika molekul enzim di potong dengan cara tertentu. Bagian enzim

yang masih mempertahankan fungsi polimerase di sebut flagmen klenow. Karena

fragmen klenow tidak memiliki aktivitas nuklease maka enzim ini dapat mensintesis

untai DNA komplementer hanya pada suatu cetakan untai tunggal. Penggunaan utama

enzim ini adalah pada pengurutan DNA. Jenis polimerase DNA ketiga yang penting

dalam rekayasa genetik adalah transkriptase reversi , suatu enzim yang terlibat dalam

replikasi beberapa jenis virus. Transkriptase reversi adalah khas karena enzim ini

menggunakan RNA sebagai cetakan dan bukan DNA. Kemampuan enzim ini untuk
mensintesis DNA komplementer terhadap cetakan RNA sangat penting dalam teknik

kloning cDNA.

4. Enzim-enzim yang memodifikasi DNA

Ada banyak enzim yang dapat memoifikasi molekul DNA dengan cara

penambahan atau pengambilan gugus kimiawi tertentu. Diantara enzim-enzim ini yang

paling penting adalah:

1. Fosfatase alkali (dari E. coli atau jaringan usus sapi) yang menghilangkan fosfat

pada ujung 5 molekul DNA

2. Polinukleotid kinase (dari E.coli yang diinfeksi oleh fag T4), yang mempunayi

efek kebalikan dari fosfatase alkali yanitu menambah gugus fosfat pada ujung

5 yang bebas.

3. Deoksinukleotidil transferase terminal(dari ujung thymus anak sapi), yang

menambah satu atau lebih deoksinukleotid pada ujung 3` molekul DNA.

Gambar 3. Reaksi yang dikatalis oleh polimerase DNA.

5. Topoisomerase

Topoisomerase adalah enzim yang mampu mengubah bentuk DNA sirkular

yang tertutup secara kovalen (misalnya molekul DNA plasmid) denagn mmbentuk atau

menghilangkan bentuk lilitan(supercoil). Walaupun pnting dalam penelitian replikasi

DNA, penggunaan topoisomerase DNA dalam rekayasa genetik masih hatus diteliti.

C. Enzim-enzim untuk memotong DNA endonuklease retriksi

Dalam kloning gen perlu diketahui bahwa molekul DNA dapat dipotong

dengan cara yang sangat tepat dan dapat diulang. Hal ini digambarkan dalam cara

vektor dipotong pada pembentukan molekul DNA rekombinan. Tiap vektor harus

dipotong pada posisi tunggal untuk membuka lingkaran sehingga molekul DNA baru

dapat diinsersikan. Molekul yang terpotong lebih dari satu kali akan terpecah menjadi

dua fragmen atau lebih yang terpisah dan akan menjadi tidak berguna berguna sebagai

wahana kloning. Lagi pula tiap molekul vektor harus di potong pada posisi yang benar-

benar sama, karena pemotongan secara random tidak memuaskan. Untuk melakukan

manipulasi ini harus jelas bahwa dinutuhkan jenis nuklease yang sangat khusus.

Gambar 4. Perlunya manipulasi pemotongan tepat dalam proses kloning gen.

 DNA ynag diklon sering juga perlu dipotong, untuk ini ada dua alasan. Pertama,

jika tujuannya adalah untuk melakukan kloning gen tunggal yang mungkin terdiri atas

2 atau 3 kb DNA, maka gen ini harus dipotong dari molekul DNA yang besar (sering

lebih adri 80 kb). Kedua, molekul DNA yang besar harus dipecah hanya untuk

menghasilkan fragmen yang cukup kecil untuk dapat dibawah oleh vektor. Kebanyakan

vektor kloning lebih cocok terhadap fragmen DNA dengan kisaran ukuran tertentu.

Sebagai contoh M13 sangat tidak efisien untuk kloning molekul DNA yang panjangnya

lebih dari 3 kb.

Endonuklease restriksi murni memungkinkan ahli biologi molekular memotong

molekul DNA dengan cara yang tepat dan dapat di ulang, yang diperlukan untuk

kloning gen. penenmun enzim-enzim tersebut mengantar W. Arber, H. Smitt dan

D.nathans. untuk memperoleh hadiah nobel pada tahun 1978 dan penemuan ini

merupakan terobosan dalam perkembangan rekayasa genetik.

1. Penemuan dan manfaat endonuklease restriksi

Observasi peulaan yang mengantarkan pada penemuan endonuklease restriksi

telah dilakukan sejak awal tahun 1950-an ketika terlihat bahwa beberapa straing bakteri

kebal terhadap infeksi bakteriofag, suatu fenomena yang di sebut restriksi di atur-tuan-

rumah (host-controlled rectriction).

Mekanisme restriksi tidak terlalu rumit, walaupun demikian diperlukan waktu

lebih dari dua puluh tahun untuk memahami mekanisme ini sepenuhnya. Restriksi

terjadi karena bakteri menghasilkan enzim yang menghancurkan DNA fag sebelum fag

ini sempat mengadakan replikasi dan mengarahkan sintesa protein fag baru. DNA

bakteri sendiri terlindung dari serangan enzim tersebut karena DNA ini mempunyai
gugus metil tambahan yang menghalangi kerja degradatif enzim. Enzim-enzim

degradatif ini di sebut endonuklease resktriksi dan di sintesis oleh banyak spesies

bakteri; lebih dari 500 macam enzim ini sekarang telah dikarakterisasi. Telah dikenal

tiga jenis endonuklease restriksi yang masing-masing di bedakan oleh cara kerjanya

yang agal berbeda. Tipe I dan tipe III agak kompleks dan hanya mempunyai peran yang

sangat terbatas dalam rekayaasa genetik. Di lain pihak, endonuklease restriksi tipe II

adalah enzim pemotong yang begitu penting dalam klonong gen.

2. Endonuklease restriksi tipe II memotong DNA pada aturan nukleotid yang

spesifik

ciri utama endonuklease restriksi tipe II (yang selanjutnya akan di sebut

endonuklease saja) ialah bahwa tiap enzim mengenal urutan spesifik pada molekul

DNA yang akan di potong. Enzim tertentu akan memotong DNA pada urutan pengenal

dan tidak ada tempat lain. Sebagai contoh, endonuklease di sebut Pvil (diisolasi dari

proteus vul garis) memotong DNA hanya pada heksanukleotid CGATCG. Sebaliknya

enzim kedua dari bakteri yang sama, yang di sebut PvuII, memotong pada

hekssanukleotid yang berbeda, yaitu CAGCTG.

Banyak endonuklease restriksi mengenai tempat-tempat target heksanukleotid,

tetapi enzim-enzim lain memotong pada empat atau lima urutan nukleotid. Sau3A (dari

staphylococcus aureus staraing 3a) mengenal target GATC, dan ALU

(arthrobacterluteus) memotong pada AGCT.

Terdapat juga contoh-contoh endonuklease restriksi dengan degenarasi urutan

pengenalan, yang berarti bahwa enzim ini dapat memotong DNA pada tempat-tempat

urutan dengan jenis nukleotid yang berkaitan. Hinf I (Haemophilus influenzae strain
Rf) mengenal urutan GANTC sehingga dapat memotong GAATC, GATTC, GAGTC

dan GACTC. Urutan restriksi bagi endonuklease yang sering digunakan dapat dilihat

dari tabel.

Tabel 1. Urutan pengenal untuk beberapa endonuklease restriksi yang paling sering
diguanakan
Enzim Organisme Urutan pengenal Ujung

tumpul/lengkat

EcoRI Escherichia coli GAATTC lengket

BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC lengket

Bgl I Bacillus globigii AGATCT lengket

PvuI Proteus Vulgaris CGATCG lengket

PvuII Proteus Vulgaris CAGCTG lengket

HindIII Haemophilus influenzae Rd AAGCTT lengket

HinfI Haemophilus influenzae Rf GANTC lengket

Sau 3A Staphylococcus aureus GATC lengket

AluI Arthrobacter luteus AGCT lengket

TaqI Thermus aquasticus TCGA lengket

HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC lengket

3. Ujung tumpul dan ujung lengket

Sifat yang tepat hasil pemotogan oleh endonuklease restriksi sangat penting

dalam mendesain eksperimen kloning gen. banyak endonuklease restriksi membuat

pemotongan untai ganda yang sederhana pada pertengahan urutan pengenal sehingga

meghasilkan ujung tumpul.

 Meskipun demikian sejumlah besar endonuklease restriksi memotong DNA

dengan cara yang agak berbeda. Pada enzim-enzim tersebut kedua untai DNA tidak

dipotong pada posisi yang tepat sama, tapi pemotongannya berbentuk zigzag atau

dengan belok tajam melampaui dua atau empat nukleotid, sehingga fragmen DNA yang

dihasilkan mempunyai tonjolan-tonjolan untai tunggal pendek pada tiap ujung. Ini di

sebut ujung lengket atau ujung kohesif karena pemasangan basa antara ujung-ujung ini

dapat melekatkan kembali molekul DNA. Satu ciri penting enzim-enzim yang

menghasailkan ujung lengket adalah bahwa endonuklease restriksi dengan urutan

pengenal yang berbeda dapat menghasilkan ujung lengket yang sama. BamHI dengan

urutan pengenal GGATCC dan BglII dengan urutan pengenal AGATCT adalah contoh-

contoh yang menghasilkan ujung lengket GATC. Ujung lengket yang sama juga

dihasilakn oleh Sau3A yang hanya mengenal tetranukleotid GATC. Fragmen DNA

hasil pemotongan oleh salah satu enzim tersebut dapat saling disambung, karena tiap

fragmen akan mempunyai ujung lengket yang komplementer.

Gambar 5. Ujung hasil pemotongan DNA dengan endonuklease yang berbeda

4. Frekuensi urutan pengenal pada suatu molekul DNA

Jumlah urutan pengenal bagi endonuklease restriksi tertentu pada molekul

DNA yang penjangnya diketahui dapat di hitung secara matematik. Suatu urutan

tetranukleotid (misalnya GATC seharusnya terdapat satu kali setiap 44 = 256 nukleotid

dan suatu heksanukleotid (misalnya GGATCC) satu kali setiap 46 = 4096 nukleotid.

Dengan kalkulasi ini dianggap bahwa nukleotid-nukleotid tersusun berurutan secara

acak dan bahwa keempat nukleotid yang bersama terdapat dalam proporsi yang sama

(kandungan GC = 50 %). Dalam praktek tidak satu pun anggapan ini beraku

sepenuhnya. Sebagai contoh, molekul DNA λ dengan panjang 49 kb seharusnya

mengandung sekitar 12 tempat pemotongan bagi endonuklease restriksi yang urutan

pengenalnya berupa heksanukleotida. Pada kenyataannya terdapat tempat-tempat

pengenalan yang kurang jumlahnya (6 tempat bagi BglII, 5 tempat untuk BamHI dan

hanya 2 untuk SalI). Hal ini mencerminkn bahwa kandungan GC λ kurang dari 50 %.

Disamping itu tempat-tempat restriksi tidak berjarak sama sepanjang molekul

DNA. Jika jarak antara tempat-tempat restriksi sama, maka di gesti dengan

endonuklease restriksi tertentu akan menghasilkan fragmen-fragmen yang ukurannya

kira-kira sama. Pada gambar menunjukkan fragmen-fragmen hasil pemotongan

DNA dengan BglII, BamII dan SalI. Pada masing-masing kasus terdapat penyebaran

ukuran–ukuran fragmen yang luas, yang menandakan bahwa nukleotid pada DNA

tidak tersusun secara acak.

Kesimpulan yang dapat di ambil dari gambar adalah bahwa walaupun

matematik dapat memberi gambaran tentang banyaknya tempat restriksi yang

diharapkan pada molekul DNA tertentu, tetapi hanya analisis eksperimental yang dapat

memberikan gambaran yang benar.

5. Melaksanakan digesti restriksi di dalam laboratorium

Sebagai suatu contoh, kita akan meninjau bagaimana melakukan digesti pada

sampel DNA (konsentrasi 125 ug/ml) dengan BglII.

Pertama, semua jumlah DNA yang diperlukan harus di ambil dengan pipet dan

dimasukkan dalam tabung percobaan. Banyaknya DNA yang digesti tergantung pada

sifat eksperimen; dalam hal ini kita akan mendigesti 2 mikrogram DNA λ yang

tergantung dalam 16 mikroliter sampel. Oleh karena itu, dipipet mikro yang sangat

akurat.

Unsur utama lain yang dibutuhkan untuk melakukan reaksi adalah

endonuklease restriksi yang diperoleh secara komersial sbagai larutan murni dengan

konsentrasi yang diketahui. tetapi, sebelum penambahan enzim, larutan yang

mengandung DNA harus disesuaikan agar memberikan kondisi yang tepat untuk

aktivitas enzim yang maksimal. Kebanyakan endonuklease restriksi akan berfungsi

secara memadai pada pH 7,4, tetapi enzim-enzim yang lain bervariasi dalam kekuatan

ionik (biasanya dari NaCl) dan konsentrasi Mg2+ (semua endonuklease tipe II

membutuhkan Mg2+ untuk berfungsi) yang diperlukan. Juga disarankan untuk

menambahkan senyawa pereduksi, seperti ditiotreitol, yang akan menstabilakn enzim

dan mencegah nonaktivitasnya. Membuat kondisi yang tepat untuk aktivitas enzim

adalah penting karena konsentrasi NaCl atau Mg2+ yang tidak tepat dapat menyebabkan

tidak saja penurunan aktivitas, tetapi dapat juga mengubah spesifikasi nzim, sehingga

memotong DNA terjadi pada urutan pengenal tambahan yang tidak baku.
 Komposisi buffer yang sesuai untuk BglII ditunjukkan pada tabel 2 buffer inia

adalah sepuluh kali konsentrasi kerja dan dapat diencerkan dengan menambahkan

campuran reaksi. Pada contoh ini volume akhir campuran reaksi menjadi 20 ul

sehingga untuk itu kita tambah 2 ul 10× buffer BglII pada 16 ul DNA yang telah ada.

Gambar 6. Melakukan digesti restriksi di laboratorium

Tabel 2. Melakukan digesti restriksi di laboratorium

komponen Konsentrasi

Tris-HCl, pH 7,4 500 mM

MgCl2 100 mM

NaCl 500 mM

Ditiotreitol 10 mM
 Endonuklease restriksi sekarang dapat ditambahkan. Secara konvensional, satu

unit enzim didefinisikan sebagai kuantitas yang diperlukan untuk memotong 1 ug DNA

dalam waktu satu jam, sehingga kita memerlukan 2 unit BglII untuk memotong 2 ug

DNA λ. BglII sering didapatkan dengan konsentrasi 4 unit/ul sehingga 0,5 ul akan

mencukupi unruk memotong DNA. Reagen dan bahan akhir dalam campuran reaksi

adalah 0,5 ul BglII + 1,5 ul air., sehingga dicapai volume akhir 20 ul.

Faktor terakhir yang perlu dipertimbangkan adalah temperatur inkubasi.

Kebanyakan endonuklease restriksi bekerja paling baik pada 37 °C, tetapi beberapa

memerlukan persyaratan yang berbeda. Sebagai contoh TaqI dimurnikan dari bakteri

yang di sebut thermus aquaticus yang biasanhya hidup pada temperatur yang sangat

tinggi dalam habitat seperti sumber air panas. Digesti restriksi dengan TaqI harus di

inkubasi pada suhu 65 °C untuk memperoleh aktivitas enzim yang maksimum.

Sesudah satu jam, restriksi harus sudah sempurna. Jika fragmen yang dihasilkan

akan digunakan dalam eksperimen kloning, maka enzim harus di rusak agar enzim ini

tidak mendigesti DNA lain yang mungkin di tambahkan pada tahap kemudian. Ada

eberapa cara untuk mematikan enzim yang salah satunya dengan inkubasi pada 70 °C

dalam waktu yang pendek sudah memadai selain itu digunakan ekstraksi fenol atau

penambahan EDTA (yang mengikat ion Mg2+ sehingga mencegah kerja endonuklease

restriksi).

6. Menganalisis hasil pemotongan endonuklease restriksi

Digesti restriksi akan menghasilkan sejumlah fragmen DNA dengan ukuran

yang tergantung pada posisi urutan pengenal yang tepat padda molekul DNA mula-

mula. Jelas bahwa diperlukan cara untuk menentukan jumlah ukuran dan fragmen bila

digunakan endonuklease restriksi dalam kloning gen. pemotongan molekul DNA

ditentukan dengan mengamati viskositas larutan. Pada larutan yang lebih kental

molekul DNA yang lebih besar akan menyebabkan molekul menjadi lebih kecil

sehingga pemotongan menyebabkan penurunan viskositaas. Meskipun demikian,

untuk menentukan jumlah dan hasil pemotongan dilakukan secara individual yang

lebih sukar.

1. Pemisahan molekul dengan elektroforesis

Molekul DNA, seperti protein dan senyawa biologis lain membawa molekul

listrik negatif. Akibatnya bila molekul DNA ditempatkan pada medan listrik maka

molekul DNA ini akan migraasi menuju kutub positif. Kecepatan migrasi bergantung

pada bentuk dan muatan listriknya. Kebanyakan molekul DNA mempunyai bentuk

dan muatan listrik yang hampir sama oleh karena itu fragmen-fragmen dengan ukuran

yang berbeda tidak dapat dipisahkan dengan elektroforesi standar. Namun, dapat di

pisahkan melalui elektroforesis gel. Makin kecil molekul molekul DNA maka semakin

cepat migrasinya melewati gel sehingga dapat memisahkan molekul DNA sesuai

dengan ukurannya.

Dalam prakteknya komposisi gel menentukan ukuran DNA yang dapat di

pisahkan. Untuk memisahkan molekul yang lebih kecil digunakan gel poliakrilamid

40 % yang sangat tipis (0,3 mm). dengan gel ini dapat dibedakan molekul-molekul

dengan perbedaan panjang hanya 1 nukleotid.

2. Menampakkan molekul DNA dalam gel

a. pengecatan.

Cara paling mudah untuk melihat hasil elektroforesis gel adalah dengan

pengecatan gel dengan senyawa yang menyebabkan DNA dapat dilihat. Etidium

bromid, yang telah dibahas didepan sebagai sarana untuk menampakkan DNA dalam

gradien CsCI, juga digunakan secara rutin untuk pengecatan DNA dalam agarose dan

poliakrilamid. Pita-pita yang menunjukkan posisi fragmen-fragmen dengan ukuran

berbeda dapat dilihat dengan jelas dibawah penyinaran ultraviolet setelah pengecatan

EtBr, asalkan terdapat DNA yag cukup.

b. Autografi DNA yang dilabel-radioaktif.

Kelemahan pada pengecatan dengan EtBr adalah terdapatnya keterbatasan

sensitivitas. Jika DNA yag terdapatnya keterbatasan sensitivitas. Jika DNA yang

terdapat kurang dari 25 ng tiap pita, maka tidak mungkin hasil dapat tampak dengan

pengecatan EtBr. Untuk DNA dalam jumlah yang kecil diperlukan cara deteksi yang

jauh lebih sensitif.

Gambar 7. Melihat pita-pita dalam gel agarosa dengan pngecetan Et-Br

 Autografi merupakan cara yag tepat. Jika DNA dilabel belum elektroforesis

dengan cara memasukkan penanda radioaktif dalam tiap molekul, maka DNA dapat

dilihat dengan meletakkan fotografi yang sensitif sinar-X di atas gel. DNA radioaktif

akan memasukkan film dan akan tampak gambaran pita-pita.Molekul DNA biasanya

dilabel dengan memasukkan nukleotid yang membawa isotop fosfor radioaktif. Ada

beberapa gen dan yang paling populer adalah translasi daerah-putus dan pengisian-

ujung. Translasi daerah-putus menunjukkan aktivitas polimer DNA I. Kebanyakan

sampel DNA yang memurnikan mengandung beberapa molekul yang mempunyai

daerah-putus meskipun preparasi telah dikerjakan dengan sangat hati-hati, sehingga

polimerase DNA I akan dapat melekat pada DNA dan mengkatalisis reaksi penggantian

untai. Reaksi ini membutuhkan suplai nukleotid. Jika satu di antara nukleotid ini dilabel

radioaktif, maka molekul DNA dengan sendirinya akan terlabel. Translasi daerah-putus

dapat digunakan untuk melabel setiap molekul DNA, tetapi pada keadaan tertentu juga

dapat menyebabkan pemotongan DNA. Pengisian-ujung adalah cara yang lebih halus

sehingga jarang menyebabkan kerusakan DNA, tetapi sayang hanya dapat untuk

melabel molekul DNA yang mempunyai ujung lengket enzim yang digunakan adalah

fragmen Klenow yang akan mengisi ujung lengket dengan mensintesis untai yang

komplementer. Seperti pada translasi daerah putus, jika reaksi pengisian-ujung

dilakukan dengan adanya nukleotid yang dilabel, maka DNA dengan sendirinya akan

menjadi terlabel.

Translasi daerah-putus dan pengisisan-ujung keduanya dapat melabel DNA

sampai suatu tingkat yang memungkinkan kuantitas yang sangat kecil dapat dideteksi

dengan autoradiografi. Pada kondisi yang ideal, 2 ng DNA pada tiap pita dapat terlihat.
Perkiraan ukuran molekul DNA

Elektroforesis gel akan memisahkan molekul DNA dengan ukuran yang berbeda, yaitu

molekul yang paling kecil akan melewati jarak yang paling besar menuju elektrode

positif. Jika ada beberapa fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda, misalnya hasil

suatu digesti ristriksi yang besar, maka suatu rangkaian pita-pita akan tampak pada gel.

Bagaimana ukuran fragmen-fragmen tersebut dapat ditentukan. Cara yang paling

akurat untuk menentukan adalah dengan menggunakan hubungan matematik antara

kecepatan migrasi dan berat molekul rumusnya adalah :

D = a- b (log M)

D adalah jarak migrasi, M adalah berat molekul, dan a serta b adalah konstante yang

tergantung pada kondisi elektroforesis.

Namun biasanya digunakan cara yang jauh lebih sederhana untuk

memperkirakan ukuran fragmen DNA, walaupun cara ini kurang tepat. Suatu digesti

restriksi standar, yang meliputi fragmen-fragmen yang telah diketahui ukurannya,

biasanya diikutkan dalam elektroforesis yang sedang dilakukan. Pada cara ini digesti

restriksi DNA λ sering dipakai sebagai penanda ukuran. Misalnya, HindIII memotong

DNA menjadi 8 fragmen dengan ukuran terkecil 125 pasangan basa sampai ukuran

terbesar 23 kb. Karena ukuran fragmen digesti ini diketahui, maka ukuran fragmen

pada digesti eksperimental dapat diperkirakan dengan membandingkan posisi-posisi

pita, dalam kedua jalur.

Pemetaan posisi tempat restriksi yang berbeda pada suatu molekul DNA

Tahap berikutnya dalam analisis restriksi adalah menyusun suatu peta yang
menunjukkan posisi relatif urutan pengenal bagi sejumlah enzim yang berbeda pada

molekul DNA. Hanya bila tersedia peta restriksi, maka dapat dipilih endonuklease

restriksi yang tepat untuk manipulasi pemotongan tertentu.

Untuk menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti

restriksi. Pertama, jumlah dan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh tiap-tiap

endonuklease restriksi harus ditentukan dengan elektroforesis gel, kemudian diikuti

pembandingan dengan ukuran penanda. Informasi yang didapat ini kemudian harus

disokong oleh hasil suatu rangkaian digesti ganda, yaitu DNA dipotong dengan dua

endonuklease restriksi secara bersamaan. Ada kemungkinan untuk melakukan digesti

ganda dalam satu tahap, bila kedua enzim mempunyai persyaratanyang sama terhadap

pH, konsentrasi ion Mg2+ , dan lain-lain. Pilihan lain ialah bahwa kedua digesti

mungkin harus dilakukan berurutan dengan menyesuaikan campuran reaksi setelah

digesti yang pertama untuk memberikan kondisi yang berbeda bagi enzim yang kedua.

Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan

memetakkan banyak restrisi. Keragu-raguan biasanya dapat dipecahkan dengan cara

digesti parsial yang dilakukan pada kondisi yang akan menghasilkan pemotongan

hanya pada sejumlah terbatas tempat restriksi dalam tiap molekul DNA. Digesti parsial

biasanya dicapai dengan periode inkubasi yang pendek sehigga enzim tidak sempat

memotong semua tempat restriksi, atau dengan inkubasi pada temperatur rendah yang

akan membatasi aktivitas enzim. Hasil digesti parsial akan berupa pola pita-pita yang

kompleks dalam gel elektroforesis. Selain fragmen-fragmen standar, yang dihasilkan

dari digesti total, akan terlihat ukuran-ukuran tambahan. Molekul dengan ukuran

tambahan tersebut merupakan molekul yang meliputi dua fragmen restriksi yang
berdekatan, yang dipisahkan oleh suatu tempat yang belum terpotong. Ukuran-

ukurannya akan menunjukkan fragmen-fragmen restriksi mana pada digesti sempurna

yang letaknya berdampingan dala molekul yang tidak terpotong

Ligasi – penyambugan molekul DNA

Tahap terakhir dalam penyusunan molekul DNA rekombinan adalah

menyambung molekul vektor dan molekul DNA yang aka diklon. Proses ini disebut

ligasi dan enzim yang mengkatalisis reaksi disebut ligase DNA.

Cara kerja ligase DNA

Semua sel hidup menghasilkan ligase DNA, tetapi enzim yang dipakai dalam

rekayasa genetik biasanya dimurnikan dari E.coli yang tlah di infeksi dengan fag T4.

Di dalam sel, enzim ini melaksanakan fungsi yang sangat penting dalam reparasi tiap

diskontinyuitas yang mungkin timbul pada salah satu untai pada molekul untai-ganda.

Diskontinyuitas sebenarnya hanya merupakan posisi tempat ikatan fosfodiesien antara

nukleotid yang berurutan terputus. Walaupun diskontinyuitas dapat terjadi pada waktu

pemecahan DNA sel, hal ini juga dapat terjadi akibat proses-proses seperti replikasi

dan rekombinasi DNA. Oleh karena itu ligase memegang peran yang vital di dalam sel.

Di dalam tabung percobaan, ligase DNA yang dimurnikan, disamping

mereparasi diskontiyuitas juga akan menyambung molekul DNA secara individual atau

menyambung kedua ujung molekul yang sama. Reaksi kimia pada ligasi dua molekul

sama dengan reparasi diskontinyuitas, kecuali bahwa pada penyambugan dua molekul

harus dibuat dua ikatan fosfodiester, satu untuk tiap untai. Ujung-ujung lengket

meningkatkan efisiensi ligasi.

 Ligasi ujung-ujung lengket yang komplementer jauh lebih efisien. Ini

disebabkan karena ujung –ujung lengket yang cocok dapat saling berpasangan basa

dengan ikatan hidrogen untuk membentuk struktur yang relatif stabil sehigga enzim

dapat bekerja. Jika ikatan fosfodiester tidak disintesis dengan cepat, maka ujung-ujung

legket akan terpisah lagi. Meskipun demikian pasangan-basa sementara tersebut

meningkatkan efisiensi ligasi dengan memperpanjang waktu kontak antara ujung-

ujung molekul.

Menempatkan ujung-ujung lengket pada molekul berujung tumpul

Karena alasan-alasan seperti yang telah diterangkan sebelumnya, dipertemukan

ujung-ujung lengket yang cocok pada molekul DNA untuk disambung pada percobaan

kloning gen. Seringkali ujung-ujung lengket tersebut dapat diperoleh dengan

mendigesti molekul vektor dan DNA yang akan diklon dengan endonuklease restriksi

yang sama, atau dengan enzim yang berbeda yang menghasilkan ujung lengket yang

sama. Namun tidak selalu dimungkinkan untuk melakukan hal ini. Keadaan yang biasa

dihadapi adalah molekul vektor berujung lengket, tetapi fragmen DNA yang akan

diklon berujung tumpul. Pada keadaan seperti ini dapat digunakan satu di antara tiga

cara untuk menempatkan ujung lengket yang tepat pada fragmen DNA.

(1) Penghubung (linker)

Cara yang pertama adalah dengan menggunakan penghubung. Penghubung

adalah DNA untai-ganda pendek yang tlah diketahui urutan nukleotidanya dan dibuat

dalam tabung percobaan. Suatu penghubung yang khas memiliki ujung tumpul, tetapi

mengandung satu tempat restriksi dalam contoh BamHI. Ligasi DNA akan meletakkan
penghubung pada ujung-ujung molekul DNA berujung tumpul yang lebih besar.

Walaupun merupakan ligasi ujung-tumpul, reaksi ini dapat dilakukan secara efisien

karena oligonukleotid sintetik, seperti penghubung, dapat dibuat dalam jumlah yang

besar dan dapat ditambahkan dalam campuran reaksi ligasi dengan konsentrasi tinggi.

Lebih dari satu molekul penghubung akan melekat pada tiap ujung molekul

DNA sehingga menghasilkan struktur rantai. Namun digesti dengan BamHI akan

memotong rantai pada urutan pengenal dan menghasilkan banyak molekul penghubung

yang terpotong dan fragmen DNA mula-mula yang sekarang membawa ujung lengket

BamHI.

(2) Adaptor

Cara kedua untuk meletakkan ujung lengket pada molekul berujung tumpul

adalah dengan penggunaan adaptor. Seperti halnya molekul penghubung, adaptor

merupakan oligonukleotid sintetik yang pendek. Tetapi berbeda dengan penghubung

adaptor disintesis sedemikian rupa sehingga memiliki satu ujung tumpul dan satu ujung

lengket. Hal ini bertujuan untuk menyambung ujung tumpul adaptor dengan ujung

tumpul fragmen DNA, sehingga dihasilkan molekul baru dengan ujung lengket.

Gambar

Cara ini tampaknya lebih sederhana daripada meletakkan molekul penghubung,

tetapi terdapat kesulitan pada penggunaan adaptor. Ujung lengket tiap molekul adaptor

dapat saling membentuk pasangan basa sehingga terjadi dimber, sedemikian sehingga

molekul DNA yang baru masih tetap berujung tumpul. Ujung lengket dapat diciptakan
kembali dengan cara digesti memakai endonuklease restriks tetapi hal ini menyimpang

dari tujuan mula-mula dalam mensistensi adaptor dengan ujung lengket.

(3) Membuat ujung lengket dengan pembentukan ekor homopolimer

Teknik pembentukan ekor homopolimer merupakan cara yang sama sekali

berbeda untuk membuat ujung lengket pada molekul DNA berujung tumpul. Suatu

homopolimer adalah polimer yang semua subunitnya sama. Untai DNA yang

seluruhnya terdiri atas deoksiguanosin merupakan contoh homopolimer dan disebut

polideoksiguanosin atau poli (dG).

Dalam praktek ekor poli (dG) dan poli (dC) biasanya tidak selalu sama panjang

dan molekul rekombinan yang berpasangann-basa akan mempunyai daerah-putus

maupun diskontinyuitas. Dengan demikian reparasi merupakan proses dua-tahap,

dengan menggunakan polimerase Klenow untuk mengisi daerah-putus diikuti dengan

ligase DNA untuk mensintesis ikatan fosfodiester terakhir. Reaksi reparasi ini tidak

selalu harus dilakukan dalam tabung percobaan. Jika eko homopolimer yang

komplementer lebih panjang dari 20 nukleotid, maka aka terbentuk hubungan pasang-

basa yang agak stabil. Molekul DNA rekombinan, yang dihubungkan oleh pasangan

basa walaupun yang tidak digabung secara sempurna, sering cukup stabil untuk dapat

dimasukkan ke dalam sel tuan rumah pada tahap selanjutnya dalam percobaan kloning.

Setelah berada dalam sel tuan rumah, polimerase DNA dan ligase DNA dalam sel

sendiri akan melakukan reparasi molekul DNA rekombinan untuk menyempurnakan

penyusunan yang telah dimuat dengan tabung percobaan.