TRANSFORMASI GENETIK AGROBACTERIUM

DARI POGOSTEMON CABLIN (BLANCO) BENTH.

MENGGUNAKAN EKPLANS DAUN : EFEK BAKTERISIDAL
EKSTRAK DAUN DAN STRATEGI PENANGGULANGAN

Anamika Paul & Souvika Bakshi & Debee Prasad Sahoo & Mohan Chandra Kalita & Lingaraj Sahoo
Diterima: 22 Juli 2011 / Diterima: 13 Februari 2012 /
Diterbitkan online: 21 Maret 2012
# Springer Science + Business Media, LLC 2012

Abstrak
Protokol yang dioptimalkan untuk transformasi yang dimediasi Agrobacterium tumefaciens dari
patchouli menggunakan eksplan daun disk dilaporkan. Aktivitas antibakteri in vitro dari ekstrak daun
dari tanaman mengungkapkan kepekaan Agrobacterium ke ekstrak. Uji Fluorometri dari viabilitas sel
bakteri menunjukkan aktivitas sitotoksik tergantung dosis dari ekstrak kalus terhadap Sel
agrobacterium. Penambahan 0,1% Tween 20 dan 2 g / l L-glutamine ke Agrobacterium media infeksi
menetralkan efek bakterisida dan secara signifikan meningkatkan T-DNA pengiriman ke eksplan.
Eksplan precan pendek selama 2 hari diikuti oleh infeksi Agrobacterium dalam medium yang
mengandung 150 μM acetosyringone ditemukan penting untuk pengiriman T-DNA yang efisien.
Cocultivation selama 3 hari pada 22 ° C dalam hubungannya dengan lainnya faktor dioptimalkan
menghasilkan pengiriman T-DNA maksimum. Agrobacterium-dimediasi transformasi eksplan daun
cakram ditemukan secara signifikan terkait dengan usia fisiologis dari eksplan, usia dan asal tanaman
donor. Eksplan daun dari simpul kedua tanaman in vivo 3 bulan menunjukkan efisiensi transformasi
tertinggi (94,3%) terungkap dengan uji ekspresi GUS transient. Tanaman dipilih pada media yang
mengandung 20 mg / l kanamisin menunjukkan ekspresi GUS yang stabil pada daun dan batang.
Tunas memanjang dengan mudah mengembangkan akar pada media rooting kanamycin bebas dan
pada transfer ke tanah, tanaman itu berhasil didirikan. Polymerase chain reaction (PCR) dan PCR
reverse-transcriptase analisis di tanaman putatif menegaskan sifat transgenik mereka. Transformasi
yang mapan metode harus memberikan peluang baru untuk perbaikan genetik nilam untuk sifat yang
diinginkan.

Kata kunci Agrobacterium. Disk daun. L-glutamine. Patchouli. Usia fisiologis. Tween 20

Appl Biochem Biotechnol (2012) 166: 1871–1895 DOI 10.1007 / s12010-012-9612-0 A. Paul: S.
Bakshi: D. P. Sahoo: L. Sahoo (*) Departemen Bioteknologi, Institut Teknologi India Guwahati,
Guwahati 781039 Assam, India e-mail: ls@iitg.ernet.in A. Paul: M. C. Kalita Departemen Bioteknologi,
Universitas Gauhati, Guwahati 781014 Assam, India

pengantar

Transformasi yang dimediasi oleh Agrobacterium adalah metode yang disukai untuk
transformasi tanaman karena kesederhanaannya, efektifitas biaya, integrasi transgen yang
didefinisikan, jumlah salinan yang berpotensi rendah, sedikit pengaturan ulang transgen,
kemampuan untuk mentransfer segmen DNA yang relatif lebih panjang, dan integrasi
preferensial ke daerah transkripsi dari kromosom aktif [1-4]. Agrobacterium-dimediasi Metode
transformasi telah berhasil digunakan untuk menghasilkan transgenik tanaman di sejumlah
besar spesies tanaman. Patchouli [Pogostemon cablin (Blanco) Benth] adalah spesies
tanaman aromatik yang penting yang berasal dari Asia dan telah dibudidayakan di banyak
bagian dunia untuk ekstraksi minyak esensial dari daunnya. Manipulasi genetik dari patchouli
melalui transformasi yang dimediasi Agrobacterium memberikan peluang untuk peningkatan
kandungan minyak esensial dan perlindungan terhadap penyakit [5]. Di nilam, eksplan daun
telah ditransformasikan dengan Agrobacterium tumefaciens LBA4404 menyimpan virus
mosaik lumut patchouli melapisi protein prekursor (CP-P) gen, β-glucuronidase (gus), dan
neomisin phosphotransferase (npt) gen [6], dan EHA101 menyimpan gen gus dan
hygromycin phosphotransferase (hpt) [7]. Meskipun Ping dkk. [8] melaporkan transformasi
genetik nilam dengan Agrobacterium rhizogenes dan regenerasi tanamannya dari akar
rambut, namun, eksplan daun di nilam tetap terutama bandel untuk A. tumefaciensinfection
dan karena itu, transformasi prosedur sebagian besar tidak efisien, bergantung pada
laboratorium, dan jauh dari rutinitas [5]. Agaknya, itu eksudasi senyawa aromatik bakterisida
pada eksplan daun dan kurangnya penelitian tentang penangkalan efek ini telah
memperlambat perkembangan transformasi Agrobacterium-mediated yang efisien sistem di
patchouli [5]. Aktivitas antibakteri dari ekstrak daun nilam melawan bakteri patogen manusia
telah dilaporkan sebelumnya [9]. Namun, belum ada penelitian dilakukan untuk mengetahui
pengaruh ekstrak daun pada Agrobacterium dan proses untuk meningkatkan kerentanan
daun eksplan terhadap infeksi Agrobacterium. Agrobacterium-dimediasi transformasi genetik
adalah proses multistep yang dimulai dengan pengenalan dan merasakan sel inang yang
terluka oleh Agrobacterium yang mematikan diikuti oleh keterikatannya dan berakhir dengan
ekspresi TDNA-nya terintegrasi dalam genom sel yang berubah [10]. Meskipun induksi gen
vir oleh molekul yang dipancarkan oleh tanaman itu penting, hubungan yang intim antara
Agrobacterium dan sel tuan rumah melalui lampiran tertentu merupakan prasyarat untuk
pengiriman T-DNA yang sukses [11]. Selanjutnya, tahap perkembangan eksplan dan
prakondisinya, serta kokultivasi kondisi seperti durasi kokultivasi, suhu, dan kehadiran
induser gen vir dapat secara signifikan mempengaruhi efisiensi transformasi tanaman
rekalsitran [12]. Untuk mendapatkan pengiriman T-DNA yang optimal ke eksplan daun nilam
dan membentuk suatu transformasi Agrobacterium-dimediasi efisien, kami menyelidiki efek
patchouli ekstrak daun pada viabilitas sel Agrobacterium, peran L-glutamine dalam
menangkal efek bakterisida dan optimalisasi faktor-faktor penting seperti keadaan fisiologis
eksplan, umur dan asal dari pabrik donor, prekondisi eksplan, dan kondisi kokultivasi
pada transformasi yang dimediasi Agrobacterium.

Bahan dan metode

Penilaian Sitotoksisitas Patchouli pada Sel Agrobacterium Bahan Tanaman dan
Persiapan Ekstrak Daun Berair dan Beralkohol dari Patchouli Budaya aseptik dari varietas
nilam Indonesia dibuat menggunakan segmen daun seperti yang dijelaskan sebelumnya di
laboratorium kami [5]. Setelah dua subkultur masing - masing 4 minggu, daun sepenuhnya
diperluas dari node kedua dan ketiga dari tanaman baik dari in vitro dan in vivo asal
regenerasi digunakan sebagai eksplan untuk induksi dan transformasi kalus.
Daun segar tanaman nilam yang ditanam di lapangan (berumur 8 bulan) dicuci
dengan air, udara dikeringkan pada suhu kamar, dan kemudian direduksi menjadi bubuk
kasar. Sepuluh gram masing-masing serbuk daun diekstraksi dengan air suling atau metanol
oleh menggunakan peralatan ekstraksi soxhlet untuk jangka waktu 7 jam [13]. Ekstrak
disaring dan filtrat terkonsentrasi di bawah tekanan yang dikurangi untuk mendapatkan
ekstrak sebagai residu padat. Larutan stok dari ekstrak kasar disiapkan dalam
dimethylsulphoxide (DMSO) di final konsentrasi 100 mg / ml dan disimpan pada 4 ° C untuk
digunakan lebih lanjut.

Induksi Kalus dan Persiapan Ekstrak Kalus

Daun disk diinkubasi pada medium MS [14] dilengkapi dengan konsentrasi yang berbeda
benzylaminopurine (BAP; 1, 2.5, dan 5 mg / l) atau dalam kombinasi dengan acetic
napthalene acid (NAA) atau Indole-3-acetic acid (IAA) (1, 2.5, 5 mg / l) untuk efeknya pada
pembentukan kalus dari eksplan daun. Semua media kultur ditambah dengan sukrosa 3% (b
/ v) dan 0,8% (w / v) agar-agar (Hi-media, Mumbai, India). PH medium telah disesuaikan 5.8
sebelum autoklaf pada 15 psi dan 121 ° C selama 20 menit. Semua budaya dipertahankan di
25 ± 2 ° C di bawah fotoperiode 16-jam dengan kerapatan fluksi foton fotosintesis 35 μmol
m − 2 s −1 disediakan oleh tabung fluorescent putih dingin (Philips, India).
Kalus dikumpulkan, dicuci dalam air suling, dan dikeringkan dalam oven pada suhu
30 ± 2 ° C untuk mencegah dekomposisi termal dari metabolit. Massa sel kering (10 g)
direndam dalam metanol selama 48 jam, setelah sel-sel disonikasi selama 30 menit pada
30% amplitudo (pulser 5 s on / off) dan kemudian selama 10 menit lagi pada amplitudo yang
sama (pulser 3 s on / off). Campuran disentrifugasi dalam centrifuge berpendingin
berkecepatan tinggi (Sigma, 3 K30, Osterode Am Harz, Jerman) pada 10.000 rpm selama 10
menit. Supernatan itu dikumpulkan, dikeringkan dalam putaranevaporator pada 40 ° C, dan
ekstrak difraksinasi menjadi berair dan organik (etil asetat) fraksi. Ekstrak berair diliofilisasi
dalam pengering beku dan digunakan untuk penelitian lebih lanjut.
Persentase hasil ekstrak air dihitung relatif terhadap berat sel kering. Ekstrak cair
lyophilized dilarutkan dalam DMSO untuk menyiapkan larutan stok 100 mg / ml, dan
disterilkan dengan penyaringan melalui filter syringe ukuran pori 0,2 μm (Acrodisc), sebelum
digunakan.

Disk Diffusion Assay

Viabilitas bakteri dipantau dengan uji difusi disk. Sensitivitas A. tumefaciens EHA105 untuk
ekstrak daun dan ekstrak kalus dari patchouli dipastikan oleh metode difusi cakram agar
standar [15] disetujui oleh Komite Nasional untuk Standar Laboratorium Klinis (sekarang
disebut Standar Klinis dan Laboratorium Institut) [15, 16] dan digunakan untuk menentukan
konsentrasi penghambatan minimum (MICs) ekstrak nilam melawan A. tumefaciens yang
dibiakkan di Luria Bertani (LB) sedang [16, 17]. Inokulum bakteri diperoleh dari biakan yang
ditanam semalaman di 28 ° C dan diencerkan dengan medium LB untuk mendapatkan
konsentrasi akhir 106 kolonimembentuk unit per mililiter sesuai prosedur standar. Inokulum
yang sesuai adalahdiunggulkan dalam LB agar dalam cawan Petri. Sterilisasi disk kertas
saring (diameter 5 mm)diresapi, di bawah kondisi aseptik, dengan ekstrak pada konsentrasi
yang berbeda (1, 5, 10, 15,20, dan 25 mg / ml) dan diaplikasikan pada permukaan agar biji.
Aktivitas antibakteri dari ekstrak dinyatakan dalam arti rata-rata diameter zona inhibisi
(dalam milimeter) sekitar disk yang diproduksi setelah 24 jam inkubasi pada 28 ° C. Sebagai
kontrol positif atas pertumbuhan inhibisi, antibiotik standar (streptomisin, 1 mg / ml DMSO)
digunakan. Solusi DMSO digunakan sebagai kontrol negatif untuk mempelajari pengaruh
pelarut. Semua eksperimen itu dilakukan dalam rangkap tiga.

Konsentrasi Hambat Minimal

MIC ditentukan oleh metode pengenceran tabung kaldu. Serangkaian pengenceran
dengan Konsentrasi mulai dari 25 hingga 0,15 mg / ml digunakan dalam percobaan dengan
ekstrak yang menunjukkan zona maksimum inhibisi dalam uji sensitivitas antimikroba. Itu
larutan awal ekstrak dengan konsentrasi 25 mg / mL diperoleh dengan mengukur dari
sejumlah ekstrak tertentu dan melarutkannya dalam DMSO. Pengenceran dua kali ekstrak
disiapkan dalam medium LB untuk kultur bakteri dalam tabung reaksi. MIC untuk A.
Tumefaciens EHA105 dihitung sebagai konsentrasi ekstrak terendah yang menghambat
yang terlihat pertumbuhan strain bakteri. Sebagai kontrol positif untuk penghambatan
pertumbuhan, streptomisin adalah bekas. Kontrol negatif dari pengaruh pelarut diwujudkan
secara paralel. Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.

Pemeriksaan Flurometri Viabilitas Sel Bakteri

A. tumefaciens EHA105 dikultur dalam medium LB dengan menginokulasi satu koloni
menjadi 2 ml medium cair. Budaya dibangkitkan oleh agitasi pada 200 rpm pada rotary
shaker di 28 ° C selama 1 hari. Selanjutnya, 2 ml kultur bakteri dalam fase log dipindahkan
hingga 50 ml media cair LB yang mengandung konsentrasi kalus yang berbeda ekstrak (1,
5,7,5,10,12,5, 15 mg / ml) dan diinkubasi seperti yang disebutkan di atas. Kultur
Agrobacterium yang diteliti diperiksa untuk viabilitas selnya setelah inokulasi dengan ekstrak
pada berbagai konsentrasi dengan carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (cFDA-
SE) [18] dan metode pewarnaan propidium iodida (PI) [19]. Sel agrobacterium dipulihkan
dengan sentrifugasi pada 8.000 rpm selama 2 menit. Pelet sel dicuci dua kali dengan saline
fosfat-buffered steril (PBS) dan diberi label dengan cFDA-SE (final konsentrasi 50 μM; Tuan
557.46; Sigma-Aldrich, USA) pada 37 ° C selama 20 menit. Penghentian reaksi pelabelan
dilakukan dengan pelleting dan pencucian sel bakteri dua kali dengan buffer fosfat untuk
menghilangkan molekul cFDA-SE berlebih. Itu sel yang berlabel diresuspensi dalam buffer
steril dan difiksasi dalam 1,5% glutaraldehid untuk 1 jam diikuti oleh pencucian dan
resuspending dalam buffer fosfat. Integritas dari membran sel yang diolah ditentukan dengan
menggunakan DNA binding dye (PI). SEBUAH 1.5 larutan stok mM PI berat molekul relatif
(Mr 557.46; Sigma-Aldrich, USA) disiapkan dalam air MilliQ steril dan disimpan pada suhu 4 °
C. Sel target dicuci dua kali dengan PBS steril dan PI ditambahkan ke sel pada konsentrasi
akhir 30 μM. Setelah 10 menit inkubasi pada 37 ° C dalam inkubator air sirkulasi (Julabo F-
12- MB, Siskin Instruments, Jerman), sampel disentrifugasi dan dicuci dua kali dengan buffer
fosfat untuk menghilangkan pewarna berlebih. Sel yang berlabel diresuspensi dengan steril
buffer dan difiksasi dalam 1,5% glutaraldehid selama 1 jam diikuti dengan pencucian dan
resuspending dalam buffer fosfat
Seratus mikroliter dari suspensi sel berlabel tersebar pada slide kaca dan diamati di
bawah mikroskop Nikon Eclipse Ti-U (Nikon, Jepang) yang dilengkapi dengan Nikon
Intensilight Sistem penerangan serat C-HGFi (Nikon, Jepang) diprogram untuk eksitasi pada
495 nm dan emisi pada 520 nm untuk cFDA-SE, dan eksitasi pada 536 nm dan emisi di 617
nm untuk PI. Cahaya mikroskopis dan gambar fluoresen diperoleh menggunakan Nikon
Digital Sight DS-Ri1camera (Nikon, Jepang) melekat pada mikroskop.

Transformasi Nilam
Agrobacterium Strain dan Transformasi Vektor
The A. tumefaciens strain EHA105 [20] mengandung vektor biner pCAMBIA2301
(Gbr. 1) digunakan dalam semua percobaan. Vektor mengandung phosphotransferase
neomisin (NptII) gen untuk seleksi tanaman di bawah antibiotik aminoglikosida seperti
kanamisin, dan gus, keduanya didorong oleh promotor mosaik virus 35S (Gambar 1). Sejak
vektor pCAMBIA2301 berisi gen gusA chimeric dengan intron tanaman, yang tidak bisa
diekspresikan dalam A. tumefaciens, sehingga membuatnya menjadi alat yang berguna
untuk mempelajari pengiriman gen [21]. Strain A. tumefaciens dipertahankan pada media
YEP padat [22] dilengkapi dengan 10 mg / l rifampisin, dan 50 mg / l kanamisin.

Pengaruh L-glutamine pada Pertumbuhan Agrobacterium

Budaya cair A. tumefaciens EHA105 dibesarkan seperti yang dijelaskan sebelumnya dan
2 ml kultur bakteri dipindahkan ke 50 ml media LB yang mengandung kanamisin (25 mg / l),
dan konsentrasi L-glutamine yang berbeda (0,5, 1,0, dan 2,0 g / l) di hadapan penghambatan
dan / atau konsentrasi yang lebih tinggi dari ekstrak kalus nilam (10,0, 12,5, dan 15,0 mg /
ml) sebelum inkubasinya. Sedang tanpa ekstrak daun dan L-glutamine dandengan ekstrak
daun berfungsi sebagai kontrol. Kelangsungan sel bakteri diperkirakan oleh cFDA-SE [18]
dan metode pewarnaan PI [19].

Prosedur Transformasi
Sebuah loopful A. tumefaciens diinokulasi ke dalam 25 ml medium cair AB [23] yang
mengandung10 mg / l rifampicin dan 50 mg / l kanamisin dan ditanam pada rotary shaker,
pada 200 rpm,selama 24 jam pada 28 ° C, hingga OD600 mencapai 1,0. Sel-sel bakteri
dipanen oleh sentrifugasi pada 5.000 rpm selama 5 menit dan disuspensi dalam media
infeksi cair, LIM (medium MS setengah kekuatan ditambah dengan 100 μM asetosypringone,
pH 5,5). Untuk menguji efek menguntungkan dari adsorben dan surfaktan polifenol
Agrobacterium menempel pada eksplan, konsentrasi L-glutamine yang berbeda (0,5, 1,0,1,5,
2,0, dan 2,5 g / l) ditambahkan ke LIM dan Tween 20 (0,01%, 0,1%, dan 1% v / v)
ditambahkan ke LIM yang mengandung 2,0 g / l L-glutamine. Eksplan daun dengan atau
tanpa prakultur direndam dalam suspensi bakteri mengandung 100 μM acetosyringone
dalam cawan petri 90 mm dan diaduk selama 30 menit dengan gemetar lembut pada 25 ° C.
Eksplan terinfeksi kemudian dikeringkan pada kertas saring steril dan dibudidayakan pada 25
° C pada MSM (media MS dilengkapi dengan 2,5 μM BAP dan 0,5 μM NAA) ditambah
dengan 2,0 g / l L-glutamine.

Gbr. 1