Dasar-dasar Bioteknologi-4

Dasar-dasar Pengklonan gen

Drs. Sutarno, MSc., PhD.
DASAR-DASAR PENGKLONAN GEN

 Pengklonan gen mempunyai beberapa tujuan:

 memperoleh gen sebagai penelusur

 mendapatkan gen untuk dianalisis urutan

nukleotidanya
 mendapatkan gen untuk diekspresikan pada
sel inang.
 Tahap-tahap dalam pengklonan gen:

1. Membuka sel hidup.  untuk sel mammalia, biasanya

dg memblender sel kemudian ditambahkan deterjen.
2. Mengambil informasi genetik (DNA) dari sel, dengan
teknik pemurnian DNA,
3. Mememotong gen khusus yang diinginkan dengan
Enzim Restriksi.
4. Menempatkan potongan khusus DNA ke dalam
perantara yang disebut cloning vehicle (vektor) yg
akan membawa potongan DNA ke dalam sel hidup
lain. Vektor  molekul DNA yg relatif pendek yang
dapat memasuki sel dan memperbanyak diri di dalam
sel. Penyambungan menghasilkan molekul DNA
kimera (rekombinan/ vektor rekombinan).
 Tahap-tahap dalam pengklonan gen:

5. Vektor yg mengandung potongan khusus DNA

dimasukkan ke dalam sel inang, biasanya
organisme monoselluler seperti bakteri atau
ragi.
6. Membiarkan sel inang untuk memperbanyak diri
membentuk klon sel identik yang jumlahnya
sangat besar. Di dalam sel inang, vektor
rekombinan memperbanyak diri sehingga gen
yg tersisip juga mengalami amplifikasi. Bila sel
inang memperbanyak diri, gen tersisip pada
rekombinan vektor juga mengalami
penggandaan diri.
 Skema rekombinan DNA
Sumber DNA Vektor kloning

DNA target
Linearisasi enzimatik
Fragmentasi enzimatik

DNA vektor

Gabungkan DNA target dengan

Vektor kloning

DNA construct
Masukkan ke sel host

Pisahkan sel yg mengandung insert

Sel host (eg. Bakteri)

Produksi protein

Protein yg dikodekan
oleh insert gen
 VEKTOR UNTUK KLONING
MOLEKULER
 Vektor: pembawa molekul DNA dlm proses
pengklonan gen.
 Vektor yang biasa digunakan: Plasmid, Fage,
kromosom buatan dr khamir (YAC= yeast
artificial chromosome), dan Cosmid.
 Plasmid biasa digunakan untuk membawa
molekul DNA berukuran kecil, sedangkan untuk
molekul DNA yang besar digunakan fage,
cosmid atau YAC.
VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER
1. PLASMID
 Merupakan DNA utas ganda sirkuler berukuran kecil yg
terdapat di dlm sitoplasma dan dpt melakukan replikasi
secara otonom.
 Ciri penting plasmid:
 1. Dapat melakukan replikasi,
 2. Tdp diluar kromosom ,
 3. Secara genetik dpt ditransfer secara stabil.
 Tdp secara alami maupun sudah mengalami modifikasi
yg disesuaikan dg keperluan didlm manipulasi genetik.
 Satu sel dpt mengandung lebih dr satu kopi.
 Plasmid tdp dlm sitoplasma prokryot maupun eukaryot
seder hana uniselluler. Selain pada bakteri, plasmid
juga tdp pd Saccharomyces cereviceae.
 Plasmid dikelompokkan berdasarkan sifat yang disandi
oleh gen yg dikandungnya:
 Plasmid F (fertilitas) membawa gen tra, yg
bertanggung jawab thd proses konjugasi
 Plasmid R (resistensi) mengndung gen resistensi
thd antibiotik atau logam berat
 Plasmid yg mengandung gen penyandi toksin dan
bakteriosin, seperti ColE1 dari E.coli.
 Plasmid degradatif yg mempunyai kemampuan utk
melakukan metabolisme molekul organik spt toluen
(TOL dr Pseudomonas putida).
 Plasmid virulensi: yg bertanggung jawab thd
patogenositas dr sel inang (pTi pd Agrobacterium
tumefaciens).
 Untuk replikasi, plasmid dpt dlm keadaan: terpisah
dari kromosom (non-integratif), dan ada yg
terintegrasi ke dlm kromosom bakteri (episom).
 Untuk kloning gen, plasmid yg ideal bersifat:
 a). berukuran kecil,
 b). minimal memiliki satu situs penyisipan yg mudah
diidentifikasi, dan
 c). membawa sifat yg mudah utk seleksi bagi inang yg
mengandungnya.
 Efisiensi transformasi berbanding terbalik dengan
ukuran plasmid, semakin kecil ukuran plasmid
efisiensi transformasi semakin besar.
VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER
2. FAGE
 Fage atau bakteriofage adalah virus yg
menginfeksi bakteri.
 Struktur fage sangat sederhana, tersusun dr
molekul DNA yg membawa beberapa gen dan
molekul protein yg membungkusnya yg disebut
dg Kapsid.
 Tdp 2 macam siklus hidup fage:
 1). Siklus litik, dan
 2). Siklus lisogeni.
 Siklus litik diakhiri dg pelepasan fage baru dr
bakteri inang karena tjd lisis, sedangkan pd
lisogeni, DNA fage tersisip di dlm kromosom
bakteri yg berfungsi sgb sel inangnya.
VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER
3. COSMID
 Vektor yg diturunkan dr plasmid yg
mengandung ujung kohesif (cos) dari fage .
 Merupakan molekul DNA hibrid antara fage dan
plasmid bakteri.
 Di dlm bakteri, cosmid membentuk molekul
sirkuler spt halnya plasmid, dan tdk dapat
melisis sel ingnya krn tidak (atau sedikit sekali)
mengandung gen .
VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER
4. KROMOSOM BUATAN KHAMIR (YEATS
ARTIFICIAL CHROMOSOME, YAC).

 Diperlukan dalam pengklonan DNA yg

ukurannya besar.
 Pada beberapa gen eukaryot, tdp gen yg
ukurannya sangat besar seperti Cyztic fibrosis
pada manusia yg besarnya 240kb, sehingga
baik plasmid, fage maupun cosmid tidak bisa
digunakan sebagai vektor.
 INTRODUKSI VEKTOR KE DALAM
SEL INANG
 Agar dapat mengalami penggandaan, vektor
rekombinan diintroduksikan ke dalam sel inang.
Penggandaan vektor  DNA tersisip juga
mengalami penggandaan  klon dari DNA
sisipan.
 Introduksi vektor rekombinan dibedakan
menjadi 2:
 1. Transformasi, bila vektor yg digunakan
adalah plasmid, dan
 2. Transfeksi, bila virus dan turunannya yg
digunakan sebagai vektor.
 Transformasi pd bakteri biasa dilakukan dengan
menggunakan bahan kimia atau menggunakan
aliran listrik (fisik).
 Agar DNA bisa masuk dlm bakteri, dinding dan
membran bakteri dibuat sedemikian rupa shg DNA
dapat melewati membran (rentan  kompeten),
dengan penambahan kation Ca atau Mg dan
penambahan detergen (eg Triton X). Kombinasi
perlakuan kimia dan fisik seperti heat shock pada
suhu 42oC selama 1-2 menit sering dilakukan.
 Kejutan listrik (elektroporasi) dg tegangan tertentu
dlm waktu relatif singkat, membran sel inang akan
terbuka membentuk pori.
 Cara lain utk sel eukaryot transfer gen secara
langsung dengan menggunakan protoplast dan
mikroinjeksi.
Contoh Kloning
pd domba
Cloning

phenotypic similarities among clones

genetic identical

have same environmental variance that

would normally be present
phenotypic similarities among clones
will not perform in identical manner

greater similarity could be useful in research

applications

reduced variance not a likely benefit for

livestock, at least in near term