Efek Imunostimulator Propolis Terhadap Proliferasi Limfosit T Dan Viabilitas Sel Tumor
Efek Imunostimulator Propolis Terhadap Proliferasi Limfosit T Dan Viabilitas Sel Tumor
13057/biotek/c030101
ABSTRACT
terkendali dan selanjutnya mampu menyerang telah dibuktikan oleh para ilmuwan Maroko
jaringan-jaringan di dekatnya atau bahkan dalam Rhajaoui et al. (2001) bahwa ekstrak
menjalar ke seluruh tubuh (Koestedjo,1984). propolis mampu menghambat pertumbuhan
Pertumbuhan jaringan kanker berkaitan erat bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
dengan lemahnya immunologic surveillance yang Kemampuan propolis dalam melawan
dilakukan oleh sistem imun baik selular maupun mikrobia dan menstimulasi sistem imun karena
humoral (Kresno, 2001). kandungan flavonoidnya yang tinggi. Nijveldt et
Telah banyak terapi yang dikembangkan al. (2001) menyatakan bahwa flavonoid termasuk
untuk mengatasi kanker payudara, antara lain dalam kelompok senyawa alamiah dengan
dengan operasi pembedahan, kemoterapi, terapi struktur fenol yang bervariasi dan dapat
radiasi, terapi hormonal dan terapi biologis ditemukan dalam buah, sayuran, kacang-
(Sindutrisno, 1984; Goan, 1984). Dari beberapa kacangan, kulit kayu, akar, batang, bunga, teh
jenis terapi yang telah tersebut di atas belum dan anggur. Menurut Johnson dan Maddipati,
didapat hasil yang memuaskan dan memiliki (1998); dan Miller dan Rice-Evans (1995) senyawa
efek samping yang merugikan, sehingga perlu flavonoid dari tumbuhan mempunyai aktivitas
dicari alternatif lain dalam usaha pengobatan anti-oksidan yang sangat berguna bagi kesehatan
penyakit tersebut salah satunya dengan manusia. Sedangkan Miller (1996) menyatakan
penggunaan bahan-bahan yang bersifat bahwa flavonoid mempunyai berbagai efek,
imunostimulator. Imunostimulasi berhubungan seperti imunstimulan, antitumor, anti-HIV,
dengan peningkatan respon imun spesifik atau antioksidan, antiradang, antidiare, antifungal,
non spesifik. Penambahan dapat secara intrinsik, antihepatotoksik, antihiperglikemi, dan
yaitu timbul dari dalam hospes, atau ekstrinsik vasodilator. Karena kandungan flavonoidnya
dan akibat sekunder dari pengaruh eksogen. yang tinggi maka propolis merupakan
Bahan-bahan yang mampu memacu peningkatan antioksidan yang kuat. De la Fuente dan Victor
respon imun disebut imunostimulator (Fudenberg (2000) mendapatkan hasil bahwa antioksidan
et al., 1978). mampu menstimulus sistem imun dengan
Salah satu bahan alamiah yang berperan meningkatkan perlekatan serta kemotaksis dari
sebagai imunosimulator adalah propolis, yang limfosit. Sedangkan menurut Hegazi et al. (1995),
dihasilkan oleh lebah madu. Lebah madu (Apis flavonoid dalam propolis terbukti meningkatkan
mellifera) adalah spesies yang berasal dari Eropa, persentase fagositosis makrofag pada ayam yang
Timur Tengah dan Afrika. Lebah madu terserang Newcastle disease.
membentuk koloni tahunan yang sangat besar di Semakin tingginya angka kejadian
pohon-pohon berlubang atau tempat-tempat tumor/kanker payudara dan belum adanya
berlubang lainnya (Delaplane dan Mayer, 2000). terapi yang tepat bagi penanganan penyakit ini,
Kehidupan lebah madu sangat tergantung pada maka penelitian efek imunostimulator propolis
bunga sebagai sumber pakannya. Hampir semua pada limfosit T terhadap viabilitas sel tumor
tanaman bunga pada umumnya adalah sumber mammae mencit secara in vitro perlu untuk
pakan lebah madu. Lebah pekerja dilakukan.
mengumpulkan empat macam bahan tanaman
yaitu nektar, tepung sari, propolis dan air
(Febriana et al., 2003). BAHAN DAN METODE
Propolis adalah substansi seperti lem yang
dibentuk oleh lebah madu dari resin tumbuhan Waktu dan tempat
yang mempunyai kemampuan sebagai Penelitian dilaksanakan pada bulan
antimikrobia (Ikeno et al. 1991; Koo et al., 2000) September 2005, di Laboratorium Ilmu Hayati
dan antiviral (Amoros et al., 1994; Cowan, 1999) , LPPT UGM, Yogyakarta.
selain itu juga berfungsi sebagai antiinflamasi
(Gregory et al., 2000; Mirzoeva dan Calder, 1996), Bahan
antimalaria (Wijayanti et al., 2003), Sebagai sumber T-limfosit dan sel tumor,
hepatoprotektif dengan aktivitas biologis digunakan mencit GR bertumor kelenjar
melawan tumor (Dumitrescu et al., 1993; Orsolic mammae transplantabel setelah 2 minggu
et al., 2003, Suzuki et al., 2002), antikanker (Su et transplantasi berasal dari Laboratorium Patologi
al., 1994) dan menstimulus sistem imun Eksperimental Bagian Patologi Anatomik FKUI.
(Bankova, 2000; Custadio et al., 2003; Harish et al., Propolis komersial merk Propolis Gold Psynergy,
1997). Kemampuan anti-bakteri dari propolis UK dengan kandungan propolis 20%. Phosphat
TYASTUTI dkk. – Efek imunostimulator propolis 33
Bovine Serum (PBS), RPMI-1640 (FBS, Glutamin, µL/sumuran di dalam inkubator CO2 5% 370C
Penicillin, Streptomycin), HCl 2 M, akuades, selama 3 hari dengan penambahan propolis
NH4Cl, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl- (Morgan dan Darling, 1993).
2H-tetrazolium bromide (MTT), Isopropanolol, Pemberian propolis pada kultur limfosit T.
metanol, Giemsa 20 % Propolis diberikan pada medium pertumbuhan
biakan T limfosit mencit untuk menjadi dosis
Cara kerja perlakuan sebagai berikut:
1. Kelompok kontrol tanpa penambahan propolis
Rancangan percobaan 2. Kelompok dosis A, dengan pemberian 0,5
Penelitian ini merupakan penelitian µg/mL propolis
eksperimental laboratoris dengan menggunakan 3. Kelompok dosis B, dengan pemberian 1,5
4 perlakuan masing-masing 3 ulangan. µg/mL propolis
4. Kelompok dosis C, dengan pemberian 4,5
Pelaksanaan percobaan µg/mL propolis
Sterilisasi propolis. Propolis disaring dengan Kemudian kultur sel diinkubasi pada 37ºC dalam
menggunakan syringe 0.5µ,agar terpisah dari inkubator CO2 5% selama 3 hari (Kalra et al.,
endapan dan hanya didapatkan cairan kental. 2004).
Propolis yang sudah disaring kemudian Analisis OD limfosit T. Limfosit T yang telah
disimpan di dalam tabung eppendorp. Semua dikultur ditambahkan MTT dengan konsentrasi 5
kegiatan di atas dilakukan di dalam laminair air mg/mL, sebanyak 10µL setiap sumuran. Inkubasi
flow untuk menghindari kontaminasi. dilanjutkan selama 4 jam. Reaksi dihentikan
Kultur limfosit T. Limfosit T diisolasi dari dengan menambah isopropanolol 0,04 M
limfa mencit. Limfa yang telah bersih sebanyak 100µL/sumuran. Hasilnya dibaca pada
dimasukkan ke dalam cawan petri steril ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm.
kemudian ke dalam limfa disuntikkan spit yang Kultur sel tumor. Sel tumor mammae mencit
berisi medium dan ditekan untuk mengeluarkan dikultur dalam mikroplate yang berisi RPMI
sel-sel limfosit. Setelah limfosit dikeluarkan dari 1640 yang mengandung FBS, Glutamin,
limfa, kapsul limfa dibuang dan suspensi limfosit Penicillin, Streptomycin dengan konsentrasi
dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril dan 5x104 sel/mL dan diinkubasi dalam inkubator
disentrifus pada 2500 rpm selama 5menit. CO2 5% 370C selama 24 jam. Setelah proses
Supernatan dibuang, dan ditambahkan NH4Cl inkubasi selesai akan terlihat bahwa sel tumor
untuk melisis eritrosit ,lalu disentrifus pada 2500 yang mampu hidup akan menempel di dasar
rpm selama 5menit. Supernatan dibuang, plate. Sel tumor yang menempel kemudian
endapan dicuci dengan 2 mL RPMI dan dicuci dengan RPMI 1640 dan siap digunakan
disentrifus pada 2500 selama 5menit. Proses untuk uji viabilitas sel tumor (Kaeida et al., 1989).
pencucian ini dilakukan 2 kali. Supernatan Uji viabilitas sel tumor. Ke dalam kultur sel
dibuang, endapan ditambahkan 1 mL RPMI . tumor ditambahkan 10µl kultur limfosit T yang
Kolom untuk menyaring limfosit T disiapkan telah disiapkan pada cara kerja (d) kemudian
dan dijenuhkan dengan medium RPMI dan diinkubasi dalam inkubator CO2 5% 370C selama
didiamkan hingga medium membasahi nilon 4 jam untuk melisiskan sel tumor. Setelah 4 jam
woll. Kemudian suspensi limfosit dimasukkan ke plate dicuci dengan PBS, sel tumor yang terlisis
dalam kolom berisi nilon woll dan diinkubasi oleh limfosit T akan lepas dari dasar plate sedang
selama 30 menit. Setelah 30 menit suspensi yang tidak terlisis akan tetap menempel di dasar
dipindahkan ke dalam tabung reaksi steril plate. Sel tumor yang tetap menempel di dasar
dengan cara menekan spuit menggunakan piston plate difiksasi dengan metanol lalu diwarnai
secara perlahan-lahan, prosedur ini bertujuan dengan larutan Giemsa. Sel tumor yang
untuk memisahkan limfosit T dari limfosit B. terwarnai Giemsa dihitung dibawah mikroskop.
Kemudian pada suspensi limfosit T ditambahkan (Kaeida et al., 1989).
RPMI 3 mL dan disentrifus pada 2500 rpm
selama 5 menit. Endapan diambil dan Analisis data
ditambahkan 1 mL RPMI, lalu dihitung jumlah Data OD limfosit T dan viabilitas sel tumor
sel dengan menggunakan haemacytometer dianalisis dengan ANOVA untuk mengetahui
hingga didapatkan sel dengan kepadatan 1 x 106 ada tidaknya beda nyata. Bila ada beda nyata
sel/mL. Setelah dihitung suspensi sel siap dilanjutkan dengan uji DMRT untuk mengetahui
dikultur pada mikroplate 24 dengan volume 500 letak perbedaannya.
34 Bioteknologi 3 (1): 1-7, Mei 2006
OD Limfosit T
terhadap OD limfosit T ditunjukkan pada Tabel 1. A
limfosit T. Limfosit T yang aktif mampu meng- tumor berpengaruh nyata terhadap viabilitas sel
hasilkan TNF-α yang berfungsi menekan tumor dibandingkan kontrol. Penambahan
pertumbuhan sel tumor, meningkatkan pertum- limfosit T terstimulasi propolis 0,5µg/mL tidak
buhan dan ekspresi IL-2R dan menstimulasi berbeda nyata terhadap penambahan limfosit T
poduksi IFN-γ yang juga berperan menghambat terstimulasi propolis 1,5µg/mL. Viabilitas sel
pertumbuhan sel tumor. Meningkatnya tumor terendah terdapat pada penambahan
proliferasi limfosit T menyebabkan peningkatan limfosit T terstimulasi propolis 4,5µg/mL sebesar
jumlah TNF-α sehingga pertumbuhan sel tumor 4,667. Viabilitas sel tumor yang dipapari limfosit
semakin mudah ditekan (Alexander et al., 1993; T yang terstimulasi propolis berbagai dosis dapat
Gu, 2005; Urban, 1982). Propolis dalam hal ini dilihat pada Gambar 2.
sebagai bahan yang mampu berperan sebagai
imunostimulator juga layak untuk
diperhitungkan menjadi salah satu bahan alami
12 T.P0
yang menjadi solusi bagi usaha-usaha
(2001) menyatakan bahwa fungsi pengontrolan membahayakan dan relatif tidak menimbulkan
limfosit T terhadap pertumbuhan sel tumor alergi. Ghisalberti (1979) melaporkan dalam
dapat terjadi secara langsung yang dilakukan suatu penelitian bahwa pemberian ekstrak eter
oleh subset limfosit T sitotoksik (CTL) dengan propolis pada mencit dengan dosis 0,35 mg/g
mensekresi limfokin yang berpengaruh langsung berat badan tidak menunjukkn gejala alergi.
dalam melisis sel tumor melalui pengrusakan Sedangkan pada pemberian eter dan alkohol
membran dan nukleus. Fungsi pengontrolan juga ekstrak didapatkan Lethal Dosage50 (LD50) sebesar
terjadi secara tidak langsung yang dilakukan 0,7 mg/g berat badan setelah 19 jam perlakuan.
oleh limfosit T helper. Subset limfosit ini selain Penyebab kematian adalah kerusakan sistem
menghasilkan limfokin (TNF-α dan IFN-γ) yang respirasi. Sebagai pembanding, pemberian
mengaktifkan sel efektor lain, CTL, makrofag, procaine pada mencit dengan dosis yang sama
NK, limfosit B dan menginduksi terjadinya menyebabkan kematian 60% hewan uji dalam
respon inflamasi (Kresno, 2001). Menurut Urban waktu yang lebih singkat.
et al. (1982), limfosit T memegang peranan yang Pada perkembangan penggunaan bahan-
sangat penting pada pertahanan terhadap tumor. bahan imunostimulator timbul ketakutan karena
Hal ini dibuktikan dalam sebuah penelitian adanya anggapan bahwa jika sistem imun terus
terhadap mencit nude yang tetap mampu menerus distimulasi akan menyebabkan
mengekspresikan sel Natural Killer (NK) seperti perkembangan sel-sel imun yang tidak
mencit normal tetapi tidak mampu terkendali dan mengakibatkan penyakit
mengekspresikan limfosit T. Hasil penelitian ini autoimun (Thome dan Tschopp, 2001). Ketakutan
menunjukkan bahwa tumor tumbuh lebih cepat ini seharusnya tidak perlu terjadi karena bila
pada mencit nude dibandingkan dengan fungsi imun sudah kembali normal maka bahan-
pertumbuhan tumor pada mencit normal. Hasil bahan imunostimulator tidak lagi bekerja
penelitian tersebut membuktikan bahwa limfosit meningkatkan kekebalan tubuh. Pinchuk (2002)
T berperan menghambat pertumbuhan sel mengatakan hal tersebut terjadi karena sistem
tumor.Melemahnya sistem imun pada penderita imun bersifat self limitation yaitu respon imun
tumor menyebabkan semakin mudah sel tumor akan terhenti dengan sendirinya jika antigen
berkembang. Kasus tersebut mendorong para sudah dihilangkan. Perkembangan bahan
peneliti untuk menemukan bahan-bahan yang imunostimulator di Indonesia seharusnya lebih
berfungsi menguatkan sistem imun karena ditingkatkan karena negara ini memiliki potensi
sistem imun yang kuat sangat dibutuhkan untuk bahan-bahan yang dapat berperan sebagai
menghasilkan respon yang baik (Cilento, 2001). imunostimulator, selain dapat menekan biaya
Dalam perkembangan kasus penyakit tumor, penyembuhan juga menekan resiko pasca
usaha penyembuhan dengan imunotherapi penyembuhan.
semakin dibutuhkan karena proses
penyembuhan dengan metode-metode yang
sudah sering dilakukan (operasi pengangkatan KESIMPULAN
tumor dan kemoterapi) belum memberikan hasil
yang optimal bahkan menimbulkan efek negatif Propolis meningkatkan proliferasi limfosit T
pasca perlakuan. Belum lagi besarnya biaya yang dan berfungsi sebagai imunostimulator.
harus dikeluarkan untuk melakukan upaya Proliferasi tertinggi terjadi pada pemberian
penyembuhan dengan metode-metode tersebut. propolis dosis 4,5 g/mL. Sedangkan proliferasi
Propolis sebagai salah satu bahan yang telah terendah pada pemberian propolis dengan dosis
terbukti sebagai imunostimulator dapat 0,5 µg/mL. Penambahan limfosit T terstimulasi
dijadikan bahan alternatif yang dapat propolis pada kultur sel tumor menurunkan
dipergunakan dalam imunoterapi pada kasus viabilitas sel tumor, hasil ini menujukkan
timbulnya tumor. Penelitian ini membuktikan propolis berfungsi sebagai antitumor secara
bahwa propolis berpotensi menjadi bahan sekunder. Viabilitas sel tumor tertinggi setelah
antitumor secara sekunder dengan dipapari limfosit T yang terstimulasi propolis
meningkatkan proliferasi limfosit T yang aktif terdapat pada perlakuan sel tumor yang terpapar
memproduksi limfokin yang dapat menghambat limfosit T tanpa penambahan propolis.
dan menekan pertumbuhan sel tumor. Propolis Sedangkan viabilitas sel tumor terendah terdapat
yang terbentuk dari kumpulan resin tumbuhan pada perlakuan sel tumor yang terpapar limfosit
yang disekresikan oleh lebah mengandung T terstimulasi propolis 4,5 g/mL.
banyak kandungan bahan alamiah yang tidak
TYASTUTI dkk. – Efek imunostimulator propolis 37