perbandingan 7:3 dan dihasilkan 16 fraksi, jika terdapat satu spot jelas menandakan

bahwa senyawa tersebut murni.

3.4 Elusidasi Struktur

Spektrum 1H- NMR menginformasikan jumlah, jenis dan lingkungan dari

13
setiap proton yang terdapat dalam suatu senyawa, sedangkan spektrum C-NMR

memberikan informasi berkaitan jumlah dan jenis-jenis karbon yang terdapat dalam

molekul dalam suatu senyawa, dimana dengan menggabungkan kedua informasi

ini, maka penentuan struktur dapat dilakukan dengan lebih cepat dan perkiraan

struktur yang lebih akurat. Berikut merupakan data Spektrum 1H- NMR dan 13C-

NMR untuk fraksi F’8-KG2-KR-4-8: Spektrum 1H NMR (CDCl3 500 MHz) δH

ppm: 8,542 (dd, H-16), 7,647 (dd, H-15), 6,786 (dd, H-14), 3,148 (dd, H-11a),

2,814 (dd, H-11b), 2,593 (m, H-9), 2,39 (m, H-7a), 2,190 (td, H-7b), 1,846 (qd, H-

6a), 1,469 (m, H-6b), 1,846 (ddd, H-5), 2,190 (m, H-4), 4,885 (dd, H-3), 4,150 (q,

H-2), 2,04 (dd, H-1a), 1,469 (dd, H-1b). Spektrum 13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) δc

(ppm) : 194,1 (C-12), 170,4 (C-19), 149,5 (C-8), 148,8 (C-16), 145,4 (C-15), 129,0

(C-13), 109,3 (C-14), 107,3 (C-17), 76,8 (C-3), 69,2 (C-2), 51,7 (C-9), 48,5 (C-5),

47,1 (C-4), 44,1 (C-1), 38,2 (C-11), 38,0 (C-7), 37,1 (C-10), 21,3 (C-3), 16,3 (C-

20).

3.5 Penentuan konsentrasi Hambat Minimun (MIC)

Penentuan MIC dilakukan dengan metode mikrodilusi cair. Metode mikodilusi cair

dilakukan dengan cara membuat seri pengenceran sampel uji pada media cair MHB

yang ditambahkan dengan bakteri uji. Larutan uji konsentrasi 100 μg/mL dibuat

dengan cara melarutkan sampel uji dalam MHB (dalam 5% DMSO) pada tabung
Eppendorf. Konsentrasi larutan uji dibuat dengan melakukan pengenceran dalam

mikroplat 96 well dengan rentang konsentrasi 1,56 – 100,00 μg/mL. Pengenceran

dilakukan dengan terlebih dahulu memasukkan 50 μL media MHB ke dalam well

kedua sampai ketujuh (baris B-G). Ke dalam well pertama (baris A) ditambahkan

100 μL larutan uji konsentrasi 100 μL/mL. Variasi konsentrasi larutan uji dilakukan

dengan cara memindahkan 50 μL larutan uji dari well pertama ke well kedua,

dilanjutkan dengan memindahkan 50 μL larutan uji dari well kedua ke well ketiga,

dan seterusnya sampel well ketujuh. Well baris 1,5 dan 9 digunakan sebagai blanko

negatif (tanpa bakteri). Well kolom H baris 1-4 digunakan sebagai blanko nol (MHB

+ DMSO 5%), baris 5-8 digunakan sebagai blanko positif (MHB + DMSO 5% +

bakteri) dan baris 9-12 digunakan sebagai kontrol negatif (MHB + bakteri). Kontrol

positif dibuat dengan cara melarutkan amoksilin ke dalam MHB (dalam 5%

DMSO) pada tabung Eppendorf. Konsentrasi larutan amoksilin dibuat dengan

melakukan pengenceran dalam mikroplat 96 well dengan rentang konsentrasi 0,78

– 50,00 μL/mL dengan cara

yang sama seperti pada pengenceran larutan uji. Sebanyak 50 μL suspensi bakteri

uj konsentrasi 105 CFU/mL yang telah dibuat pada tahap penyiapan kultur

selanjutnya dimasukkan ke dalam setiap well uji. Mikroplat ini selanjutnya

diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16-20 jam. Setelah diinkubasi selama 16-20 jam,

maka dapat ditentukan nilai MIC-nyadengan cara melihat kekeruhan menggunakan

universal microplate reader pada panjang gelombang 600 nm. Nilai MIC adalah

konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba.