Restriksi plasmid adalah suatu proses pemotongan fragmen DNA pada situs

tertentu yang sesuai dengan yang diinginkan menggunakan enzim restriksi yang
berkerja untuk pemotongan fragmen DNA situs yang spesifik. Terdapat dua proses
rekombinan DNA yaitu enzim yang memiliki peran pada isolasi DNA dan
menyiapkan DNA rekombinan, molekul pada DNA rekombinan tidak bisa dibuat
tanpa dua jenis enzim, yang pertama adalah enzim restriksi endonuclease yang
berperan memotong DNA di situs spesifik yang kedua DNA ligase yang memiliki
peran sebagai pelekat dua molekul yang berada di dalam tabung reaksi. Restriksi
endonukleuse dnegan cara “sugar-phosphat backbone”, restriksi endonuklase
mengenal urutan pasang basa dan bersifat palindron, palindrom adalah urusan basa
yang sama do baca 5’ – 3’. Terdapat dua cara pemotongan yaitu ujung rata dan
ujung kohesif, ujung rata menghasilkan saat dua utas molekis dipotong dengan
posisi yang sama , ujung kohesif menghasilkan pada setiap molekul DNA dipotong
dnegan posisis yang tidak sama sehingga satu utas menggantung di beberapa
nukleotida.
Enzim restriksi merupakan enzim yang digunakan untuk memotong DNA
pada situs spesifik yang disebut dengan restriction site. Enzim restriksi akan
mengenali sisi restriksi fragmen DNA atau urutan nukleotida yang umumnya terdiri
dari 4 sampai 8 base pair yang merupakan pasangan basa palindrom dan akan
memotong DNA pada posisi diantara atau diluar sekuen yang dikenali enzim
restriksi tersebut. Dalam pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen
DNA didasarkan pada ukuran fragmen, blunt-ended atau sticky-ended fragment,
sensitivitas terhadap metilasi dan kompatibel terhadap kondisi reaksi.
Dalam pemetaan DNA plasmid disiapakan terlebih dahulu komponen-
komponen yang diperlukan. Bahan yang diperlukan dalam pemetaan DNA meliputi
Plasmid tipe pUC dan enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan pada
pemetaan plasmid yaitu enzim restriksi BamH1 dan enzim restriksi Nde 1. BamHI
merupakan enzim restriksi yang berasal dari Bacillus amyloliquefaciens dengan sisi
pemotongan ujung lancip (sticky-ended fragment) G GATCC.
Para Praktikum ini, enzim restriksi yang digunakan yaitu BamHI dan
HindIII. Sisi restriksi dari enzim BamHI yaitu memotong pada sekuen GGATCC
yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G dan BamHI yang
merupakan golongan enzim 6-cutters akan memotong DNA sekitar 300 bagian.
Enzim BamHI dapat menghidrolisis ikatan fosfodiester yang menghasilkan formasi
5′–PO4–dan 3′–OH yang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau sticky
ends(BamHI) dan bentuk simetris atau blunt ends (SmaI). Sedangkan sisi restriksi
dari HindIII yaitu 5’-AAGCTT-3’ (utas atas)/3’-TTCGAA-5’ (utas bawah). Enzim
ini akan selalu memotong molekul DNA pada sekuen spesifik dengan panjang situs
pengenalannya yaitu enam pasang basa. Enzim ini berasal dari Haemophilus
influenzae.

Setela dilakukan pemotongan, untuk melihat hasil pemotongan dilakukan

elektroforesis. Jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis gel yang
menggunakan fase diam yaitu gel agarosa dalam melakukan pemisahan molekul-
molekulnya. Dasar penggunaan jenis elektroforesis gel agarosa ini karena molekul
DNA yang akan dipisahkan berukuran kecil yang memungkinkan dapat melewari
pori-pori dari kerapatan gel agorosa yang dibuat. Dan pada umumnya untuk
melakukan elektroforesis DNA digunakan metode elektroforesis gel agarosa.
Agarosa merupakan suatu polisakarida yang diperoleh dari alga merah. Gel agarosa
ini dapat dipakai untuk pemisahan DNA yang berukuran lebih dari 100 bp,
sedangkan untuk pemisahan DNA yang memiliki ukuran lebih pendek digunakan
gel poliakrilamid. Konsentrasi agarosa yang digunakan dalam elektroforesis dapat
sangat mempengaruhi mobilitas dari fragmen DNA dikarenakan semakin besar
konsentrasi agarosa yang dipakai maka semakin kecil pori-pori dari gel tersebut.

Perangkat yang digunakan elektroforesis gel agarosa ini terdiri dari power
supply sebagai sumber listrik, cetakan gel, tangki elektroforesis, elektroda dan sisir
yang dipakai untuk pembuatan lubang tempat peletakan DNA. Pembuatan lubang
ini dilakukan dengan meletakkan sisir di gel agarosa yang belum memadat.
Pemisahan dari fragmen DNA ini didasarkan pada elektromobilitas yang berguna
sebagai metode analitik maupun metode preparatif. Molekul DNA yang bermuatan
negatif akan bergerak menuju anode (elektrode yang bermuatan positif) karena
adanya gugus fosfat. Fragmen dari DNA yang memiliki ukuran molekul yang sama
akan mempunyai elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak perpindahan
yang sama. Sedangkan untuk fase gerak yang digunakan dalam percobaan ini
adalah buffer Tris-acetate EDTA (TAE).