BIOTEKNOLOGI

INTRODUCTION TO BIOTECHNOLOGY

Bioteknologi? Sering diidentikkan dengan ilmuwan

yang melakukan eksperimen di lab mahal untuk
membuat monster.

Secara luas didefinisikan sebagai penggunaan

mikroorganisme hidup (ragi, dll) atau bagiannya atau
produk organisme hidup untuk membuat produk yang
menguntungkan atau menyelesaikan permasalahan
(u/ kepentingan manusia). Bioteknologi bukan sebuah
ilmu baru.

Produk Bioteknologi :

- Jurrassic Park
- Tomat “Flavr Savr” (di AS terdapat permasalahan
dalam masalah distribusi karena jarak yang jauh,
takut tomatnya busuk dijalan, kalau dipetik pas
belum mateng ga enak. Maka dari itu dibuat
tomat yang dapat diatur kapan busuknya)
- Stem cells / sel punca (Sparepart manusia)
- “knock out” mouse
- Insulin, penicillin, home pregnancy test
- Genetically modified (GM) food: corn chip,
yoghurt, cheese, wine, bread

SEJARAH SINGKAT - Ditemukan proses “fermentasi” karena dulu

a. Beberapa praktik kuno
Sudah digunakan sejak lama → mencari makan ke
hutan, tetapi manusia tidak punya pertahanan
diri, lalu mencari biji-bijian, menanamnya dan
beternak hewan.
- Hunting and Gathering → Hewan ternak dan
tanaman dikumpulkan
- Selective breeding untuk meningkatkan
produksi → Memodifikasi atau mengawinkan
agar menghasilkan keturunan dengan
karateristik yang diinginkan
Contoh :
Evolusi dari jagung (Zea mays) dari teosinte
(kiri) ke jagung modern (kanan). Tengah :
kemungkinan hibrida teosinte dan varietas
jagung awal
gaada kulkas. Untuk membuat roti, keju,
yoghurt, dan minuman beralkohol.
9000 SM : ditemukan yoghurt
6000-5000 SM : ditemukan beer
4000 SM : Ditemukan keju (ditemukan di usus
anak sapi)
- Fermentasi : proses mikroba (microbial
process) mengubah suatu produk menjadi
produk yang lain secara enzimatik.
Contoh : fermentasi untuk membuat roti
Saccharomyces cerevisiae + sugars → energy +
CO2 + alcohol
- Leeuwenhoek (1680) mengamati mikroba
dibawah mikroskop
- Pasteur (1866-1876) menetapkan bahwa
mikroba bertanggungjawab pada proses
fermentasi.

b. Praktik lama
- Top fermentation : Ragi hanya berada di atas
- Bottom fermentation (1833) : Ragi sampai
bawah
- World War I : Fermentasi dari perlarut organik
untuk bahan peledak (gliserol)
 - 1928 : Alexander Flemming menemukan - Top : Aplikasi → menciptakan produk atau proses
antibiotik pertama “Penisilin” → untuk untuk membantu manusia atau lingkungan hidup
mengobati infeksi bakteri (1940-an / World kita
War II)
- 1950 – 1960-an : Sejumlah besar antibiotik
ditemukan dari berbagai mikroba

c. Praktik baru
Sejak 1960-an → berkembang pesat pemahaman
tentang genetika dan biologi molekular (struktur
dan fungsi DNA) → memunculkan inovasi dan
aplikasi baru dalam bioteknologi :
- Gene Cloning (kloning gen) : Kemampuan
untuk mengidentifikasi dan mereproduksi gen
yang diinginkan
- Genetic Engineering (Rekayasa genetika) :
Memanipulasi DNA suatu organisme
- Recombinant DNA technology (Teknologi DNA
Rekombinan) : Menggabungkan DNA dari
berbagai sumber

Teknologi tersebut digunakan untuk

menghasilkan:

- Protein yang berguna secara medis, contoh:

insulin dan human growth hormone
- Tanaman tahan penyakit
- Tanaman yang menghasilkan buah yang lebih
banyak
- “golden rice” yang direkayasa agar lebih bergizi
Tipe Bioteknologi :

a. Microbial biotechnology
- Bakteri hasil rekayasa genetika → untuk
meminimalisir polutan lingkungan
- Human genome project dan human proteome
project
Bioteknologi : A science of many
- Aplikasi tertua : Penggunaan ragi untuk
membuat bir dan anggur.
- Memanipulasi mikroba (karena cuma 1 sel, jadi
mudah), enzim dan organisme → membuat
makanan, menyederhanakan proses produksi
dan membuat proses dekontaminasi untuk
pembuangan produk limbah industri menjadi
lebih efisien
- Digunakan juga untuk mengkloning dan
menghasilkan protein penting untuk
pengobatan, termasuk insulin dan growth
hormone.

- Akar : Basic science → penelitian kedalam proses

fundamental organisme hidup di tingkat biokimia,
molekuler, dan genetik
- Riset ilmu dasar dengan bantuan ilmu komputer
(bioinformatika) → mengarah pada pendekatan
rekayasa genetika
 - Demikian pula, desain dan pengujian obat dan
terapi genetika pada hewan sering mengarah
pada strategi pengobatan baru pada manusia

b. Agricultural biotechnology
- Tanaman rekayasa genetika (GM plant)
dengan karakteristik tahan lama, toleran
terhadap suhu dingin, hasil pangan lebih
banyak atau kandungan protein/vitamin lebih
tinggi
- Tanaman dapat direkayasa untuk
menghasilkan berbagai pharmaceutical
protein, seperti antibodi monoclonal - Pada tahun 1977, Dolly, hewan pertama yang
- Biaya lebih rendah daripada memproduksi diciptakan oleh proses transfer inti sel →
protein rekombinan pada bakteri, karena menyebabkan hewan kloning yang
tanaman dapat ditanam di ladang besar untuk mengandung organ rekayasa genetik dapat
molecular pharming. ditransplantasikan ke manusia tanpa jaringan
Misal : Produksi protein rekombinan dalam penolakan → berpotensi untuk kloning
transgenik daun tembakau manusia
- Tanaman hasil rekayasa genetik → tahan
herbisida dan tahan serangga
- “golden rice” dikembangkan untuk
memecahkan masalah → gen produksi karoten
dimasukkan ke dalam beras → memberi warna
pada nasi
- Ti plasmid dari Agrobacterium tumefaciens
adalah vektor yang umum digunakan untuk
memasukkan gen baru kedalam sel tanaman

c. Animal biotechnology
- Hewan (seperti kambing, sapi, domba, dan
ayam) dapat digunakan sebagai “bioreaktor”
untuk menghasilkan protein yang bernilai
secara medis, seperti antibodi dan clotting
protein
- Untuk mencapai produksi skala besar →
Hewan transgenik betina (transferred genes)
mengekspresikan protein terapi dalam air susu
mereka
- Basic research : Percobaan gen “knock out”
(satu atau lebih gen terganggu) pada hewan →
dapat digunakan untuk memahami fungsi gen
yang sama pada manusia
 - CC the 1st cloned cat
Ilmuwan Korea Selatan telah mengkloning
kucing dengan memanipulasi gen protein
fluorescent → dapat membantu
mengembangkan pengobatan untuk penyakit
genetik manusia. Efek samping ; kucing yang
dikloning bersinar dalam gelap ketika terkena
sinar UV.
d. Forensic biotechnology
- Dapat digunakan untuk penegakan hukum
yang dapat mengarah pada inklusi/eksklusi
seseorang dari kejahatan (kriminal)
berdasarkan bukti DNA (dari rambut, darah,
jejak jaringan, cairan tubuh) yang tertinggal di
TKP
- Sidik jari DNA : metode pengumpulan untuk
mendeteksi pola DNA unik → alat utama yang
digunakan dalam bioteknologi forensik
- Aplikasi :
✓ Mencari ayah dari seorang anak
✓ Mengidentifikasi korban kejahatan
✓ Sidik jari DNA untuk spesies yang
terancam punah
✓ Untuk melacak dan mengkonfirmasi
penyebaran suatu penyakit
Non Coding Sequences → Forensik mengkode
daerah yang tidak terdapat protein
e. Bioremediation
- Penggunaan biotek untuk memproses dan
mendegradasi zat (alami/buatan) terutama
yang berperan terhadap pencemaran
lingkungan (pengolahan limbah)
- Bergantung pada aplikasi bioteknologi
mikroba, contoh : Bakteri yang mampu
mendegradasi komponen dalam minyak
mentah → cepat, tidak ada bahan pembersih
kimia
f. Aquatic biotechnology
- Aplikasi tertua : Aquaculture (pemeliharaan
dalam kondisi terkontrol untuk digunakan
sebagai sumber makanan)
- Perkembangan baru :
✓ rekayasa genetika untuk menghasilkan
strain tiram yang tahan terhadap penyakit
dan vaksin melawan virus yang
menginfeksi finfish.
✓ Transgenic finfish → tingkat pertumbuhan
luar biasa, periode pertumbuhan pendek.
Keunikan organisme laut → hidup dalam kondisi
yang paling sulit → sumber gen baru, protein dan
proses metabolisme : plankton dan siput tertentu
→ kaya akan molekul anti tumor dan antikanker
g. Medical biotechnology
- Untuk pengobatan (misal : vaksin), diagnosis,
perawatan kondisi penyakit (obat dan protein
rekombinan) untuk meningkatkan kesehatan
- Approaches with ;
✓ Human genome project (dimulai pd 1990)
Proyek untuk mengidentifikasi semua
gen (sekitar 35.000 gen = genome →
genomics) yang terkandung dalam DNA
sel manusia dan memetakan lokasi
mereka ke masing-masing dari 23
kromosom manusia → untuk memahami
kompleksitas genetika manusia.
Biologi molekuler dan fungsi gen
manusia dan faktor pengendali yang
mengatur gen → bagaimana gen normal
mengendalikan aktivitas sel, bagaimana
perbedaan fungsi gen normal dan gen
cacat → pengembangan diagnosis baru
untuk mendeteksi penyakit, mengobati,
dan menyembuhkan.
Dapat digunakan untuk
mengidentifikasi SNPs dan
mengembangkan peta SNP genom
manusia, mempelajari evolusi manusia
dan bagaimana keterkaitan manusia
dengan spesies lain (misal katanya
monyet kan mirip manusia, tapi ternyata
manusia lebih mirip dna nya sama babi
heuheu) dengan cara dihitung gen yang
tidak komplemennya.
✓ SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)
Berbagai penyakit → disebabkan oleh
gen yang berbeda. SNPs adalah
perubahan nukleotida tunggal atau
mutasi dalam sekuens DNA yang
bervariasi dari individu ke individu →
diagnosis
SNPs :
- Mewakili variasi urutan DNA yang
memengaruhi cara kita merespons
stress dan penyakit.
- Membantu mengidentifikasi gen
yang terlibat dalam kondisi medis
- Penyebab penyakit genetik, con:
anemia sel sabit (sickle cell anemia)
- Mengarah pada pendekatan
pengobatan pencegahan yang dapat
dirancang u/ gaya hidup yang lebih
sehat, aman,dan efektif
- Untuk menguji : DNA microarrays
atau gene chips
DNA microarrays
- Isolasi DNA dari sejumlah kecil darah
pasien
- Berisi ribuan sekuens DNA SNPs
- Menggunakan analisis komputer,
dapat membandingkan pola ikatan
DNA antara DNA pasien dan DNA
pada microarrays → mengungkap
pola SNPs pasien → mengetahui
risiko seseorang thd penyakit
✓ Farmakogenomik
- SNPs dapat digunakan untuk
menentukan gen mana yang terlibat
dalam suatu penyakit → merancang
strategi pengobatan yang spesifik
dan efektif, dgn keamanan dan
integrasi yang tepat
- Penemuan SNPs bertanggungjawab
atas munculnya farmakogenomik
- Farmakogenomik : Terapi obat dan
strategi perawatan yang dirancang
khusus berdasarkan profil genetik
pasien
✓ Terapi gen
- Terapi gen : penyisipan gen normal
ke pasien atau mengganti gen yang
rusak dengan gen normal u/
 mengobati penyakit, terutama
penyakit keturunan
- Jenis terapi gen :
In vivo (langsung) → gen diubah
dalam sel yang masih didalam tubuh
Ex vivo (berbasis sel) → sel
dimodifikasi diluar tubuh kemudian
ditransplantasikan kembali

Teknologi stem cell dan regenerative medicine

- Stem cell dapat ditumbuhkan di lab → dapat

Contoh kasus :
Jessie Gelsinger (18 thn) memiliki gangguan genetik
Ornithine transcarbamylase (OTC) deficiency, yaitu
gangguan siklus urea (1/10000 kelahiran) → mengkode
kromosom X. Biasanya wanita hanya carrier, anak laki-
laki akan menderita penyakitnya.
Siklus urea → membersihkan tubuh dari amonia
(produk penguraian racun protein) Jika enzim hilang
atau kurang → amonia terakumulasi dalam darah dan
menuju otak → koma, kerusakan otak atau kematian.
Terapi gen dimulai pada 13 Sep 1999, koma pada 14
Sep, mati otak dan bantuan kehidupan berakhir pada
17 Sep 1999. Penyebabnya adalah komplikasi yang
berkaitan dengan vektor adenovirus (yg digunakan
untuk memberikan gen terapi u/ pengobatannya) →
Respiratory Disease Syndrome
✓ Stem cell technologies
Stem cell → sel yang belum matang, berpotensi
untuk berkembang menjadi semua jenis sel
dalam tubuh. Sebagian besar diperoleh dari
embrio (embryonic stem cells, ES), diisolasi dari
darah tali pusat bayi yang baru lahir. Sekarang
dapat diisolasi dari jaringan dewasa juga (Adult-
derived stem cells; ASCs)
berkembang menjadi berbagai jenis jaringan
- Digunakan dalam transplantasi untuk
mengganti jaringan yang rusak atau gagal spt
hati, pankreas dan retina → regenerative
medicine
- Di masa depan : Stem cell dikumpulkan,
manipulasi genetik sel ini dgn terapi gen,
masukkan kembali ke pasien → terutama
untuk kondisi penyakit hasil mutasi spt sickle
cell anemia.
✓ Regenerative medicine
a. Stem Cell technologies
b. Cell and Tissue Transplantation
1. Fetal tissue grafts
Neurogenerative disease seperti
alzheimer dan Parkinson terjadi secara
bertahap, mengarah pada kehilangan
fungsi otak secara progresif.
Parkinson → hilangnya neuron di daerah
substantia nigra.
Setiap tahun ±85000 orang menderita
cedera sumsum tulang belakang →
serabut saraf putus → paraplegia dan
kelumpuhan (tgt pada saat cedera)
 Karena homologi genetik jaringan → sistem
imun tidak merespon. Dapat digunakan
cangkok kulit, transplantasi sumsum tulang,
rambut, operasi bypass koroner

Diambil fetal tissue nya → tumbuhkan di cawan petri

→ ditambahkan antibodi yang menahan pertumbuhan
penghambatnya

2. Tissue and Organ Transplantation

Untuk memindahkan graft (organ atau
jaringan) dari satu bagian atau individu
ke bagian lain.
Dapat terjadi antara :

➢ Allografting
Pemindahan organ/jaringan dari manusia ke
manusia (donor hidup) atau dari mayat ke
manusia. (organisme beda, spesies sama)
Dr. Christian Bernard pd tahun 1967
melakukan transplantasi jantung pertama
yang sukses di Cape Town, Afrika Selatan.

➢ Autografting
Bagian berbeda dari organisme yang sama
(dari diri sendiri)
➢ Xenografting
 Dari berbagai spesies (animal to human).
Pada tahun 1984, dokter di California
melakukan transplantasi jantung babon ke
Baby Fae (usia 12 hari) → hanya hidup 3
minggu, sebelum dia meninggal karena
komplikasi terkait penolakan organ.
➔ Organ babi memiliki fungsi dan ukuran
yang mirip dengan manusia → slowed
progress, karena virus dapat ditularkan
dari babi ke manusia
➔ Barubaru ini dikembangkan
Dimulai dengan merancang dan membangun
penggabungan teknik molekuler dan
kerangka (framework) atau scaffold yang
teknologi transplantasi untuk
terbuat dari senyawa biologis seperti kalsium,
menghasilkan “cloned pigs” → kekurangan
kolagen, atau bahan yang dapat terurai →
gen → organ babi ditolak
berbentuk cetakan organ. Penumbuhan sel
➔ Menggunakan teknik “knock out” gen →
tersebut disebut penyemaian (seeding),
dihilangkan gen CGTA1 (menghasilkan gula
karena sel bertindak sebagai benih untuk
pada permukaan jaringan babi dan akan
membuat lebih banyak sel yang akan tumbuh
dikenali sbg antigen)
diatas scaffold.
3. Cellular therapeutics

Biocapsules punya lubang kecil (pori) di

dindingnya untuk pertukaran nutrisi,
memungkinkan molekul yang diproduksi
terbungkus, lalu keluar dan masuk aliran
darah atau jaringan. Biokapsul
melindungi sel agar tidak diserang oleh
sistem imun dan memberi pelepasan
molekul ke dalam tubuh (diubah setiap
beberapa bulan)
Contoh : kapsul yang mengandung sel
penghasil insulin (sel beta) pankreas

c. Tissue Engineering (Rekayasa Jaringan)

Menyediakan jaringan dan organ yang dapat
digunakan untuk menggantikan jaringan yang
rusak atau sakit.
Contoh : Kulit manusia yang direkayasa untuk
korban luka bakar parah, merekayasa struktur
tulang untuk terapi patah tulang
 PRODUK MODERN BIOTEKNOLOGI

Produk yang paling banyak digunakan → protein yang

dibuat oleh kloning gen disebut “protein rekombinan”

Protein Rekombinan

Mengidentifikasi gene of interest → masukkan

kedalam sel bakteri atau sel mamalia yang ditanam di
flasks atau dishes dalam media kultur cair (untuk
menyediakan nutrisi yang diperlukan pertumbuhan
sel) → sel ditransfer ke fermentor atau bioreaktor
d. Cloning
(metode kultur batch, fed-batch, atau countinuos)
Ada dua jenis kloning :
- Reproductive Cloning, untuk membuat
bayi, contoh : Dolly
- Therapeutic cloning, menyediakan sel-sel
induk yang cocok secara genetik dengan
pasien yang membutuhkan transplantasi

✓ Human proteome project

Proteome : Kumpulan protein yang
bertanggungjawab untuk aktivitas dalam sel
manusia → proteomics.
Merupakan proyek untuk :
1. Mengidentifikasi proteome
2. Memahami struktur dan fungsi protein yang
dikode oleh gen
3. Bagaimana protein menyebabkan penyakit
Fermentation Products
- Senyawa farmasi, seperti antibiotik
- Asam amino
- Bahan kimia, hormon dan pigmen
- Enzim
- Biomass untuk komersial dan konsumsi hewan
(misal: single-cell protein)
Vaksin dan Therapeutics Antibodies
Hibridoma → ditransfer ke kultur lain dan dibekukan
pada suhu sangat rendah. Aplikasi : tes umum untuk
kondisi spt radang tenggorokan dan alat tes kehamilan
Epitope → masuk ke tikus → membuat sel B →
antibodi → dikawinkan dengan sel kanker →
hibridoma → antibodi monoklonal
Improving Technique for Drug Delivery
- Terkadang obat dirancang dengan baik tapi tidak
efektif → masalah pengiriman obat, kelarutan,
penguraian obat oleh tubuh dan eliminasi obat oleh
hati dan ginjal → mengembangkan cara inovatif
untuk memaksimalkan efektivitasnya
- Mikrosfer → partikel kecil yang dapat diisi dengan
bahan obat, terbuat dari bahan yang sangat mirip
lipid
 hemoglobin manusia atau diproduksi menggunakan
fluorocarbon,
- Keuntungan :
a. Bebas penyakit dari darah asli
b. Pasokan darah yang konstan
c. Dapat disimpan untuk waktu yang lama
d. Cocok dengan semua golongan penerima
- Keterbatasan : Darah belum dibuat untuk
melakukan fungsi lain seperti menyediakan sumber
zat besi bagi tubuh atau menghilangkan karbon
dioksida dari tubuh

Regulatory Biotechnology

- Teknologi DNA rekombinan memicu perdebatan

lebih dari 30 tahun antara para ilmuwan, ahli
etika, media, pengacara, dll.
- Pada 1980-an disimpulkan bahwa teknologi tidak
Seny. larut air → tempel didalam menyebabkan bencana dan ancaman bagi
kesehatan manusia atau lingkungan
Seny. larut lemak → tempel diluar - Namun kekhawatiran difokuskan pada aplikasi
dan implikasi etis klon hewan. Klon hewan telah
dikembangkan dan khawatir bahwa ini dapat
Nanoteknologi dan Nanomedicine menyebabkan dilakukannya klon manusia (human
cloning)
- Nanoteknologi : Ilmu yang terlibat dalam
- Ada 2 aspek penting dalam pengaturan, meliputi:
merancang, membangun dan memanipulasi
1. Quality Assurance (QA) : mencakup semua
struktur pada skala nanometer (sepersejuta
kegiatan yang terlibat dalam mengatur
meter)
kualitas akhir produk
- Nanomedicine : Aplikasi nanoteknologi untuk
2. Quality Control (QC) : bagian dari QA yang
meningkatkan kesehatan manusia
melibatkan pengujian lab, pemantauan
- Para ilmuwan memikirkan perangkat kecil dalam
proses dan aplikasi untuk memastikan standar
tubuh yang menjalankan fungsi medis, contoh
produk yang konsisten
sensor nanodevice yang memonitor tekanan
darah, kadar oksigen darah dan konsentrasi Dari prosedur QA dan QC yang dirancang →
hormon memastikan bahwa produk bioteknologi
- Partikel nano dapat meng-unclog arteri yang memenuhi standar ketat untuk kemurnian dan
tersumbat kinerja nya.
- “Smart drugs” menggunakan virus atau partikel
nano lain untuk mencari dan menargetkan sel-sel
spesifik dan untuk mengirimkan muatan yang
akan mengobati atau menghancurkan sel-sel yang
rusak dengan cepat, efektif dan efeksamping yang
sedikit

ARTIFICIAL BLOOD

- Cell free solutions yang mengandung molekul yang

dapat mengikat dan mengangkut O2 dengan cara
yang sama seperti hemoglobin normal
- Tahun 2000 → Afrika Selatan menyetujui substitusi
darah yang disebut “Hemopure” dibuat dari
hemoglobin sapi, sementara yang lain dibuat dari
 PCR (Polymerase Chain Reactions)

→ Digunakan untuk mereplikasi bagian spesifik aja

Replikasi DNA

1. Lihat gambar. Yang pita atas mari kita sebut leading

strand yang bawah lagging strand (liat panah
merah di gambar)

2. Helikase menemukan ori membukan untaian

double helix
3. Protein single strand binding (SSB) menstabilkan
SSB
4. Kan bisa melilit ya kalau terus terusan dibuka jadi
ada Topoisomerase II (DNA gyrase) biar ga melilit
atau “overwinding”

Yang terjadi di bagian Leading Strand

5. Ada penambahan RNA primer pada ujung 5’ yang
disintesis oleh primerase
6. Setelah RNA primer nempel, DNA polymerase III
nanti memperpanjang DNA dari arah 5’ – 3’
7. Setelah panjaang nanti DNA polymerase I
menghilangkan RNA primer di ujung 5’ dan
digantikan oleh DNA dengan ujunng 3’ (kurang
paham)
8. DNA ligase lalu menempelkan ujung 3’ tadi ke
Leading strand yang dibuat tadi sama DNA
polymerase III

Yang terjadi di Lagging Strand

9. Kalau disini primase mensintesis RNA primer pada
ujung 5’ disetiap fragment Okazaki.
10. DNA polymerase III mensintesis lagging strand
terputus putus. Jadilah terbentuk fragment okazaki Denaturasi/ disosiasi
11. DNA polymerase I menghilangkan RNA primer di
ujung 5’ pada tiap fragment, dirubah jadi ujung 3’ → Pada pH dan suhu tinggi dobel helix jadi single
12. DNA ligase menghubungksn fragment okazaki strand
→ Pb A-T lepas duluan (krn Cuma 2 ikatan)
Note: seinget aku (ga ada catetan) karena proses → DNA yang misah juga disebut random coil
replikasi ini berjalan nya ke arah kiri terus, sedangkan
untuk pita yang dibawah alur 5’-3’ nya ke kanan (ga
kaya yang atas, atas mah ke kiri) makannya jadi putus
Renaturasi/ reasosiasi
putus fragment nya
→ Pelan pelan suhunya di dinginin buat nyari
pasangan basanya (reaksi lambat)
→ Kalau udah nempel langsung terjadi zippering
reaction
→ Jadi DNA dobel helix lagi

Preparasi template DNA Kromosom

1. Menumbuhkan dan panen kultur sel

- Kebanyakan bakteri dapat tumbuh pada media
cair di suhu 37oC putaran 150-250 rpm, hingga
kerapatan 2-3 x 109 sel/mL
- Pertumbuhan bisa dikontrol dengan membaca
optical density (OD) nya pada 600 nm (1 OD =
0,8 x 109 sel/mL)
- 2-3 x 109 sel/mL = OD 1,6-2,4
- Panen dengan cara di sentrifugasi

2. Penghancuran dinding sel

- Untuk mengeluarkan komponen sel
- Cara fisik: digerus
- Cara kimia: pake bahan kimia untuk merusak
dinding sel, bisa yang menyeran dinding sel
atau yang menghancurkan membrane sel dgn
extraction buffer
- Kombinasi

3. Inaktivasi enzim penghancur DNA dan RNA

(DNAses dan RNAse)

*tujuan extraction buffer

• Melarutan membrane sel (co: detergen,

chatropic salt, CTAB)
• Inaktivasi DNAse dan RNAse (co: Detergen,
chelator metal, agen pereduksi)
• Menghilangkan kontaminan (co: garam, CTAB,
PVP)

4. Pemisahan asam nukelat dari komponen lainnya

- Ekstrasi/ presipitasi
- Metode kromatografi adsorpsi
 Preparasi template DNA Plasmid

Isolasi Plasmid

Kembali ke PCR yahuu

→ Jadi bapak Kary Mullis penemu PCR berpikir,

kayanya bisa deh protein protein buat replikasi
DNA diganti, kecuali DNA Polimerase III. Jadilah
terbentuk PCR
→ PCR ini merupakan metode pembuatan spesifik
suatu segmen atau fragmen DNA
- Cuma butuh 1 sel DNA buat mulai
- Bisa ngopi tanpa bakteri atau plasmid
→ Target PCR adalah susunan DNA bagian ujung
ujung nya dari yang mau di copy
→ Proses PCR
- Pre- Denaturasi (90-95o)
- 30-35 siklus, tiap siklus ada
1. Pemanasan (90-95o) untuk memisahkan
strand → Denaturasi
2. Diturunkan suhunya (60-65o) → Aniling
3. Pemanjangan DNA (70-75o) → Ekstension
A. Primer
- Dalam PCR ada 2 primer: forward dan reverse
(dua duanya leading)
- Berupa untai tinggal yang komplemen dengan
kedua ujung yang mau di amplifikasi sebanyak
15-30 pb
- Syarat primer:
1. Fragmen DNA tidka boleh lebih dari 3
kilobasa
2. Kandungan GC harus 50% kalau engga
gampang putus
3. Primer gaboleh terlalu pendek nanti ga
spesifik
4. Urutan nukleotida yang komplemen harus
dihindari (self dimer, pair dimer, hair pin)
5. Suhu penempelan beda gimana primer
B. Temperature Aniling
- Harus dihitung melting temperature nya
Tm = (4x(G+C)) + (2x(A+T))oC
Contoh:
Forward
AATTGCCGGAATT
Tmf = (4x5) + (2x8)oC = 36oC
Reverse
ATTGCGCAATT
Tmr = (4x4)+(2X7)oC = 32oC
- Temperature kedua aniling tidak boleh jauh
berbeda
C. Urutan Kerja PCR
- Penyiapan/ isolasi DNA
- Perancangan Primer
- Pembuatan master mix (pencamouran semua
komponen PCR):
1. DNA template mengandung DNA target (<
1ɥg)
2. Ditambah sepasang primer masing2 0,1-
0,5 ɥM
3. dNTP (dATP, dTT, dGTP, dCTP) sebanyak
20-200 ɥM
4. Enzim DNA polymerase III 1-2,5 unit
5. MgCl2 sbg kofaktor enzim
6. Aquadest sbg penggenap
D. DNA Polymerase
- Diambil dari bakteri tahan panas
- Diambil dari Thermus aquaticus (Taq
polymerase) dari hot spring
- Taq ini iseng tiap dna yang dia panjangin ujung
3’ nya dikasih “AAAA”
 Sama, tapi untuk protein
- Buffer
Yang di garis merah
Campuran air dan ion
- Power supply dan chamber
Sumber dari partikel bermuatan negative
menggunakan katoda dan anoda

- Semakin ↑ konsentrasi semakin ↓ pori-

pori gel, semakin selektif pemisahan
- Step pembuatan agarose
E. Komponen PCR
Agarose + air → panaskan jangan
- MgCl2 : menstimulasi aktivitas DNA pol III dan
mendidih → masukan kecetakan →
membantu inkorporasi dNTP (5-2,5mM)
pasang sisir buat sumur
- Larutan dapar pH 8,3-8,8 untuk
- DNA dipisahkan berdasarkan muatan dan
mempertahankan pH larutan 7.
ukuran (muatan DNA negative)
- Air suling ganda/aquabides (ddH2O)
- Arus listrik jalan dari negative ke positif
- Kontrol PCR
- Saat mau elfor simpan dialas gelap biar
a. kontrol positif: menggunakan DNA templat
keliatan sumur nya
→ harus positif (ada pita)
- Suspensi DNA ditambah loading dye:
b. Kontrol negatif: tanpa DNA templat →
Agar massa jenis jadi lebih berat dan
harus negatif (tidak ada pita)
menandai udah sampe mana elfornya
Isi kontrol negatif:
(loading dye bakal ada di depan DNA)
1. Sepasang primer masing-masing 0,1-
- DNA stain/ pewarna DNA
0,5 µM
Contohnya etidium bromide/ SYBR green
2. dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
→ mewarnai dengan metode intercalary
sebanyak 20-200 µM
(masuk diantara ikatan basa nitrogen) →
3. Enzim DNA polimerase (1-2,5 unit)
bisa di tetes ke sumur atau dicampur di gel
4. MgCl2 (5-2,5mM)
- DNA Ladder (penggarisnya DNA)
5. Larutan dapar pH 8,3-8,8
→ DNA bisa dipotong pake enzim Bam HI
6. Air suling ganda/aquabides (ddH2O)
dll buat bikin DNA ladder
F. Thermocycler → Dilihat tebel dan lokasi pitanya trs
- Berupa waterbath yang diganti dengan bandingin
lempeng logam → untuk kuantitatif bisa pake kertas semi-
- Kalau PCR yang canggih, replikasi DNA nya log ( y = ukuran, x = jarak)
langsung disimpen otomatis di suhu 4oC

G. Deteksi hasil PCR

PCR konvensional: kalau pake PCR jadul harus diliat

udah ada berapa pita

1. Elektroforesis
- Gel agarose
Materi berpori yang digunakan untuk
memisahkan DNA Di elfor, katoda (-) anoda (+)
- Akrilamid
 Reserve Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-
PCR)

→ PCR yang digunakan untuk RNA (didalemnya ada

enzim yg bisa ngopi RNA jadi DNA)
→ Untuk RNA virus manusia ada polytail AAA nya jadii
Cuma butuh 1 primer T → oligo dT primer
→ Hasilnya DNA hybrid / c DNA
Bentuk DNA macem macem, itu semakin ke bawah → Tambahkan RNAse biar sisa RNA hilang → dapet
semakin small ukurannya DNA → masuk ke PCR biasa
2. Kolorimetri
- Mendasari realtime PCR u/ diagnosis
gausah sampe beres siklusnya karena
kalau udah ke copy berarti positif
- Nama pewarna: sonda (saat bendera
putus, dia berwarna) → gatau gajelas ☹

*Realtime PCR

Aplikasi PCR (ada 3)

1. Identifikasi organisme berdasarkan 16S

rRNA/18S rRNA
- RIbosom
• Fungsinya untuk produksi protein
• Mengandung rRNA dan protein
• Terbentuk dari 2 sub-unit yang menyatu
untuk sintesis protein
• Sel prokariot 70s, eukariot 80s

Prokariot
 Eukariot

• Gen 16S rRNA (16S rDNA) terdapat pada

sel prokariot dan archae (½ pro dan ½ eu)
• Gen 18S rRNA (18s rDNA) terdapat pada
sel eukariot
• Pada kedua gen tersebut terdapat
sequence DNA yang conserved → dapat
dipakai untuk identifikasi organisme
Primer universal 16 s rRNA

• Caranya: amplifikasi 16S rDNA/18S rDNA

menggunakan primer universal melalui
teknik PCR → DNA sequencing →
bandingkan dengan data base Primer universal 18S rRNA
• Kenapa pake 16 s dan 18 s karena mereka
- DNA Sequencing
sulit mutasi jadi bisa jadi acuan buat dibaca
Ini tu bisa digunakan misalnya buat nentuin ini tuh
urutan basanya
hewan baru lebih masuk ke spesies kadal atau ular
• Tapi RNA susah diisolasi langsung, jadi di
liat dari kemiripan susuan basa 16 s atau 18 s nya
copynya gen 16 s rRNA (16 s r DNA) pada
a. Metode sanger
sel prokatiot dan archae
- Untuk membaca urutan basa
- Ada reaksi dideoxynucleotides (ujung
gula pentosanya H bukan OH) pada PCR
kedua
- Kandungan dideoxynucleotides: ddATP,
ddGTP, ddTTP, ddCTP
- Step:
• Sintesis strand DNA komplemen in
vitro
• Pada tiap tabung ada:
- “normal” basa nitrogen
- dideoxy basa nitrogen
- DNA polymerase
- Primer
- Buffer + garam (MgCl2)
 - Suhu anniling cukup di 36oC
- Siklus bisa sampe 45 kali
- Primer pendek ini bakal nempel sesuka hati
dimana ada tempat yang cocok (kaya orang
leor 😊)
- Tapi yang di copy Cuma yang binding site nya
deketan dan berlawanan/ hadepan (jadi panah
nya pa tunjuk tunjuk antara yang atas dan yang
bawah) jarak yg bagus 100-1500 basa
b. Fluorescent tagging
- Tidak lagi pake radioactivity
- Semua 4 basa dalam 1 jalur (tiap basa
punya warna masing-masing)
Ini lawan arah jadi ora iso
- Dibaca otomatis

Ini arahnya sama jadi gabisa juga

2. Random Amplified Polymorfic DNA (RAPD)

- Suatu metode yang menggunakan primer
sangat pendek (10 basa) untuk menghasilkan
fragmen random dari DNA Ini hadap hadapan sih, tapi kejauhan (LDR)
- Fragmennya dapat dipisahkan dan digunakan
sebagai genetic marker (co: DNA fingerprint)
- Contoh aplikasi RAPD
• DNA Amplification Fingerprinting (DAF) –
Caetano & Anolles et al. (1991)- uses very
short (8 base) primers Akhirnya ketemu juga jodohnya, udah hadap
• Arbitrary Primed PCR (AP-PCR) - Welsh and hadapan, deket lagi yaudah lah cocok banget
McClelland (1990)- uses longer primers,
but lowers primer annealing stringency to
get priming at many sites
- Perbedaan PCR dan RAPD
 • Menentukan status penyakit
• Kasus kriminal: pembuktian
menggunakan sampel DNA
• Kasus paternity
• Genetic mapping
- Polidrom merupakan urutan basa yang
tersusun sama
- Polidrom ini bisa menghasilkan sticky end atau
blunt end

3. Restriction Fragment Length Polymorphism

(RFLP)
- Pemotongan DNA dengan enzim retriksi
menghasilkan fragment DNA dengan panjang
pasangan basa yang berbeda
- Tapi hanya bisa memotong pada bagian
polidrom (zona potong) enzim tersebut (jadi
kalau ada mutasi di zona itu bisa keliatan dari
hasil pemotongan nya
- Ini bisa digunakan untuk lihat ada mutasi atau
engga
Simulasi pemisahan fragmen nya

- Jadi misal pake enzim retriksi itu ada 3 zona

potong
- No 1. Orang normal ceritanya: jadi kalau pake
enzim tersebut pola pitanya gitu
- No. 2 orang dengan mutasi “single base pair
change” jadi pada salah satu tempat
pemotongan terjadi mutasi, jadinya gabisa di
potong: hasilnya cuma ada 1 pita dan lebih
- Fragment DNA nya bisa diidentifikasi dengan
mundur dari seharusnya karena fragmen
metode southern blotting
semakin panjang
- Step:
- No. 3 orang dengan mutasi “sequence
duplication” jadi diantara zona potong ada
duplikasi misal dari ATGCG jadi ATGGGCG,
jadinya fragmen yang dipotong jadi lebih
panjang. Terbentuk 2 pita tapi yang satu jadi
lebih mundur (karena lebih berat)
- Penggunaan RFLP ini
 Teknologi DNA Rekombinan

- Menggabungkan molekul DNA dari dua spesies

berbeda dan dimasukkan ke suatu inang (host)
untuk memproduksi kombinasi genetik yang
bernilai bagi sains, kedokteran, pertanian, dan
industri.
- Tujuan dasar : isolasi, karakterisasi, dan
memanipulasi gen

*RNA (Northern blotting) protein (western blotting)

Radioaktif probe

- DNA yang disintesis dengan urutan yang

diketahui dibuat dgn radioakif. Bakal berikatan
dengan sequence yang komplemen (DNA
probe)
- Nanti terlihat di x-ray
- DNA probe ini untaian nya kebalik dengan DNA
yang dicari
Sumber Gen

- Sel eukariot → ada intron → ambil mRNA nya

melalui PCR reverse transcriptase (enzim yang
dimiliki virus) → dihasilkan cDNA (complementary
DNA, berasal dari mRNA)
Virus yang punya enzim reverse transcriptase :
Virus HIV, hepatitis B
- Sel prokariot, jika DNA rekombinan
ditransformasi ke sel prokariot → dapat
digunakan DNA nya
- Jika sel eukariot ditranslasi ke sel prokariot →
Fotonya disini biar ga ketauan muehehe tidak akan terbentuk protein yang diinginkan
(bakteri tidak mengenal proses pemotongan
intron)
- Jika dari eukariot ke eukariot → lihat dulu
splicingnya sama atau engga
- Gen yang diamplifikasi dengan Taq DNA
Polimerase, pada ujungnya ketambahan ujung A
(Adenin)
- Taq DNA Polimerase → diambil dari Thermus
aquaticus
- Kenapa gak pakai polimerase bakteri biasa?
Karena perlu enzim yang tahan pada suhu tinggi
dan DNA polimerase sudah ada di PCR dari awal
proses. DNA pol bakteri biasa tidak tahan suhu
tinggi → terurai

Pemilihan Sel Inang

Contoh Host :

Vektor ekspresi → E. coli BL21

Vektor kloning → E. coli DH5α, E. coli top10
Karakter Protein Rekombinan :
- Glikosilasi → berperan pada aktivitas protein.
Digunakan host Pichia pastoris karena mirip
overglikosilasi manusia (Perhatikan over
glikosilasinya)
- Glikosilasi = Protein + gugus gula
- Tempatnya di Badan golgi, RE
- Overglikosilasi yang tidak mirip dapat
menyebabkan hipersensitivitas → induksi alergi
VEKTOR (Kloning dan Ekspresi)
- Vektor kloning (untuk memperbanyak DNA)
- Komponen transkripsi (Promotor, terminator,
RNA polimerase)
- Ori harus dikenali oleh sel host (protein inisiator)
kalau tidak dikenali → replikasi tidak akan berjalan
pGEM-T easy vector (p: plasmid, T: salah satu ujung nya
ditambah T (timin) dimana T akan nempel sama A dari
PCR)
Yang tulisannya miring → enzimnya berupa DNA
Ampr → ampicillin resisten (untuk seleksi)
Promoter → tempat duduk RNA polimerase
Lac Z → suatu enzim β galactosidase → untuk skrining
apakah DNA insert masuk atau tidak.
TRANSFORMASI
1. Memilih potongan DNA (DNA insert) yang akan
dimasukkan ke vektor
2. Memotong potongan DNA dengan enzim restriksi
dan kemudian mengikat DNA yang dimasukkan ke
vektor dengan DNA ligase
3. DNA insert mengandung penanda yang
memungkinkan untuk identifikasi molekul
rekombinan
4. Vektor dimasukkan kedalam host → dinamakan
proses TRANSFORMASI
Contoh host : E. coli. (sel host atau inang harus
dipersiapkan secara khusus untuk mengambil
foreign DNA)
White Blue Screening X-Gal

Warna putih yang mgd gen insert

 1. Vektor ekspresi dengan promotor kuat (RNA
Pol depat menduduki dan cepat
mentranskripsi)
More mRNA → More protein

2. Vektor ekspresi dengan promotor yang

diinduksi. Protein asing jika diekspresikan
berlebih bisa menjadi racun. Harus bisa di “on”
dan “off” → operator dan aktivator mengatur
kapan gen on atau off.
a. Drug Inducible (e.g. IPTG or arabinose)
b. Heat-inducible

Enzim Restriksi 3. Vektor ekspresi dengan fusion tag untuk

pemurnian afinitas. Memfasilitasi pemurnian
protein yang diekspresikan :
a. 6 Histidine tag
b. Glutathione transferase tag (GST)
c. Maltose-binding protein tag

Vektor Ekspresi (pET 32b)

- Sticky ends (runcing)

- Blunt ends (tumpul)
- Tujuan : untuk merekayasa genetik, Mengetahui
atau mengidentifikasi adanya perubahan urutan
basa nitrogen → Farmakogenomik (pengaruh
adanya suatu variasi genetik/reaksi pada DNA
yang dapat mempengaruhi aktivitas obat →
menyebabkan obat mengalami metabolisme yang
berbeda (karena DNA mengkoden protein →
protein berperan dalam proses metabolisme)

Vektor Ekspresi

Untuk menghasilkan produk gen kloning untuk studi

lebih lanjut. Menghasilkan protein dalam jumlah yang
cukup tinggi Syarat Vektor Ekspresi

- Promotor kuat : T7 promotor

 - Terminator kuat : T7 terminator
- RBS kuat
Lac Operon
Lac Operon (operon laktosa) → diperlukan untuk
transport dan metabolisme laktosa di E. coli dan
banyak bakteri lainnya.
Glukosa → sumber karbon yang lebih disukai. Tapi
ketika glukosa tidak ada → lac operon memungkinkan
mencerna laktosa. Laktosa digunakan sebagai sumber
energi. Terekspresi menjadi Lac Z, Lac Y, Lac A.
Jika ada glukosa → gen gen tidak terekspresi →
keadaan “off” (ada suatu repressor→ walaupun ada
RNA polimerase tidak akan melakukan transkripsi)
- Sistem ini diadaptasi oleh bioteknologi
- Lac I → gen yang mengkode “repressor”,
diproduksi secara konstitutif (selalu
terekspresi → jika terekspresi akan menduduki
operator → “on”
- Jika tidak ada laktosa → operon off. Jika ada →
protein
- DNA target disimpan di lac Z, Y, A
IPTG Induction
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) is a
molecular biology reagent (analog dengan laktosa).
Senyawa ini merupakan molecular mimic dari
allolactose, metabolit laktosa yang memicu transkripsi
operasi lac → digunakan untuk menginduksi ekspresi
protein dimana gen berada dibawah kendali operator
lac. Akan berikatan dengan operator → RNA pol dapat
bekerja sampai kodon stop
T7 RNA Polymerase (T7 gene I → tidak bisa RNA
polymerase biasa) → diproduksi kalau ada IPTG →
duduk di T7 Promotor
Tahapan Konstruksi Vektor Ekspresi Rekombinan
1. DNA insert pada vektor kloning dipotong oleh
enzim restriksi (pastikan DNA insert tidak
terpotong oleh enzim restriksi)
2. Vektor ekspresi juga dipotong dengan enzim
restriksi yang sama
3. Ligasikan DNA insert dengan vektor ekspresi
dengan bantuan enzim ligase
4. Masuk dalam sistem lac operon
Contoh Konstruksi Gen
 E. coli BL21 pLysS → mengkode gen lisozim T7. RNA
polimerase diproduksi sedikit-sedikit → diikat sama
lisozim agar produksi RNA pol tidak terlalu cepat, kalau
terlalu cepat → asing → menyebabkan kematian bakteri.

Setiap koloni yang tumbuh diperbanyak dibuat

masterplate nya

Konstruksi gen secara sintetik → DNA 2.0

- Ditambah sisi pengenalan (siapa tau ketika

diekspresikan vektor tsb kurang bagus → jadi
bisa dipindah ke vektor yang lain)

Cara menghitung jumlah protein yang dihasilkan

𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝐷𝑁𝐴
Jumlah protein = x 0,11 kDa
3

0, 11 kDa merupakan rata-rata berat asam amino.

Kodon Preference (kesukaan)

- Misal prokariot mengkode histidin AAU, tapi

eukariot mengkode CAU → dilihat kodon
preference yang tinggi frekuensinya
- Misal di insulin → AAU. Berarti di sel eukariot CAU
harus diubah jadi AAU
- Kalau gadilakukan optimasi kodon → bisa terjadi
ketidakcocokan.

Pasca Konstruksi Vektor Ekspresi Rekombinan

TRANSFORMASI ke dalam sel inang yang direkayasa

untuk vektor rekspresi rekombinan contohnya E. coli
BL21(DE3) → SELEKSI KLON (dengan menggunakan
antibiotik. Lalu ditambah X-gal. Koloni yang tumbuh
yang mengandung vektor ekspresi → berwarna putih)
Sel Bakteri yang digunakan untuk ekspresi gen
pengkode protein
Selanjutnya dari masterplate ini diambil satu ose lalu
ditumbuhkan di media cair, kemudian diinkubasi pada
suhu 37°C selama 18 jam. Sentrifugasi, sel dilisis, isolasi
plasmid
KARAKTERISASI PLASMID (contoh)
Identifikasi plasmid rekombinan pPICZαB-rTrmOto
hasil isolasi dari E. coli Top10F’. Lajur 1 plasmid
rekombinan pPICZαB-rTrmOto utuh tanpa
pemotongan dengan enzim restriksi; lajur 2: plasmid
rekombinan pPICZαB-rTrmOto setelah pemotongan
dengan enzim restriksi SacII dan EcoRI.

Perbedaan E. coli BL21 D3 → mengandung lisogen,

membawa gen T7 RNA polimerase (lebih kuat berikatan
Sekuensing
PENENTUAN URUTAN DNA SISIPAN (SEKUENSING)
Sekuensing dilakukan dengan mengirimkan sampel
vektor rekombinan + primer (sampel dikirim ke
Macrogen, Korea)
Contoh Hasil sekuensing
Overproduksi Protein
“Kromatografi Afinitas” → PEMURNIAN
Dinamakan “overproduksi” karena protein
rekombinannya hasil overekspresi (menggunakan
inducer spt IPTG yang berikatan dengan Lac I) → sistem
ini didorong untuk dilakukan secara berlebih
Overekspresi → untuk gen, DNA
Overproduksi → untuk Protein
- Dibutuhkan starter → ditumbuhkan selama 1
malam, dimasukkan 1% (jangan lupa ditambah
antibiotik) ke media → inkubasi 37℃ dengan
kecepatan 150 rpm.
OD600 nm = 0,6-0,7 → berada di phase log → jumlah
sel optimum. Karena pada fase stationer, jumlah
bakteri hidup = jumlah bakteri mati → tidak
optimum
- Setelah mencapai fase log → tambah inducer →
inkubasi 37℃ selama 2-6 jam
- Lakukan pemanenan sel → sentrifugasi → ambil
peletnya/supernatannya (tgt protein)
KARAKTERISASI PROTEIN EKSTRAK
- Karena ditambah histag → ada ekor histidinnya.
Disebut protein fusi (protein rekombinan+tag)
- Di kromatografi ada gugus Nikel → berikatan
dengan gugus histidin → protein terpisah dari
pengotor → pengotor keluar
Ni-NTA Sepharase → yang berikatan dgn histidin
- Lalu ditambah imidazole → Nikel berikatan
dengan imidazole → protein tunggal
Pemurnian terdapat 3 tahap
1. Flow Through → Pengikatan protein target pada
kromatografi
2. Washing → membersihkan dari pengotor
3. Eluting → memisahkan protein target
Kelebihan : Kemurnian protein tinggi, initial capturing
Kekurangan : Resin terbatas, Perlu modifikasi protein,
Pemutusan tag
PROTEIN INTRASELULAR Sifat protein yang digunakan saat pemurnian

Yang berada didalam sel biasanya mengendap →

membentuk badan inklusi → aktivitas terganggu →
dipaksa keluar melalui periplasma → banyak lipatan
(Protein chaperon) → membantu pelipatan protein →
aktivitas tidak terlalu dikhawatirkan

Jika ada histag mau dipotong → harus ada faktor XA

Pemisahan
PROTEIN EKSTRASELULAR
A. Ion Exchange kromatografi
• Protein dikeluarkan dari sel - Udah tau lah ya udah pinter abf heuheuheu
• Dalam konstruksinya harus menambahkan leader
sequence atau sinyal peptide

Pemurnian Protein

Tahapan dalam pemurnian protein

Tipe resin Kation Anion

Buat pemisahan
+ _
partikel muatan
Resin yang pake - -
Kondisi running pH 0,5-1,5 pH 0,5-1,5
dibawah pl dari diatas pl dari
sampel sampel
Persyaratan kemurnian protein

B. Gel Filtration (size exclusion)
- Pink: molekul nya sangat kecil jadi masuk ke dalam
pori pori gel, kontak denga gel dan buffer jadi lama
keluarnya
- Biru: ukuran sedang jadi masuk ke sebagian pori-
pori, lumayan lah jalannya
- Merah: sedikit banget yang masuk ke dalam pori
pori jadi keluarnya cepet
C. Reverse Chromatography
- Pada fase normal: fase diam – polar, fase gerak –
non polar, untuk pemisahan senyawa polar
- Pada fase terbalik: fase diam – non polar, fase
gerak – polar, untuk senyawa non polar
D. Affinity chromatography
- Pake resin yang bisa mengikat protein khusus
- Contoh:
1. Protein A sepharose: mengikat IgG
2. GSH sepharose: glutathione transferase
3. NNi-NTA sepharose: PolyHistidine
4. Chitin bead: sellulose binding protein
Penambahan affinity tag dengan teknologi DNA
rekombinan
- Kebanyakan protein ga punya affinity bead spesifik
untuk diikat
- Bisa ditambahin tag spesifik untuk pemurnian
 Kelebihan

- kemurnian protein yang tinggi

- initial capturing

Kekurangan

- Resin yang terbatas

- memerlukan modifikasi protein
- pemutusan tag

Tahapan Purifikasi

Pasti ga keliatan tapi gapapa ya biar rame:(

Uji Aktivitas Protein

SDS-PAGE
Karakterisasi Protein - versi yang sudah di modif dari PAGE dimana
- Flow through digunakan Sodium dodecyl sulphae
- Wash - SDS ini merupakan suurfaktan amfipatik
- Elution - SDS mendenaturasi protein dengan berikatan
dengan rantai protein pada hidrokarbon ‘tail’ nya.
Menutupi rantai protein dengan surfaktan
- Bagian polar SDS ada untungnya (?)

- Pada native page ga ada SDS jadi protein dlm

bentuk aktifnya
 Produk Farmasi Berbasis Bioteknologi • IIa: mengganggu molekul dan organisme
• IIb: mengirimkan senyawa lain atau protei
C. Grup III
- Vaksin
• IIIa: melindung terhadap agen berbahaya
• IIIb: mengobati penyakit autoimun
• IIIc: mengobati kanker
D. Grup IV
- Agen diagnostic

Protein terapetik

- Bidang yang relatif baru dan berkembang di mana

prinsip-prinsip bioteknologi diterapkan pada
pengembangan obat-obatan

Stategi produksi protein rekombinan

- Manusia: Gen mengandung intron

- Protein: komplek/modifikasi sistem mamalia
- GRAS: (Generally Recognized As Safe) : tidak
patogen, tidak toksik, tidak menghasilkan
antibiotic

Insulin

A. Insulin Lispro
Klasifikasi peptide dan protein terapetik berdasarkan
mode aktfitasnya

A. Grup I
- Terapetik dengan aktifitas enzimatik atau
regulasi
• Ia: mengganti priten yang rusak atau
abnormal
• IIa: mengaugmentasi jalur yang ada (?)
• IIIa: memberikan aktivitas baru
B. Grup II
- Terapetik dengan special aktivitas target
B. Insulin Aspart

Insulin

Insulin manusia Kandungan proinsulin tidak lebih dari

C. Insulin Glargine 10 ppm Teknologi DNA rekombinan Protein asal inang
tidak boleh lebih dari 10 ppm

Identifikasi:

- HPLC, Peptide mapping

- Endotoksin bakteri
- Related compounds: HPLC (A-21 desamino insulin
dan bentuk insulin lainnya tidak lebih dari 2.0%)

Eritopoetin

Karakter insulin

Eritopetin (Bp 2000)

Hormon glikogen Stimulasi pembentukan sel darah

merah Pengobatan anemia dan kelainan terkait 34
kDa; 60% karbohidrat

Kontaminan Dalam Produk Berbasis Bioteknologi

Endotoksin Bacterial Endotoxin Test

Protein sel inang SDS-PAGE;
Immunoassay
Protein lain (media) SDS-PAGE;
Immunoassay
DNA Hibridisasi
Spektrofotometer UV
Pengikatan protein
Protein mutan Peptide mapping; HPLC;
MS
 Metionin Teroksidasi Peptide mapping;
analisis asam
amino;HPLC;MS
Proteolitik IEF;SDS-PAGE;HPLC
Protein Teragresasi Hibridisasi
Spektrofotometer UV
Pengikatan protein
Deaminasi Peptide mapping; HPLC;
MS

Eksipien (siklodekstrin)

- Untuk memperbaiki stabilitas fisik dan kimia suatu

senyawa aktif (industri kimia)
- Untuk meningkatkan bioavaibilitas suatu senyawa
Kultur Jaringan
obat yang kurang larut dalam air (industri farmasi)
- Untuk menghilangkan kolesterol dari susu (industri
makanan)
- Untuk menunda proses pertunasan benih (industri
pertanian)
- Contoh:

Siklodekstrin

Transgenic Plant

Metabolit Sekunder

A. Artemisinin
- Artemisinin sebagai antimalaria dan
antikanker
- Kadar pada daun (normal 0.05-0.2%, tertinggi
1.4%), hanya disimpan di kelenjar sekresi Biosimilar
trichome, sulit disintesis secara kimia (karena
terdapat jembatan endoperoxide dan banyak Produk bioterapeutik yang memiliki
atom C kiral), herba tahunan kemiripan/kesetaraan mutu, keamanan dan efikasi
dengan pembanding. Istilah lain untuk produk
Kultur Jaringan sebagai alternatif produksi metabolit biosimilar adalah follow - on biological
sekunder

Yang mahal mahal itu :{