Analisis dilakukan dengan menggunakan aliran cytometer LSR BD (Beckon Dickinson, San

José, CA, USA). Eksitasi dicapai dengan laser argon-ion (488 nm) dan laser HeCd (325 nm);
fluoresensi hijau terdeteksi dengan filter pass band FL1 (530/30 nm), fluoresensi merah dengan
filter pass panjang FL3 (> 670 nm) dan fluoresensi biru dengan filter pass band FL4 (510/20
nm). Secara total, 30.000 peristiwa spesifik sperma dievaluasi dan diklasifikasikan sebagai
proporsi: Hidup, Superoksida negatif; Hidup, Superoksida positif; Superoksida yang mati
positif; Langsung, H2O2 negatif; Langsung, H2O2 positif; Mati, H2O2 negatif; Mati, H2O2
positif (%).
Status membran mitokondria
Aliquot semen (300 μL) pada konsentrasi sperma sekitar 2,5 × 106 / mL, dicampur dengan 1,2
μL 5,5 ′, 6,6′-tetrachloro-1,1 ′, 3,3′tetraethylbenzimidazolylcarbocyanineiodide ( JC-1) (stok 3
mM) dan diinkubasi selama 40 menit pada 38 ° C seperti yang dijelaskan oleh Garner dan
Thomas [12]. Fluoresensi JC-1 diukur dalam saluran FL1 (530/30 nm) dan FL2 (585 nm) dari
flow cytometer. Secara total, 10.000 sel dievaluasi dan diklasifikasikan dalam dua kategori:
aktivitas pernapasan tinggi (fluoresensi oranye) dan aktivitas pernapasan rendah (fluoresensi
hijau).
Uji struktur kromatin sperma
Integritas kromatin dievaluasi menggunakan metakromatik pewarna acridine orange (AO).
Indeks fragmentasi DNA (% DFI) dinyatakan sebagai proporsi sel dengan terdenaturasi, untai
tunggal DNA (fluoresensi merah) dari total populasi (stabil, DNA untai ganda [fluoresensi
hijau] + DNA untai tunggal). Alikuot (20 μL) dari semen yang dicairkan dicampur 1: 1 (v / v)
dengan buffer TNE, dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada suhu - 80 ° C. Untuk
analisis, sampel dicairkan pada es, dan alikuot (10 µL) dicampur dengan 90 μL TNE diikuti
oleh 200 μL larutan deterjen asam. Setelah 30 detik, AO (600 μL) ditambahkan dan sampel
dianalisis dalam 3-5 menit menggunakan sitometer FACStar Plus Flow dengan pengaturan dan
perangkat lunak seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Morrell et al. [13]
Status akrosom
Status akrosom sperma dan viabilitas sel dinilai menggunakan fluorescein isothiocyanate-PNA
(FITC-PNA) labeling dan PI, masing-masing. Alikuot (300 μL) semen, yang sebelumnya
diencerkan hingga konsentrasi sperma 2 × 106 / mL, dicampur dengan 3 μL FITC-PNA
(sebelumnya diencerkan sepuluh kali dengan buffer yang diperkaya dengan 10 mM Kalsium
dan Magnesium) dan 3 μL PI , dan diinkubasi pada suhu 38 ° C selama 10 menit [14, 15].
Fluoresensi dari 50.000 peristiwa sperma dicatat setelah menghilangkan peristiwa non-sperma.
PI terdeteksi menggunakan filter longpass FL 3 (> 670 nm), sementara fluoresensi FITC-PNA
terdeteksi pada 515–545 nm di FL1. Subpopulasi sperma dikategorikan sebagai akrosom hidup
yang bereaksi, akrosom mati rusak, akrosom hidup tidak bereaksi dan akrosom mati tidak
bereaksi (%).
Fertilitas
Tingkat non-kembali 56 hari setelah inseminasi pertama dalam 130 hingga> 1000 sapi tersedia
untuk sapi jantan. Untuk 19 ekor sapi perah, skor indeks kesuburan diberikan untuk inseminasi
dalam> 1000 sapi, yang telah dihitung dengan menyesuaikan tingkat tidak-kembali untuk
memperhitungkan faktor-faktor seperti usia dan paritas betina, lokasi peternakan, inseminator
dll.
Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SAS (ver. 9.3; SAS Inst.).
Untuk mengevaluasi perbedaan antara kedua kelompok sapi jantan, analisis varians (PROC
GLM) diterapkan, menggunakan model statistik termasuk efek dari breed. Hubungan antara
kualitas sperma dan kesuburan (baik 56-hari tingkat non-kembali atau skor indeks kesuburan)
dianalisis dalam tipe sapi jantan (sapi atau susu) menggunakan korelasi peringkat Spearman.
Hanya sapi jantan dengan lebih dari 130 sapi yang dimasukkan dalam analisis korelasi. Dalam
semua kasus, P <0,05 dianggap signifikan. Untuk menyelidiki interaksi extender dan jenis
semen yaitu daging sapi atau susu sapi jantan, analisis multivariat dilakukan dengan Partial
Least Squares Regression (PLS) menggunakan perangkat lunak Simca (versi 14; Solusi
Analisis Data MKS, Umeå, Swedia), seperti dijelaskan pada situs web http: // onlin elibr
ary.wiley .com / doi / 10.1002 / cem.1006 / penuh.
Hasil
Konsentrasi sperma
Konsentrasi rata-rata (± SD) adalah 88 ± 20 × 106 / mL dan 55 ± 19 × 106 / mL masing-masing
untuk daging sapi dan susu sapi jantan, masing-masing (P <0,001).
Morfologi sperma
Morfologi normal untuk sapi dan sapi perah adalah masing-masing 76 ± 8% dan 87 ± 6% (P
<0,05).
Kinematika CASA
Kecuali untuk motilitas total, motilitas progresif dan BCF, kinematika sperma secara signifikan
berbeda untuk kedua jenis semen (Tabel 1). Sebagian besar kinematika lebih tinggi untuk
spermatozoa sapi perah daripada sapi jantan

Integritas membran
Semen daging sapi jantan mengandung proporsi yang lebih rendah dari spermatozoa utuh
(Tabel 2) dibandingkan semen sapi perah (masing-masing 40 ± 11% berbanding 46 ± 8%; P =
0,053).
Stres oksidatif
Pada sampel kontrol dan sampel yang distimulasi dengan menadione (Tabel 3), terdapat
perbedaan yang signifikan (P <0,001) antara sapi perah dan sapi perah dalam superoksida
negatif hidup dan spermatozoa positif superoksida hidup (P <0,001). Selain itu, dalam sampel
yang tidak distimulasi dengan menadione, ada kecenderungan ke arah signifikansi (P <0,08)
untuk sel sperma negatif H2O2 yang mati antara kedua jenis sapi jantan, meskipun tidak ada
perbedaan signifikan yang diamati untuk kategori ROS lainnya. Dalam sampel yang
distimulasi dengan menadione, tren ke arah signifikan terlihat untuk spermatozoa positif H2O2
hidup (P <0,055) dan mati, spermatozoa negatif H2O2 (P <0,066) antara kedua jenis sapi
jantan.