Tujuan pengujian kualitas oosit untuk mengetahui kemampuan fertilisasi dan perkembangan

ke stadium blastosist, menimbulkan kebuntingan, dan akhirnya menghasilkan anak yang

hidup.

Maka dari itu, digunakan parameter yang pasti, seperti pembelahan dan produksi blastosist
sebagai pengukuran kualitas oosit.

http://yudhiestar.blogspot.com/2010/05/kualitas-oosit-dan-embrio.html

tingkat fertilisasi oosit tidak

hanya ditentukan oleh genetik namun ada faktor lain
yang mempengaruhi fertilisasi. Kegagalan fertilisasi
dapat disebabkan oleh beberapa hal, antara lain: (1)
proses maturasi inti maupun sitoplasma yang kurang
sempurna karena kualitas oosit yang rendah (2)
kegagalan spermatozoa melakukan kapasitasi dan
reaksi akrosom sehingga spermatozoa tidak mampu
membuahi oosit, (3) kegagalan spermatozoa
mengalami kondensasi dalam sitoplasma oosit
sehingga terjadi kegagalan pembentukan pronukleus
jantan (Crozet et al. 1995 dalam Hermilinda, 2014).

Hermilinda, Bambang. 2014. Tingkat Fertilisasi Oosit Sapi Silangan Simmental Peranakan
Ongole Secara In Vitro. Vol. 1, No. 6, 28 – 31. Jurnal Imlu Ternak. Kupang.

Penentuan kualitas oosit dapat dilakukan dengan beberapa metode untuk memilih oosit yang
akan digunakan pada proses FIV. Metode seleksi oosit yang banyak digunakan adalah
pemilihan oosit berdasarkan morfologi sel kumulus yang berada disekitar oosit (Lonergan et
al. 1994; Alvarez et al. 2009). Teknik grading merupakan cara yang lebih mudah dan objektif
untuk mengevaluasi sel-sel kumulus oosit yang komplek. Keberadaan sel kumulus
mendukung pematangan oosit sampai pada tahap metaphase II dan pematangan sitoplasma
yang diperlukan untuk kemampuan perkembangan setelah fertilisasi (Abeydeera 2002). Oosit
dengan kumulus yang multilayer digunakan dalam produksi embrio secara in vitro (Qian et
al. 2005). Menurut Gordon (2003), kriteria pemilihan oosit yang berkualitas baik dapat dilihat
dari bagian ooplasma yang homogen, sel kumulus yang kompak mengelilingi zona pelusida.
Oosit yang dikoleksi dikategorikan menjadi 4 grade berdasarkan kualitasnya: grade A adalah
oosit yang memiliki kumulus yang seragam dan kompak dengan dikelilingi oleh lima lapisan
atau lebih sel kumulus. Oosit dengan grade B adalah oosit yang memiliki sitoplasma yang
gelap dengan komplemen dari korona radiata yang lengkap tetapi dikelilingi tidak lebih dari
lima lapis sel kumulus. Oosit dengan grade C adalah oosit yang ditandai dengan oosit yang
kurang seragam dan warna sitoplasma lebih transparan dan tidak merata serta terlihat tidak
kompak. Oosit dengan kategori D mempunyai sitoplasma yang transparan bahkan terdapat
fragmentasi pada sitoplasma. Sel-sel kumulus yang mengelilingi oosit terlihat sangat jarang
dan bahkan beberapa oosit tidak memiliki sel kumulus.

perkembangan folikel ovarium terjadi selama siklus estrus dari mana

terjadi ovulasi (progesteron relatif lebih besar), ada tingkat kehamilan yang lebih besar
daripada pada sapi yang memiliki ovulasi dari
folikel dominan yang berkembang selama gelombang pertama perkembangan folikel ovarium
(progesteron yang relatif lebih rendah)
P4 yang lebih rendah dapat menyebabkan perbedaan dalam komposisi cairan folikuler (Cerri
et al.,
2011), ekspansi kumulus dan kompetensi oosit (Fair and Lonergan, 2012). Konsentrasi P4
yang relatif lebih rendah menyebabkan gangguan pematangan nuklir oosit
Muhammad Saad, et al. 2019. Effect of plasma progesterone on oocyte recovery, oocyte
quality, and early in-vitro developmental competence of embryos in Bos indicus dairy cows.
Volume 202. Animal Reproduction Science. Pages 80-86. Elsevier B.V.

Kualitas oosit adalah salah satu faktor penting dalam kesuburan wanita,
pematangan in vitro (IVM), dan perkembangan embrionik selanjutnya
[1]. Untuk ternak khususnya, IVM digunakan untuk menghasilkan banyak tanaman dewasa
oosit yang mampu berkembang menjadi embrio [2]. Cumulus-oosit
complexes (COCs), terdiri dari oocyte dan sekitarnya
sel kumulus, adalah unit lengkap, fungsional, dinamis yang memainkan a
peran penting dalam metabolisme oosit selama pematangan [3]. Antara
oosit dan sel kumulus, pertukaran dua arah nutrisi
dan molekul sangat penting untuk pematangan oosit, kumulus
ekspansi sel, dan perkembangan embrionik selanjutnya [4]. Itu
* Penulis yang sesuai. dua faktor parakrin turunan oosit primer, protein morfogenetik tulang
15 (BMP15) dan faktor diferensiasi pertumbuhan 9 (GDF9),
berpartisipasi dalam penangkapan meiosis oosit dan mendukung dan mengatur
metabolisme sel kumulus, pematangan, pertumbuhan, dan ekspansi [5].
Hormon steroid diproduksi oleh sel kumulus, seperti progesteron
(P4) dan estradiol (E2), juga terlibat dalam pengaturan penting
fase siklus reproduksi, termasuk pertumbuhan oosit dan
pematangan [6].
Metabolisme energi sangat penting untuk pematangan oosit dan perkembangan embrionik
selanjutnya, karena proses dinamis ini
mengkonsumsi sejumlah besar energi yang berasal dari berbagai substrat,
termasuk karbohidrat, asam amino, dan lipid [7]. Metabolisme karbohidrat (termasuk
glukosa, piruvat, dan laktat)
oleh oosit ditandai dengan baik [8]. Selain karbohidrat,
asam lemak, yang beberapa kali lebih kaya energi daripada karbohidrat, juga merupakan
sumber energi penting untuk pematangan dan
mengembangkan oosit

Hui-Yan Xu, 2018. Treatment with acetyl-L-carnitine during in vitro maturation of buffalo
oocytes improves oocyte quality and subsequent embryonic development. Vol 118 Pg 80-89.
Theriogenology Elsevier Inc.

Selama oogenesis, oosit diatur oleh berbagai gen itu

berkumpul menjadi program molekuler untuk menentukan morfologi dan
kualitas oosit. Ekspresi gen abnormal biasanya menghasilkan
disfungsi atau dislokasi komponen oosit, seperti mitokondria, gelendong, atau butiran
kortikal (CG), yang akibatnya
mengurangi potensi oosit dan mempengaruhi kualitas
embrio yang dihasilkan selanjutnya
Yue Xie, et al. 2018. Oocyte-specific deletion of Gsα induces oxidative stress and
deteriorates oocyte quality in mice. Experimental Cell Research 370 (2018) 579–590.
Elsevier Inc.

Mrna ibu direkrut, diterjemahkan, dan terdegradasi secara spesifik

waktu di mana gen zygotik diaktifkan (Li et al.,
2013). Inaktivasi transkrip ibu terjadi melalui
proses deadenylation (Huarte et al., 1992), terkait dengan protein pengikat RNA (Gu et al.,
1998; Davies
et al., 2000), dan eliminasi melalui aksi kelas
RNA pembungkaman kecil (ssRNA).
Pembungkaman gen pasca-transkripsi (PTGS) oleh RNA untai ganda (dsRNA) atau
interferensi RNA (RNAi)
telah menjadi teknik mapan untuk mempelajari gen
fungsi (Tabel 1) (Paradis et al., 2005). Misalnya,
peran fungsional untuk Cyclin B1 dan C-mos dalam kontrol sapi
pematangan oosit telah diidentifikasi (Paradis et al., 2005;
Nganvongpanit et al., 2006), sedangkan, JY-1, Follistatin, KPNA7,
dan MSX1 ditemukan memainkan peran penting di awal
perkembangan embrio pada sapi (Bettegowda et al., 2007;
Lee et al., 2009; Tejomurtula et al., 2009; Tesfaye et al.,
2010)

M. Moussa. 2015. Maternal control of oocyte quality in cattle “a review”. Animal

Reproduction Science 155 (2015) 11–27. Elsevier B.V

Dalam sel somatik, mitokondria memainkan peran penting dalam akumulasi kalsium,
apoptosis, dan produksi energi. Pada hewan domestik dan
manusia, satu oosit mengandung sekitar 100.000 mitokondria. Mitokondria memasok ATP ke
oosit melalui oksidasi dan asam lemak
fosforilasi oksidatif untuk pertumbuhan oosit, pematangan, pemupukan,
dan perkembangan embrio awal (Reynier et al., 2001; Dumollard et al.,
2004; Santos et al., 2006; Dunning et al., 2010; Iwata et al., 2011). Itu
angka mitokondria diyakini sangat penting sejauh oosit yang mengandung jumlah rendah dan
kualitas rendah mitokondria memiliki
kualitas oosit rendah (May-Panloup et al., 2005; Zhang et al., 2006).
Oleh karena itu, penting untuk mengontrol kualitas mitokondria dan
kuantitas dalam oosit untuk digunakan dalam teknologi reproduksi berbantuan pada manusia
dan hewan.
Kami sebelumnya melaporkan bahwa mitokondria uncoupler (CCCP) yang diinduksi
depolarisasi mitokondria dalam oosit babi mengarah ke Sirtuin.
1 (SIRT1: histone deacetylase) - dan protein kinase yang diaktifkan AMP
(AMPK) - degradasi mitokondria dan biogenesis, dan
mempertahankan kualitas mitokondria dan kemampuan oosit untuk
berkembang menjadi blastokista (Itami et al., 2015). Selanjutnya, kami juga
menunjukkan bahwa resveratrol, penggerak potensial dan spesifik SIRT1, mendorong
degradasi dan biogenesis mitokondria, dan meningkatkan
kemampuan perkembangan oosit (Sato et al., 2014). Penemuan-penemuan ini
menunjukkan bahwa aktivasi SIRT1 non-invasif efektif dalam meningkatkan
kualitas mitokondria, serta kemampuan perkembangan
oosit.
Karpe dan Tikoo (2014) melaporkan bahwa stres panas jangka pendek (SHS)
pada tikus membalikkan ekspresi rendah SIRT1 yang diinduksi diet tinggi lemak
jaringan aorta. Mereka selanjutnya menyarankan bahwa ekspresi SIRT1 yang tinggi di
jaringan berasal dari aktivasi sengatan panas akibat stres panas
protein 72 (HSP72). Henstridge et al. (2014) menunjukkan tikus itu bersama
Aktivasi tampilan berlebih HSP72 dari SIRT1 dan AMPK, dan
peningkatan jumlah mitokondria pada otot rangka. Selanjutnya,
Ekspresi berlebih HSP72 meningkatkan aktivitas mitokondria dan mengembalikan
resistensi insulin yang diinduksi obesitas pada otot rangka (Chung et al.,
2008). Selanjutnya, Liu dan Brooks (2012) menunjukkan bahwa SHS menginduksi
biogenesis mitokondria pada otot rangka melalui aktivasi
dari jalur HSP72 / SIRT1, bersama dengan peningkatan selanjutnya dalam
ekspresi PGC1α dan TFAM, yang mengatur biogenesis mitokondria. Namun, sejauh
pengetahuan kami, tidak ada penelitian yang menyelidiki apakah SHS efektif untuk aktivasi
SIRT1, juga
sebagai peningkatan kemampuan perkembangan oosit.
Dalam penelitian ini, kami menginkubasi oosit babi pada 41,5 ° C, yang
adalah 3 ° C lebih tinggi dari kondisi kultur normal, untuk 1 jam pertama di
titik waktu awal pematangan in vitro dan memeriksa

Nobuhiko Itami. 2018. Short-term heat stress induces mitochondrial degradation and
biogenesis and enhances mitochondrial quality in porcine oocytes. Journal of Thermal
Biology 74 (2018) 256–263. Elsevier Ltd.

Suplementasi quercetin meningkatkan perkembangan folikel, oosit

kualitas, dan mengurangi apoptosis ovarium pada kelinci selama musim panas
Introduction
Stres panas (HS) membahayakan efisiensi reproduksi oleh
mengubah spermatogenesis, perkembangan folikel dan oosit atau
pematangan pada hewan. Selama bulan-bulan musim panas, beberapa variasi
terjadi pada tingkat hipotalamusepituitaryegonadal
Sumbu (HPG) bertanggung jawab atas kesuburan rendah [1,2]. Telah
menggambarkan bahwa laju pertumbuhan folikel yang tidak tepat [3], berubah
dalam konsentrasi estradiol, mengurangi ekspresi reseptor LH dan
aktivitas aromatase yang rendah menunda proses ovulasi di bawah HS [4]. Di
Selain itu, paparan hewan betina ke HS selama praovulasi
fase mengurangi kualitas oosit dengan keterlibatan peningkatan
produksi spesies reaktif oksidatif (ROS) [5]. Meskipun, HS tidak memiliki
pengaruh pada kerusakan vesikel germinal (GVBD) selama oogenesis,
menghambat dalam memulai kembali metafase I (MI), metafase II (MII) dan
pengembangan blastokista selanjutnya [6,7]. Variasi dalam lemak
rasio asam, protein peredam panas, dan tingkat antioksidan menurunkan
tingkat pematangan oosit [8] di bawah HS. Tingkat apoptosis lebih tinggi pada
sel granulosa sebagai respons terhadap HS, adalah faktor lain yang bertanggung jawab
pengurangan kompetensi oosit [9].
Tingkat pematangan oosit dan perkembangan embrio adalah
terkena dampak negatif karena stres oksidatif dan panas. Antioksidan
memiliki kapasitas untuk meningkatkan tingkat kelangsungan hidup oosit dan mengurangi
kerusakan yang disebabkan oleh HS. Dalam hal ini flavonoid dapat
menghambat dengan reaksi kimia yang merusak secara biologis di
organ reproduksi dan mengais produksi ROS [10].
Di antara berbagai kelas flavonoid, kuersetin adalah
flavonoid paling umum, secara alami ada dalam sayuran, buah-buahan,
teh, dan anggur merah. Ia bekerja sebagai antioksidan kuat dan memiliki ROS
kemampuan memulung yang mengandalkan konfigurasi molekulnya. Itu
quercetin (3,5,7,30,40-pentahydroxyflavone) bereaksi dengan tidak berpasangan
radikal dengan menyumbangkan proton dan menjadi radikal bebas itu sendiri.
Namun, radikal tidak berpasangan yang dihasilkan dihilangkan dengan resonansi
yang membuat quercetin radikal lemah dan kurang reaktif dengannya
energi minimum [11]. Biasanya, tiga kelompok struktural (cincin B odihydroxyl
kelompok, kelompok 4-okso dalam konjugasi dengan 2,3-
alkena, dan gugus 3 dan 5-hidroksil) menstabilkan kuersetin
molekul dan membantu bertindak sebagai antioksidan [12]. Quercetin
dianggap sebagai pengatur potensial reproduksi oleh
memediasi sistem pensinyalan mTOR yang diperlukan untuk sel
pertumbuhan, proliferasi, dan kelangsungan hidup [13].
Secara umum, dinamika ovarium menghasilkan kelebihan produksi
ROS selama tahap akhir perkembangan folikel dan pada saat itu
ovulasi. Kelebihan produksi ROS dihentikan oleh aktif
sistem antioksidan enzimatik dalam sel. Sedikit peningkatan ROS
diperlukan untuk dimulainya kembali meiotik dari penangkapan diplotene di
oosit mamalia; Namun, berlebihan ROS di ovarium atau
Ketidakseimbangan dalam keadaan redoks menyebabkan keadaan stres oksidatif. Itu
peningkatan stres oksidatif menyebabkan perubahan sitoplasma yang tidak dapat diubah
dan daerah nuklir oosit terbungkus oleh folikel itu
lebih lanjut mempengaruhi kapasitas pembuahan oosit [14]. Quercetin
melindungi sel kumulus dengan memuncaknya peroksidasi lipid,
mempertahankan enzim antioksidan dan mengurangi apoptosis
melalui memodifikasi sinyal XIAP, BAX, BCL2 dan caspase-3
ekspresi [15].
Sejauh pengetahuan kami, tidak ada laporan tunggal tentang
efek pemberian makanan tambahan quercetin pada reproduksi
efisiensi kelinci betina di bawah HS telah dipublikasikan. ini
berhipotesis bahwa diet yang diperkaya quercetin makan bisa a
cara untuk meningkatkan kinerja reproduksi kelinci betina oleh
mengurangi stres oksidatif, terutama selama musim panas
bulan. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi
dampak suplementasi kuersetin pakan pada pengembangan folikel,
apoptosis, produksi oosit atau pematangan selama panas
periode musim panas pada kelinci.
2. Materials and methods
Penelitian ini dilakukan di Unit Hewan Laboratorium,
Departemen Reproduksi dan Inseminasi Buatan, Fakultas Sastra Indonesia
Kedokteran Hewan, Universitas Adnan Menderes saat panas
bulan-bulan musim panas (Juli hingga September 2015). Percobaan itu
dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh perawatan hewan
komite dan sesuai dengan pedoman kelembagaan
(ADÜ-HADYEK No. 64583101/2014/153).
2.1. Memberi makan dan pengelolaan kelinci betina
Total tiga puluh empat kelinci betina berumur sekitar 8e9 bulan
dan berat badan (3,2 ± 0,3 kg) dipilih dari garis murni
Kelinci Putih Selandia Baru yang dikembangkan di laboratorium fakultas
satuan hewan. Semua wanita yang dipilih adalah nulipara dan memiliki
tidak pernah dibiakkan. Kelinci ditempatkan di kandang individual
(70 50 35 cm3) di AC dan berventilasi baik
ruangan untuk jangka waktu satu tahun. Untuk menyesuaikan diri dengan stres panas, itu
hewan tidak memiliki fasilitas kondisi udara, setidaknya satu minggu
sebelum awal studi, selama bulan musim panas yang sangat panas (Juli). Itu
kelinci betina yang dipanaskan dengan panas kemudian dibagi menjadi dua kelompok
(n ¼ 17 / setiap kelompok) dan diberi makan dengan diet basal (kelompok HS) atau
ditambah quercetin (Quercetin hidrat; 30 mg / kg tubuh
berat badan, 337951, Sigma-Aldrich, St. Louis, AS) (kelompok QU-HS)
selama 18e20 hari berturut-turut.
2.2. Penilaian stres panas
Suhu lingkungan dan kelembaban relatif dicatat
dua kali sehari melalui thermohygrometer digital. Suhu yang lembab
Indeks (THI) dihitung melalui persamaan yang diadaptasi oleh
Marai et al.
THI ¼ db_C e [(0.31e0.31 _ RH) _ (db _ _C - 14.4)]
The heat stress level was categorized based on the THI values
which are as follows:
No heat stress _ 27.8 THI
Moderate heat stress ¼ 27.9 to 28.9 THI
Severe heat stress ¼ 28.9 to 30.0 THI
Extreme heat stress _ 30.0 THI.
2.3. Koleksi oosit
Oosit dikumpulkan melalui laparotomi. Hewan dipelihara
off-feed untuk jangka waktu 18 jam sebelum prosedur bedah. Binatang
diberikan obat pre-anestesi intravena (Xylazine)
dan diikuti oleh anestesi (Ketamine). Sayatan garis tengah
dibuat untuk mendekati rongga perut. Indung telur itu
terletak, dipegang dengan forsep ibu jari dan dicuci dengan PBS steril. Semua
folikel dengan rentang ukuran antara 1 dan 3 mm dipilih untuk
aspirasi oosit dengan menggunakan jarum suntik insulin. Setelah itu, sayatan
dijahit dan hewan dirawat di bawah perawatan intensif selama tiga
hari.
2.4. Pemeringkatan dan pengukuran kumulus oofor kompleks
(COC)
Setelah pengumpulan, oosit dicuci tiga kali dalam TCM-199
medium (Sedang-199 M4530 Sigma-Aldrich, St. Louis, AS). Itu
COC kompak yang dikumpulkan dikelompokkan ke dalam tiga kategori dasar
sehubungan dengan lapisan kompleks oosit kumulus sekitarnya: The
oosit terbesar dikelilingi oleh lapisan jumlah maksimum
sel kumulus dinilai sebagai A. Oosit ditutup dengan 3-4
lapisan sel kumulus dinilai sebagai B, sedangkan oosit tanpa
lapisan kumulus (sel gundul) dinilai sebagai C. Dimensi COCs
termasuk zona ke zona jarak (mm), seluruh COC di
bidang horisontal dan tegak lurus (mm) diukur di bawah
stereomicroscope (Olympus SZ51, Jepang) pada perbesaran 40.
2.5. Pematangan oosit in-vitro
Oosit grade A dan B dipilih dan sekitar 8e10 oosit
disimpan dalam media maturasi selama 24 jam di bawah steril
penutup minyak mineral. Media pematangan (TCM199) ditambahkan
dengan 50 mM Hepes (HEPES sodium salt H3784 Sigma-
Aldrich, St. Louis, AS), 0,3 mM natrium piruvat (Sodium piruvat
P5280 Sigma-Aldrich, St. Louis, AS), 10% serum janin janin (FBS
F0804 Sigma-Aldrich, St. Louis, AS), stimulasi folikel 10 mg / mL
hormon (FSH, Folltropin 700 IU Bionichi Kesehatan hewan Eropa ltd
Dublin Irlandia), 5 IU / mL hormon human chorionic gonadotrophin
(hCG Pregnyl 1500 IU NV Organon Oss-Holland), 100 IU / mL penisilin
G potasium, 50 mg / mL streptomisin sulfat.
2.6. Penilaian maturasi oosit: ekspansi kumulus dan
pewarnaan nuklir
Pematangan oosit dinilai dengan ekspansi sel kumulus
tingkat COC dan pewarnaan nuklir. Ekspansi sel kumulus dalam COC,
dikenakan media pematangan, diamati setelah 24 jam
inkubasi di bawah mikroskop stereo. Tingkat ekspansi kumulus (%)
dikategorikan sebagai non-diperluas (kepatuhan ketat dari sel kumulus
ke zona pelusida), sebagian diperluas (perluasan
cumulus sekitar ~ 200 mm diameter dari zona pellucida)
atau sepenuhnya diperluas (ekspansi massa sel kumulus sekitar
lebih besar dari ~ 300 mm dari diameter zona pellucida).
Untuk status nuklir dalam oosit matang, fluoresensi DAPI
metode dilakukan [17]. Secara singkat, sel kumulus adalah
dihilangkan dengan pemipaan yang lembut dan oosit difiksasi dalam paraformaldehyde 4%
solusi selama 30 menit pada suhu kamar. Setelah itu,
oosit diinkubasi dalam 0,5% Triton X-100 (Triton X-100,
X100, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) dalam solusi DPBS untuk permeabilitas
selama 30 menit. Setelah permeabilisasi, oosit diinkubasi
dalam buffer yang mengandung 2% BSA (Bovine Serum Albumin, A9418,
Sigma-Aldrich, St. Louis, AS) untuk 1 jam. Akhirnya, oosit itu
diwarnai dengan DAPI (DAPI 406-diamidino-2-phenyindole, dilactate,
D9542, Sigma-Aldrich, St. Louis, AS) untuk mengamati nuklir mereka
isi. Oosit yang diwarnai dipasang pada slide kaca dan
diperiksa menggunakan mikroskop epifluoresensi untuk status nuklir. Itu
status nuklir diklasifikasikan ke dalam berbagai kategori: 1) germinal
vesikel (GV), adanya bahan kromatin yang terkondensasi dalam oosit;
2) germinal vesicle break-down (GVBD), oosit dengan tersebar
bahan kromatin; 3) metafase-I (MI), adanya clumpy
kromatin dengan pembentukan jaringan bivalen individual yang tidak beraturan
atau pelat metafase tanpa badan kutub di oosit dan 4)
metaphase-II (MII), oosit dengan satu atau dua benda kutub yang berbeda
bintik-bintik kromatin.
2.7. Ovarium pengambilan dan penimbangan
Pada paruh kedua percobaan, lima kelinci betina (a
subset dari masing-masing kelompok) dibantai untuk pengambilan ovarium. Setelah
pengumpulan, ovarium ditimbang dan diproses untuk histopatologi
dan imunohistokimia.
2.8. Histopatologi ovarium
Indung telur yang diambil tetap dalam paraformaldehyde netral berbahan 4%
larutan. Semua sampel tetap mengalami dehidrasi dengan
etil alkohol (50e100%) dan tertanam dalam parafin. Tertanam
jaringan dibelah (5 mm) dan kemudian diwarnai dengan hematoxylin /
eosin. Dua bagian histologis dari setiap ovarium diamati
di bawah mikroskop cahaya untuk menyortir populasi folikel (Olympus
BX 51, Jepang). Folikel yang diamati dikategorikan ke dalam primordial,
folikel primer, sekunder dan antral berdasarkan jumlah
lapisan sel granulosa yang mengelilingi oosit. Jumlah
folikel untuk setiap kategori dihitung secara terpisah.
2.9. Imunohistokimia ovarium
Untuk menentukan apoptosis dalam sel granulosa, bagian ovarium adalah
diwarnai dengan menggunakan metode TUNEL. Aktivitas apoptosis dalam sel adalah
diamati melalui kit TUNEL yang tersedia secara komersial (Millipore
“APOPTAG® Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit”) oleh
mengikuti instruksi dari pabriknya. Secara singkat, bagian
parafin dan dideparfininasi dalam alkohol dengan pencucian seri.
Setelah itu, sampel dicuci dengan PBS dan diinkubasi
dalam proteinase K (20 mg / mL) selama 15 menit pada suhu kamar dan
kemudian dicuci dua kali dalam air suling selama 2 menit. Kemudian, slide
bagian disimpan dalam larutan H2O2 3% selama 5 menit dan kemudian dicuci
dua kali dengan PBS selama 5 menit. Untuk reaksi TUNEL, bagian-bagiannya adalah
diinkubasi dalam ruang lembab pada 37 C selama 1 jam menggunakan 50 mL tetes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dan fluorescein-dUTP
(29-ke 59-deoksiuridin trifosfat). Reaksi diamati
di bawah mikroskop fluoresen. Bagian yang disiapkan bergetar
dengan 1/34% larutan kit air suling (Stop / Wash) selama 15 detik dan
kemudian diinkubasi lebih lanjut pada suhu kamar selama 10 menit dalam waktu yang sama
larutan dan dicuci dengan PBS (3 1 menit). Setelah itu, slide
ditutupi dengan konjugat anti-digoksigenin peroksidase yang disiapkan
dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit dan kemudian
dicuci lagi dengan PBS (4 2 mnt). Akhirnya, sampel disimpan
dalam 0,045% (v / v) mengandung 0,08% H2O2 (b / v) 3, 3-diaminobenzidine
larutan tetrahydrochloride (DAB) selama 3e6 menit untuk menginduksi
reaksi kromogenik. Pada akhirnya, reaksi diamati di bawah
mikroskop cahaya dan sampel dicuci dengan air suling
(3 1 mnt). Bagian diwarnai dengan hematoxylin Mayer
dan mengalami dehidrasi dalam pengenceran alkohol serial. Slide yang disiapkan adalah
ditutupi dengan coverlip. Bagian kontrol negatif juga
disiapkan dengan cara yang sama, namun, mereka tidak dirawat
reaksi TUNEL terminal transferase. Slide diamati pada a
mode acak dengan memilih lima bidang berbeda (10 tubulus / bidang)
untuk menghitung sel TUNEL-positif menggunakan mikroskop cerah
di bawah 20 perbesaran. TUNEL pewarnaan positif menunjukkan
tingkat kerusakan DNA dan tipe sel yang terkena yang menerangi
berwarna coklat. Kehadiran sel granulosa apoptosis dalam
folikel dihitung secara terpisah untuk setiap jenis folikel dan disajikan
sebagai sel TUNEL positif rata-rata di setiap kategori folikel.
2.10. Serum malondialdehyde (MDA)
Untuk menentukan status peroksidasi lipid dalam stres panas
tingkat serum MDA kelinci diperiksa. Secara singkat sampel darah
dikumpulkan pada akhir uji coba eksperimental. Serumnya adalah
dipisahkan melalui sentrifugasi (3000 rpm, 10 menit). Yang dikumpulkan
sampel serum disimpan pada 20 C sampai analisis. Konsentrasi MDA adalah
diukur dengan zat reaktif asam tiobarbiturat
(TBARS) dalam serum yang didasarkan pada reaksi antara MDA dan
asam tiobarbiturat. Volume 1,75 mL larutan (0,67%
Asam tiobarbiturat dan asam 20% 2-tiobarbiturat) ditambahkan
0,25 mL sampel serum. Sampel direbus pada suhu 95 C untuk
30 mnt dan sampel terpapar ke lemari pendingin untuk menurunkan
suhu. Dalam sampel yang didinginkan, volume 2 mL n-butanol adalah
ditambahkan, vortex dengan benar dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit pada
4 C. Setelah sentrifugasi, supernatan diperoleh dan
absorbansi diukur melalui spektrofotometer (Shimadzu
UV-1601, Kyoto, Jepang) pada 532 nm. Nilai yang diperoleh adalah
dihitung dengan menggunakan rumus berikut. Konsentrasi MDA adalah
dinyatakan sebagai mmol / mL.

Σ∆535 = 1.56 x 106 M-1cm-1

Discussion
Suhu lingkungan yang lebih tinggi mempengaruhi acara reproduksi
seperti folliculogenesis, fertilisasi, perkembangan embrionik, uterus
lingkungan, dan kesuburan pada hewan sasaran. Di latar belakang ini, the
laporan yang tersedia mengkonfirmasi bahwa oosit dikumpulkan dari panas
betina terpapar, mudah mengalami perubahan seperti apoptosis yang
mengurangi pematangan in vitro dan kapasitas pemupukan. Dalam
penelitian ini, pengaruh HS dan dampak perbaikan quercetin
pada pengembangan folikel, kualitas oosit dan kompetensinya untuk
menjadi dewasa telah dievaluasi. Ini adalah studi pertama dari jenisnya
yang menggambarkan dampak positif quercetin pada perkembangan folikel,
produksi oosit, dan aktivitas apoptosis di bawah HS
kondisi.
Musim panas HS menyebabkan tingkat kehamilan yang rendah karena penurunan
perekrutan dan pengembangan folikel [18,19]. Pada saat ini
studi, lebih sedikit jumlah oosit yang diambil dan perkembangan folikel
menunjukkan efek yang merugikan dari HS pada reproduksi pada wanita
kelinci. Folikel mengandung pertahanan antioksidan yang mapan
sistem yang melindungi integritas fungsional dan struktural
membungkus sel oosit dan granulosa di sekitarnya. ROS memainkan peran vital
peran untuk terjadinya ovulasi; Namun, semakin tinggi produksi ROS
dalam folikel dalam kondisi stres menyebabkan penuaan oosit [20]. Karenanya, a
keseimbangan antara produksi ROS dan sistem antioksidan dalam
folikel adalah prasyarat untuk kelangsungan hidup oosit dan sekitarnya
sel granulosa selama kondisi normal dan stres [21]. Dalam
penelitian ini, wanita HS diberi makan dengan kuersetin diet
yang merupakan senyawa antioksidan kuat. Kehadiran lebih tinggi
jumlah folikel dan oosit yang diambil dari kelompok yang diberi quercetin
jelas bahwa ROS tambahan telah dihapuskan oleh ketentuan quercetin
pada kelinci HS. Temuan saat ini sejalan dengan
Pengamatan sebelumnya, di mana vitamin C diberikan kepada wanita HS
kelinci [19]. Demikian pula, Beazley dan Nurminskaya [22] melaporkan hal itu
asupan quercetin oral meningkatkan perkembangan folikel dan
fekunditas pada tikus betina muda. Atresia folikuler kemungkinan disebabkan oleh
produksi ROS tinggi, sementara itu, kehadiran jumlah yang lebih tinggi
folikel pada ovarium kelompok QU-HS mungkin terkait dengan
suplementasi quercetin [23]. Selain itu, semakin tinggi konsentrasi FSH
merangsang sintesis glutathione di dalam folikel yang di dalamnya
gilirannya mengurangi tingkat ROS dan selanjutnya menurunkan insiden
apoptosis sel granulosa [24]. Ini berspekulasi bahwa diet
quercetin mungkin terlibat dalam stimulasi FSH yang secara tidak langsung
meningkatkan sintesis GSH yang pada gilirannya menghilangkan ROS yang berlebihan
dari pengembangan folikel.
Tingkat pematangan oosit tergantung pada oosit awal
ukuran. Oosit dengan ukuran kecil tidak dapat matang; namun demikian
oocyte dengan dimeter lebih dari 80% dari ukuran akhir, memiliki kapasitas
untuk melanjutkan proses meiosis. Pada kelinci, rata-rata oosit
diameter (tanpa zona pellucida) sekitar 147 mm [25]. Dalam
penelitian ini, diameter yang lebih rendah (143 mm) oosit dikumpulkan di
kelompok yang diberi quercetin dan ukuran oosit yang dikumpulkan ini mampu
untuk melanjutkan aktivitas meiotik. Demikian pula, telah dilaporkan
bovine oocyte dengan diameter 100 mm [26] dan 115 mm [27]
melanjutkan kompetensi meiotik penuh (tahap MII) dan perkembangan
kompetensi untuk tahap blastokista. Perbedaan tidak signifikan
dalam hasil tingkat IVM menunjukkan bahwa oosit dikumpulkan baik
dari quercetin kelompok yang diberi suplemen atau tidak
sama-sama mampu menjalani pematangan, terlepas dari oosit
ukuran.
Dalam penelitian ini, hasil yang sama diperoleh setelah pematangan
dari oosit yang dikumpulkan dari quercetin yang ditambah atau
kelinci betina HS tanpa tambahan. Sebaliknya, peningkatan oosit
tingkat maturasi dilaporkan dalam laporan sebelumnya [19]. Tambahan
studi direkomendasikan untuk mengungkap temuan terperinci tentang
efek quercetin pada oosit, pematangan, pemupukan dan selanjutnya
perkembangan embrio dalam kondisi HS. Sejumlah penelitian
tersedia mengenai efek kuersetin pada oosit selama in vitro
percobaan [28,29]. Namun, ada variabilitas besar di antara yang dilaporkan
hasil yang berkaitan dengan tingkat dosis quercetin. Sebagai tambahan,
perbedaan yang tidak signifikan ini dapat dikaitkan dengan
impedansi eCG / FSH, yang membantu untuk mempertahankan tingkat GSH
dalam mengembangkan folikel [30] dan aktivitas steroidogenik folikel
sel [31]. Dalam penelitian ini, eCG atau FSH belum digunakan
stimulasi ovarium; Oleh karena itu, sejumlah ke cil GSH dalam oosit tanpa FSH tidak dapat
mempertahankan antioksidan internal
sistem terhadap produksi ROS yang lebih tinggi. Kondisi ini mungkin
bertanggung jawab untuk menginduksi perubahan apoptosis atau ireversibel pada
sel granulosa, oosit dan tingkat maturasi oosit selanjutnya.
Perlu dicatat bahwa oosit diproduksi di bawah tekanan
kondisi, kurang memiliki kemampuan untuk matang karena mengandung tinggi
tingkat ROS. Suplemen antioksidan dalam pematangan
media atau menyuntikkan antioksidan ke wanita adalah strategi untuk diatasi
berbagai HS menyebabkan perubahan ireversibel pada oosit [32]
misalnya penyimpangan kromosom meiotik [33], perubahan pada tahap GV
oosit [34], dan penurunan ekspresi gen ibu [35]. Di
Selain itu, konfigurasi nuklir dan sitoplasma oosit
organel memiliki sensitivitas tinggi terhadap perubahan yang diinduksi HS [36].
Sebelumnya, peran apoptosis pada penghambatan meiosis pada oosit HS dan
pengaruh pada mikrotubulus aktin dan mikrofilamen di sitoskeleton
oosit telah didokumentasikan [9]. Ini penting untuk
menjaga konfigurasi kedua kompartemen agar berhasil
pematangan oosit. Oleh karena itu, penyelidikan yang luas diperlukan
untuk mengeksplorasi perubahan yang diinduksi HS dan efek perbaikan
flavonoid yang berbeda pada kompartemen nuklir dan sitoplasma
dari oosit.
Sel-sel kumulus mempengaruhi tingkat pematangan oosit [37] dan
membantu memerangi stres oksidatif [38] dengan mensintesis protein dan
memperketat persimpangan GAP yang mempertahankan transformasi
agen pengatur untuk mekanisme tahan-termal. Perubahan
dalam mekanisme ini dan insiden apoptosis yang lebih tinggi di Indonesia
sel kumulus bisa menjadi alasan yang masuk akal untuk oosit yang sama
tingkat pematangan antar kelompok dalam penelitian ini. Penelitian sebelumnya
telah menunjukkan bahwa kuersetin melindungi sel kumulus terhadap kadmium
diinduksi toksisitas dengan mempertahankan sistem antioksidan dan
mengurangi apoptosis [15]. Apalagi penentuan tekad
ekspresi faktor-faktor terkait stres dalam sel kumulus bisa
menarik untuk mengungkapkan pengaruh quercetin di bawah HS.
Dalam penelitian ini, apoptosis folikel pada primer, sekunder
atau tahap antral telah diselidiki selama kondisi HS.
Aktivitas apoptosis dalam sel granulosa sangat menurun pada
quercetin menambah kelompok HS. Insiden apoptosis adalah
maksimal pada folikel primer dan antral, namun, folikel primordial
tetap tidak terpengaruh. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya bahwa apoptosis memiliki
hubungan positif dengan produksi ROS yang berlebihan [39],
sehingga tingkat apoptosis yang lebih rendah dalam folikel quercetin ditambah
kelompok jelas menunjukkan aksi antioksidan kuat quercetin
melawan stres oksidatif. ROS tinggi dan konsentrasi GSH rendah
di bawah tekanan bisa menjadi alasan yang mungkin untuk apoptosis yang lebih tinggi pada
sel granulosa dari folikel antral. Apalagi quercetin
administrasi memainkan peran penting dalam mengurangi ekspresi
interleukin yang bertanggung jawab untuk peningkatan superoksida
tingkat dismutase dan kemampuan beradaptasi hewan terhadap iklim panas.
Level GSH yang lebih tinggi dan pemberian antioksidan menghambat proses
sel apoptosis granulosa [40]; Oleh karena itu, penentuan
Penanda antioksidan atau kadar MDA dalam cairan folikuler bisa jadi
membantu untuk mengeksplorasi keterlibatan ROS dalam sel granulosa
apoptosis selama HS. Dampak flavonoid pada kompetensi oosit
dan pengembangan embrio lebih lanjut perlu dieksplorasi.
Terlebih lagi, sebuah studi elaboratif tentang ekspresi apoptosis atau
faktor-faktor terkait stres dalam mengembangkan folikel atau dalam oosit bisa
membantu memahami mekanisme terkait stres pada molekul
tingkat.