RNA Isolation Protocol

Alat untuk penghancuran sample :

 Ice box (berisikan ice serut)

 Cawan petri
 Gunting + pinset steril
 Homogenizer *untuk sample organ yang sulit dihancurkan, i.e: heart muscle, skeletal muscle
 Rack tube
 Eppendorf tube 1,5 ml (sebanyak sample organ) *beri label sesuai nomor urut sample
 Falcon tube 10ml untuk Genazol
 Alumunium Foil untuk membungkus Genazol
 Micropippet 1000 mikroliter + Tip micropippet pasangannya (warna biru)
 Tempat sampah (gelas kimia yang dilapisi tissue atau botol air mineral) *pisahkan sampah
sekali buang dengan sampah recycleable, i.e: eppendorf tube, tip micropippet

Bahan :

 Sample organ (ambil secara cepat di dalam kulkas -80 derajat celcius) *Dilakukan secara
cepat untuk meminimalisir kerusakan sample lain yang tersimpan di dalam kulkas)
 Tissue
 Glove & masker
 Genazol/Trizol
 Chloroform
 Isopropanolol
 Ethanol 75%
 DEPC Water
 Alcohol untuk membersihkan area

1. Isi absensi lab sentral

2. Ketuk pintu sebelum masuk ke lab
3. Sapa orang di dalam
4. Simpan tas, pakai jas lab
5. Berdo’a untuk kelancaran dan hasil yang maksimal
6. Siapkan area kerja, bersihkan menggunakan alcohol spray
7. Siapkan sample organ.
8. Larutkan sample organ (ukuran secukupnya, rasio 1:5 dengan larutan Genazol/Trizol yang
digunakan) ke dalam Genazol/Trizol 200/300/500 mikroliter. Hancurkan dengan
Homogenizer
9. Inkubasi di suhu ruangan selama 10/15 menit
10. Tambahkan chloroform 1/5 dari Genazol
11. Vortex selama 10-20 detik
12. Sentrifugasi dengan kecepatan 11.200 rpm di suhu 4 derajat celcius selama 10 menit
13. Ambil supernatan. Simpan di tube yang baru
14. Gabungkan dengan isopropanol dengan rasio 1:1. Goyangkan.
15. Vortex selama 5-10 detik
16. Inkubasi selama 5 menit
 17. Sentrifugasi dengan kecepatan 11.200 rpm di suhu 4 derajat celcius selama 10 menit
18. Buang supernatan
19. Tambahkan ethanol 75% ke dalam endapan 500 mikroliter
20. Buang supernatan. Flash centrifuge
21. Tambah depc sebanyak 30-100 mikroliter. Kondisikan di suhu dingin (Pakai ice box)
22. Analisis menggunakan spectrophotometri

Analisis menggunakan spectrophotometri:

1. Nyalakan komputer dan spectrophotometer

2. Buka software ...
3. Pilih “... RNA”
4. Gunakan wadah yang sesuai
5. Bersihkan wadah dengan cara meneteskan 2 mikroliter cairan blank (di sini yang digunakan
adalah depc) di seluruh titik yang akan digunakan, lalu lap menggunakan tissue
6. Setelah bersih, teteskan kembali cairan blank ke wadah
7. Mulai lakukan uji blank
8. Setelah selesai, bersihkan, lalu teteskan 2 mikroliter RNA sample ke semua titik yang
digunakan
9. Masukan ke dalam mesin spectrophotometer
10. Klik “start” pada software
11. Setelah selesai, akan muncul hasil di dalam aplikasi microsoft excel
12. Hasil yang baik adalah jika ratio RNA berada di antara 1,8-2,1
13. Simpan sisa RNA sample di dalam box RNA di kulkas