REVIEW ARTIKEL : AKTIVITAS INTEIN SELF-CLEAVAGE DIINDUKSI

PH, SUHU DAN PEREAKSI THIOL DALAM DALAM PEMURNIAN

PROTEIN

Abstrak

Proses pemurnian protein bertujuan agar didapatkan suatu protein target atau
protein rekombinan murni yang memiliki manfaat pada aspek kesehatan maupun
industri produk bioteknologi. Pemurnian protein target dapat menggunakan berbagai
protokol yang berbeda diantaranya menggunakan tag sebagai penanda dengan tujuan
dihasilkan protein target yang murni dalam jumlah banyak dan pada akhir pemurnian
tag tersebut perlu dihilangkan dimana langkah ini menimbulkan berbagai masalah
terkait kontrol kualitas misalnya keamanan produk akhir, retensi aktivitas atau
stabilitas protein target sehingga solusi bagi masalah tersebut mendapatkan strategi
baru dalam proses pemurnian dengan menggunakan intein self cleavage sebagai
penanda yang akan lepas dengan sendirinya jika diinduksi pH, suhu dan pereaksi
thiol.

Kata kunci : Pemurnian protein, intein self cleavage, pH, suhu, pereaksi thiol.

Abstract

Protein purification process aims to obtain a target protein or pure

recombinant proteins that have beneficial effects on the health aspects of
biotechnology and industrial products. Purification of target proteins can use a variety
of different protocols of which use the tag as a marker with the goal generated target
protein that is pure in large quantities and at the end of the purification of the tag
needs to be removed where these steps lead to various problems related to quality
control such as safety of the final product, retention of activity or stability target
protein so that a solution for the problem to get a new strategy in the refining process
by using intein self-cleavage as a marker to be off by it self if induced by pH,
temperature and thiol reagents.
Keyword : Protein purification, intein self cleavage, pH, temperature, thiol reagent.

Pendahuluan

Aspek bioteknologi dalam menghasilkan suatu protein rekombinan telah

memiliki dampak mendalam pada sektor industri farmasi dimana satu pasar yang
secara khusus diuntungkan adalah produksi besar-besaran protein target yang murni.
Penggunaan tag epitop telah menyederhanakan pemurnian protein dan menurunkan
biaya serta mempersingkat waktu (Wood et.al,2014). Tag epitop mengapit urutan
protein (baik pada terminal N- atau C), memfasilitasi pemurnian dengan
mengeksploitasi afinitas tag untuk matriks tertentu. Salah satu tag yang paling umum
digunakan adalah tag hexa-histidine. Protokol pemurnian berbasis afinitas semacam
itu umumnya hanya memerlukan satu langkah untuk mendapatkan protein yang
sangat murni dengan hasil tinggi. Selain itu, protokol pemurnian tersebut dapat
dengan mudah diadaptasi untuk skala besar, membuatnya sangat nyaman untuk
aplikasi industri (Saraswat et.al,2013).

Akan tetapi kelemahan dari pendekatan ini adalah bahwa tag umumnya perlu
dihilangkan pada akhir pemurnian, langkah tersebut memerlukan biaya yang mahal
dan menyebabkan hilangnya protein target murni dimana langkah ini sangat penting
jika protein target akan digunakan sebagai produk komersial dalam industri makanan
atau farmasi. Seringkali, penghilangan tag difasilitasi oleh pembelahan proteolitik
menggunakan endopeptidase, secara inheren meningkatkan biaya seta menimbulkan
berbagai masalah terkait kontrol kualitas (misalnya keamanan produk akhir, retensi
aktivitas atau stabilitas protein target) (Elleuche and Pogeller, 2010).

Strategi baru yang dapat menyederhanakan proses ini khususnya untuk

aplikasi industri adalah penggunaan inteins dalam strategi pemurnian protein yang
dapat mengurangi biaya operasional tanpa mempengaruhi kemurnian protein target
(Fong et.al,2010). Penggunaan inteins untuk pemurnian protein dimulai pada akhir
1990-an, dengan modifikasi intein Sce VMA1 dari Saccharomyces cerevisiae sebagai
tag untuk memfasilitasi pemurnian protein dari prokariotik dan eukariotik. Sejak itu
banyak metode untuk menggunakan inteins sebagai tag pemurnian protein yang
efisien telah dikembangkan. Umumnya, intein ditempatkan di antara tag afinitas dan
protein target dengan menggunakan sistem pemurnian IMPACT (Intein Mediated
Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) (Miraula et,al,2015).

Sistem pemurnian IMPACT (Intein Mediated Purification with an Affinity

Chitin-binding Tag) memiliki keunggulan dibandingkan dengan sistem penanda
afinitas lainya. Sistem ini hanya memerlukan satu kolom, tidak perlu langkah
tambahan untuk menghilangkan penanda afinitas, dapat dilakukan terhadap urutan
protein natif, dapat dilakukan terhadap protein target yang dilekatkan pada intein
melalui N-terminal maupun C-terminal, serta tidak memerlukan enzim protease
tambahan (NEB 2013).

IMPACT adalah suatu sistem pemurnian protein yang dikembangkan oleh

New England Biolabs (NEB). Sistem IMPACT memanfaatkan aktivitas pemotongan
terinduksi dari suatu protein yang disebut intein. Intein adalah protein analog dari
intron, berada dalam kerangka yang diapit urutan protein lain yang disebut ekstein
(Wu et al. 2002). Intein dapat mengalami pemotongan dengan penambahan reagen
tiol atau perubahan suhu dan pH, sehingga memfasilitasi protein untuk terlepas dalam
keadaan murni (NEB 2013).

Metode

Sumber data yang digunakan

Referensi yang digunakan pada pada review artikel ini diperoleh dari internet berupa
jurnal ilmiah nasional atau internasional yang dipercaya sebagai jurnal primer,
kemudian text book yang resmi sebagai sumber data sekunder, dan website
terpercaya sebagai sumber data tersier.
Pencarian istilah dan strategi pencarian data
Pencarian istilah yang dilakukan dalam mendapatkan referensi jurnal ilmiah
terpercaya dan text book untuk review article ini yaitu dengan menggunakan kata-
kata atau kalimat yang berhubungan dengan self cleavage, intein, dan IMPACT.
Strategi pencarian yang dilakukan untuk mendapatkan referensi jurnal ilmiah dan text
book terpercaya dengan menggunakan beberapa situs search engine seperti
google.com, dan google scholar, juga digunakan situs-situs penyedia jurnal-jurnal
ilmiah seperti ncbi, science direct, dan elsivier.
Kriteria seleksi data (inklusi dan ekslusi)
Kriteria inklusi dalam penyeleksian sumber-sumber yang sudah didapatkan baik
berupa jurnal ilmiah atau text book resmi adalah yang memuat informasi mengenai
pemurnian protein target yang menggunakan sistem pemotongan sendiri atau self
cleavage intein sebagai suatu protein penanda yang diinduksi Ph, suhu dan pereaksi
thiol dimana sudah diujikan pada beberapa pemurnian protein target atau protein
rekombinan sehingga didapatkan suatu protein yang memiliki kemurnian tinggi.
Untuk sumber jurnal digunakan jurnal dengan publikasi 10 tahun ke belakang
terakhir. Kriteria ekslusi pada penyeleksian sumber adalah yang bukan merupakan
jurnal ilmiah atau text book resmi atau sumber jurnal ilmiah yang tidak mencakup
informasi mengenai pemurnian protein target yang menggunakan sistem pemotongan
sendiri atau self cleavage intein.
Jumlah studi yang digunakan
Jumlah sumber jurnal ilmiah yang didapatkan sebanyak 11 jurnal yang membahas
mengenai pemurnian protein. Kemudian dari hasil skrining digunakan 6 sumber
jurnal primer yang membahas intein, self cleavage, protein murni.
Hasil dan Pembahasan

Penanda intein dapat memungkinkan terjadinya proses pemisahan secara

pemotongan diri sendiri (self-cleavage) dalam kolom kromatografi afinitas kitin.
Manfaat utama dari strategi pemurnian protein yang diinduksi oleh intein adalah
menghasilkan protein target dalam jumlah banyak, penggabungan protein target dapat
dilakukan di ujung C ataupun ujung N protein intein, dan protein target dapat
diisolasi dengan atau tanpa tambahan residu asam amino metionin. Penggunaan
pemurnian dimediasi intein dilaporkan dapat memurnikan protein hingga tingkat
kemurnian mencapai 95% (Li et al., 2012).
Aktivitas self cleavage intein diinduksi pH dan suhu

Pelepasan protein target dari protein penanda intein dilakukan dengan

penambahan buffer perubahan pH dan suhu pada N-terminal (Setrerrahmane et al.,
2014).

Pada penelitian Silaban et al.,2017 memurnikan fusi PT2 hasil ekspresi E. coli
BL21(DE3) ArcticExpress dalam kolom matriks kitin atau sistem pemurnian
IMPACT yang dimediasi intein. PT2 difusikan dengan suatu tag pada posisi N-
terminalnya, yang mengandung urutan pengode intein SspDnaB diikuti oleh domain
pengikat kitin (CBD). Selanjutnya fusi PT2 diekspresikan pada inang E. coli,
selanjutnya dimurnikan dalam kolom matriks kitin. Proses pemotongan PT2 dari
penanda intein diinduksi perubahan pH dan suhu dalam kolom.Fusi PT2 berhasil
dimurnikan dalam matriks kitin yang dimediasi intein. Pemotongan fusi PT2 dari
penanda intein terinduksi buffer pH 6,5 dan suhu inkubasi 25 oC selama 48 jam.

Gambar 1. Hasil menunjukkan bahwa telah diperoleh protein PT2 murni dalam
jumlah kecil. Hanya saja, PT2 belum terpisah sempurna.

Selain itu, pada penelitian Maksum et al., 2017 Upaya untuk memperoleh
pretrombin-2 murni dilakukan dengan sistem permurnian yang sama yaitu IMPACT.
Untuk melakukan pemurnian dengan sistem terebut, pretrombin-2 diekspresikan
dalam bentuk protein fusi CBD-intein-PT2pH. CBD merupakan penanda afinitas
yang memiliki kemampuan untuk terikat secara spesifik terhadap matriks kitin,
sedangkan intein merupakan protein yang memfasilitasi pemotongan pretrombin-2
dari penanda afinitasnya. Penggunaan sistem pemurnian ini tidak memerlukan
tambahan protease dalam pemotongan protein target dari CBD-Intein.

Serta dilakukan karakterisasi pretrombin-2pH hasil pemurnian dengan metode

SDS-PAGE. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kondisi inkubasi pemotongan
yang dibutuhkan untuk mendapatkan pretrombin-2pH murni adalah pada suhu 25oC,
selama 48 jam dengan perubahan pH lingkungan kolom dari 8,5 ke 7,0. Namun
efisiensi pemotongan yang dihasilkan sangat kecil. Hal ini mungkin disebabkan oleh
kondisi suhu dan waktu inkubasi yang belum optimum serta diduga masih terdapat
reaksi proteolisis yang mendegradasi pretrombin-2pH murni yang dihasilkan.

Pada penelitian Setrerrahmane et al., 2014 proses pemurnian fusi peptida

lunasin-Ssp DnaB intein tag dihasilkan ekspresi protein yang tinggi, mengindikasikan
fusi lunasin telah terlepas dari Ssp DnaB intein yang mengalami proses pemotongan
sendiri (self cleavage) di kolom afinitas diinduksi oleh pergeseran pH dan suhu untuk
menghasilkan suatu protein target lunasin sehingga dihasilkan kemurnian hingga
mencapai 75 mg/L media pada analisis lunasin murni dengan 16,5% (b / v) Tricine
SDS-PAGE.

Gambar 2. Jalur M = Marker, Jalur 1 = lunasin murni akhir.

Pemurnian protein yang dimediasi intein menggunakan penginduksi pH dan

suhu pada posisi C-terminal intein sangat sensitif terhadap pH buffer. Buffer dengan
kondisi pH yang tidak sesuai menyebabkan pemotongan protein dari fusi intein tidak
akan maksimal. (Setrerrahmane et al., 2014; Zhang et al., 2015).
Aktivitas self cleavage intein yang diinduksi pereaksi thiol

Pelepasan protein target dari protein penanda intein dilakukan dengan

penambahan pereaksi tiol seperti dithiothreitol (DTT), β-mercaptoetanol pada C-
terminal (Li et.al,2012).

Pada penelitian Li et al.,2012 pemurnian fusi protein target Ta1 – TP5 hasil
ekspresi E. Coli yang dilepaskan dari matriks kitin melalui pemotongan diri sendiri
atau self-cleaving intein (Intervening protEIN) yang diinduksi oleh pereaksi thiol
yaitu dithiothreitol intein. Ta1 – TP5 dimurnikan oleh Superdex 30 dan diidentifikasi
oleh Tricine-SDS-PAGE dan electrospray ionization mass spectrometry. Akhirnya,
sekitar 7,6 mg Ta1-TP5 dimurnikan dari fraksi yang larut dan badan inklusi diperoleh
dari 1 media kultur. Kemurnian adalah 95% yang secara keseluruhan menunjukkan
bahwa Ta1-TP5 dimurnikan dengan biaya rendah dan efisiensi tinggi, serta sangat
memperluas potensi penggunaannya sebagai pengatur sistem imun.

Gambar 3. Jalur 1: Ta1-TP5 yang dimurnikan dari fraksi yang larut sebelum
pemurnian Superdex 30; jalur 2: Ta1-TP5 yang dimurnikan dari fraksi yang larut
sesudahnyaPemurnian Superdex 30; jalur 3: Ta1 – TP5 yang dimurnikan dari badan
inklusi sebelum pemurnian Superdex 30; jalur 4: Ta1 – TP5 yang dimurnikan dari
badan inklusi setelah pemurnian Superdex 30; jalur 5: standar sintetis Ta1-TP5.

Daftar pustaka

Elleuche, S. and Poggeler, S. 2010. Inteins, Valuable Genetic Elements in Molecular

Biology and Biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology, 87, 479-
489. http://dx.doi.org/10.1007/s00253-010-2628-x.
Fong, B.A., Wu, W.Y. and Wood, D.W. 2010. The Potential Role of Self-Cleaving
Purification Tags in Commercial- Scale Processes. Trends in Biotechnology,
28, 272-279. http://dx.doi.org/10.1016/j.tibtech.2010.02.003.

Li, J., Zheng, L., Li, P., and Wang, F. 2012. Intein-mediated Expression, Purification,
and Characterization of Thymosin α1–Thymopentin Fusion Peptida in
Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 84:1-8.

Maksum, Iman., Budiantoro, Ogi., Hasan, Khomaini., Soemitro, Soetijoso dan

Subroto, Toto. 2017. Pemurnian Pretrombin-2pH Hasil Ko-Ekspresi Chaperone
pada Escherichia coli ER2566 Menggunakan Sistem IMPACT. Chimica et
Natura Acta. 5. 57. 10.24198/cna.v5.n2.14605.

Miraula, Manfredi., Enculescu, Charmaine., Schenk, Gerhard and Mitić, Natasa.

2015. Inteins—A Focus on the Biotechnological Applications of Splicing-
Promoting Proteins. American Journal of Molecular Biology. 05. 42-56.
10.4236/ajmb.2015.52005.

NEB. 2013. Protein Expression and Analysis. IMPACTTM kit instruction manual.
New England BioLabs, Inc.

Saraswat, M., Musante, L., Ravida, A., Shortt, B., Byrne, B. and Holthofer, H. 2013.
Preparative Purification of Recombinant Proteins: Current Status and Future
Trends. BioMed Research International, Article ID: 312709.
http://dx.doi.org/10.1155/2013/312709

Setrerrahmane, S., Zhang, Y., Dai, G., Lv, J and Tan, S. 2014. Efficient Production of
Native Lunasin with Correct N-terminal Processing by Using the pH-
InducedSelf-Cleavable Ssp DnaB Mini-intein System in Escherichia coli. Appl.
Biochem. Biotechnol, 174:612-622.

Silaban, S., Maksum, I.P., Enus, S., Hasan, K., Subroto, T., dan Soemitro, S. 2017.
Pemurnian Pretrombin-2 Manusia Rekombinan di Escherichia coli untuk
 Produksi Trombin sebagai Komponen Lem Fibrin. Jurnal Pendidikan Kimia.
Vol. 9, No. 1, 265-272 . 10.24114/jpkim.v9i1.6201.

Wood, D.W. 2014. New Trends and Affinity Tag Designs for Recombinant Protein
Purification. Current Opinion in Structural Biology, 26C, 54-61.
http://dx.doi.org/10.1016/j.sbi.2014.04.006

Zhang, Y., Zhang, K., Wan, Y., Zi, J., Wang, Y., & Wang, J. 2015. A pH-Induced,
Intein-Mediated Expression and Purification of Recombinant Human Epidermal
Growth Factor in Escherichia coli. Biotechnol, Prog