P2

LEMBAR PENGESAHAN

Laporan Praktikum Mikrobiologi Industri yang disusun oleh :

Kelompok : 3 Rabu
Anggota : Kevin Aprilio NIM. 21030117120054
Khoirul Huda NIM. 21030117120063
Tovin Alvaro NIM. 21030117140029
Tsania Qulsum NIM. 21030117120012

Telah diterima dan disetujui oleh Dita Baeti Pridiana selaku asisten Laboratorium
Mikrobiologi Industri pengampu materi Asam Sitrat pada :
Hari :…………………………….
Tanggal : ……………………………

Semarang, Juni 2019

Mengetahui
Asisten Pembimbing

Dita Baeti Pridiana

NIM 21030116120002

ii
 P2

RINGKASAN

Asam sitrat (2-dihidroxypane-1,2,3-tricarboxylic acid) merupakan senyawa

asam organik lemah yang ditemukan pada daun dan tumbuhan bergenus Citrus. Asam
sitrat apat diproduksi secara kimiawi, atau secara fermentasi menggunakan
mikroorganisme. Salah satu mikroorganisme yang digunakan dalam fermentasi asam
sitrat adalah Aspergillus niger. Tujuan percobaan adalah untuk membuat asam sitrat
dari buah alpukat dengan cara fermentasi, untuk mempelajari pengaruh perbedaan
penambahan MgSO4, KH2PO4, dan urea terhadap asam sitrat yang dihasilkan, dan
untuk mempelajari pengaruh waktu terhadap pH dan volume titran.
Asam sitrat merupakan senyawa intermediet dari asam organik yang berbentuk
kristal atau serbuk. Pemecahan karbohidrat dengan cara fermentasi dapat
menghasilkan berbagai macam senyawa organik diantaranya adalah asam sitrat.
Dengan enzim amylase, glukoamilase, atau amiloglukosidase, senyawa karbohidrat
akan dipecah menjadi glukosa, dan melalui jalur EMP glukosa akan diubah menjadi
asam piruvat. Asam piruvat melalui siklus krebs atau siklus TCA akan diubah menjadi
menjadi asam sitrat. Hal-hal yang mempengaruhi proses fermentasi sitrat adalah
waktu, mikroba, konsentrasi gula awal, pH, pemberian oksigen, dan suhu.
Langkah kerja praktikum untuk pembuatan asam sitrat adalah sterilisasi alat,
penyiapan media, dan analisa hasil. Alat-alat yang digunakan adalah petridish,
beaker glass, Erlenmeyer, gelas ukur, buret, statif, klem, pipet, incubator, dan oven.
Bahan-bahan yang digunakan adalah lemon, bekatul, sekam padi, urea, KH2PO4,
MgSO4.7H2O, Aspergillus niger, Ca(OH)2, H2SO4, NaOH, dan aquadest.

iii
 P2

PRAKATA

Puji dan syukur atas kehadirat Tuhan Yang Maha Esa berkat rahmat-Nya
sehingga dapat terselesaikan laporan praktikum bioproses ini dengan judul “Asam
Sitrat”. Praktikum Bioproses merupakan salah satu mata kuliah yang wajib diambil
oleh semua mahasiswa. Dalam penyusunan laporan praktikum bioproses diharapkan
mahasiswa mampu melaksanakan tahapan-tahapan praktikum dengan laporan yang
telah dibuat dan disetujui.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya
kepada:
1. Dr. Ing. Silviana, S.T., M.T. selaku Penanggungjawab Laboratorium Mikrobiologi
Industri.
2. Aprilina Purbasari, S.T., M.T. selaku dosen pengampu materi Asam Sitrat.
3. Diny Dwi Anugrainy selaku koordinator asisten Laboratorium Mikrobiologi
Industri,
4. Pratika Febrianti dan Dita Baeti Pridiana sebagai asisten pengampu materi Asam
Sitrat.
5. Asisten Laboratorium Mikrobiologi Industri.
6. Teman-teman yang telah membantu baik secara langsung maupun tidak langsung.
“Tak ada gading yang tak retak” begitulah perumpamaan untuk laporan ini.
Laporan ini masih jauh dari kata sempurna. Oleh karena itu, penulis mengharapkan
kritik dan saran yang membangun dalam penyempurnaan laporan ini ke depannya.

Semarang, Juni 2019

Penulis

iv
 P2

DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ................................................................................................... i
HALAMAN PENGESAHAN .................................................................................... ii
PRAKATA ................................................................................................................. iii
RINGKASAN ............................................................................................................ iv
DAFTAR ISI .............................................................................................................. vi
DAFTAR TABEL ................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................. ix
BAB I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang ............................................................................................. 1
1.2. Perumusan Masalah ..................................................................................... 1
1.3. Tujuan Praktikum ........................................................................................ 1
1.4. Manfaat Praktikum ...................................................................................... 2
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Asam Sitrat .................................................................................................. 3
2.2. Landasan Teori ............................................................................................ 3
2.3. Reaksi Pembentukan Asam Sitrat dan Pemurniannya ................................. 3
2.4. Hal-hal yang Berpengaruh ........................................................................... 4
BAB III. METODE PRAKTIKUM
3.1. Rancangan Praktikum .................................................................................. 8
3.2. Bahan dan Alat yang Digunakan ................................................................. 9
3.3. Gambar Rangkaian Alat .............................................................................. 9
3.4. Prosedur Praktikum ................................................................................... 10
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hubungan Waktu Fermentasi terhadap pH ............................................... 27
4.2. Hubungan Waktu Fermentasi terhadap Volume Titran ............................ 28
4.3. Kadar Optimum Penambahan MgSO4....................................................... 28
4.4. Kadar Optimum Penambahan KH2PO4 ..................................................... 29
4.5. Kadar Optimum Penambahan Urea ........................................................... 30
BAB V. PENUTUP
5.1. Kesimpulan ................................................................................................ 10
5.2. Saran .......................................................................................................... 10
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................... 21
LAMPIRAN .............................................................................................................. 22
Laporan Sementara 26
Lembar Perhitungan 27
Lembar Kuantitas Reagen 33

v
 P2

DAFTAR TABEL

Tabel 3.1 Variabel operasi ............................................................................... 23

Tabel 3.2 Gambar rangkaian alat ..................................................................... 23

vi
 P2

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Siklus EMP atau glikolisis (Wahyuni, 2011) 16

Gambar 2.2. Siklus asam sitrat (Sumber : Wahyuni, 2011) 17
Gambar 2.3. Aspergillus niger 18
Gambar 3.1 Skema sterilisasi alat dan penyiapan media 22
Gambar 3.2 Skema analisa hasil 22
Gambar 4.2. Hubungan waktu fermentasi terhadap pH 27
Gambar 4.2. Hubungan waktu fermentasi terhadap volume titran 28

vii
 P2

BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Asam sitrat merupakan salah satu produk komersial yang penting di dunia
maupun di Indonesia. Di Indonesia, 65% konsumsi asam sitrat berada di industri
makanan dan minuman, 20% berada di industri deterjen rumah tangga dan
sisanya berada di industri tekstil, farmasi, kosmetik dan lainnya. Besarnya
pemanfaatan asam sitrat pada industri makanan dan minuman karena sifat asam
sitrat menguntungkan dalam pencampuran, yaitu kelarutan relatif tinggi, tak
beracun dan menghasilkan rasa asam yang disukai. Kegunaan lain, yaitu sebagai
pengawet, pencegah kerusakan warna dan aroma, menjaga turbiditas,
penghambat oksidasi, penginvert sukrosa, penghasil warna gelap pada kembang
gula, jam dan jelly, pengatur pH.
Asam sitrat dapat diproduksi melalui ekstraksi sederhana, proses
fermentasi menggunakan mikroorganisme, dan proses sintesa secara kimia.
Proses ekstraksi sederhana telah lama ditinggalkan seiring dengan
pengembangan metode fermentasi. Sedangkan sintesa secara kimia belum bisa
sepenuhnya diterima konsumen karena faktor keamanan pangan produk yang
dihasilkan. Produksi asam sitrat melalui proses fermentasi menggunakan
mikroba dinilai prospektif untuk diterapkan di industri.
Asam sitrat dapat diproduksi dengan memanfaatkan aktivitas
mikroorganisme melalui proses fermentasi, salah satunya adalah Aspergillus
niger. Aspergillus niger merupakan mikroorganisme utama yang digunakan di
industri untuk produksi asam sitrat karena menghasilkan lebih banyak asam
sitrat per satuan waktu dan juga kemampuannya untuk memproduksi asam sitrat
dari bahan yang murah. Secara teori, produksi asam sitrat menggunakan
Aspergillus niger dapat menghasilkan rendemen 70% (Sasmitaloka, 2017).
Umbi singkong merupakan sumber energi yang kaya karbohidrat.
Kandungan karbohidrat pada singkong adalah 34,70 gram per 100 gram
singkong (Septiriyani, 2017). Hal ini membuat singkong dapat dimanfaatkan
untuk bahan baku pembuatan bahan kimia. Salah satu pemanfaatan singkong
adalah pembuatan asam sitrat dengan cara fermentasi.
1.2. Rumusan Masalah
Melihat banyaknya kegunaan dari asam sitrat, maka perlu dilakukan
penelitian untuk menghasilkan asam sitrat tersebut. Pada penelitian sebelumnya
Wahyuni (2011), melakukan penelitian pembuatan asam sitrat dari limbah
13
 P2

ampas sagu. Penelitian ini dilakukan untuk menghasilkan asam sitrat secara
fermentasi dengan menggunakan Aspergillus niger dari sumber karbon medium
produksi yaitu limbah ampas sagu dengan berbagai variasi konsentrasi dan untuk
mengkaji pengaruh tambahan sumber karbon terhadap bobot asam sitrat yang
diperoleh. Dari hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa limbah ampas sagu
dapat menggantikan gula sebagai sumber karbon, dan semakin banyak
penambahan sumber karbon maka semakin banyak pula asam sitrat yang
dihasilkan. Madona dan Dias (2009), melakukan penelitian pembuatan asam
sitrat dengan cara fermentasi dari ampas ubi jalar pada media semi padat dengan
mikroorganisme yang digunakan adalah Aspergillus niger dengan variabel
konsentrasi nutrient yang berbeda-beda. Hasil variabel penambahan sekam
menyimpulkan semakin banyak penambahan sekam maka hasil asam sitrat yang
dihasilkan semakin banyak. Poesponegoro dkk. (1991), melakukan penelitian
pembuatan asam sitrat dari tetes tebu dengan cara fermentasi biak-rendam
dengan Aspergillus niger. Dan didapatkan bahwa Aspergillus merupakan galur
terbaik untuk produksi asam sitrat secara fermentasi biak-rendarn. Konsentrasi
awal gula-pereduksi total (15-20%) dan pH medium yang rendah (kurang dari
3.0) adalah optimum untuk akumulasi asam sitrat oleh Aspergillus niger.
Dilakukan juga penelitian pembuatan asam sitrat dari limbah kulit pisang
dengan proses fermentasi media cair dengan Aspergillus niger oleh Hambali
dkk. (2016) yang menunjukkan bahwa konddisi optimum yang tepat dalam
menghasilkan kadar asam sitrat yang tertinggi yaitu diperoleh pada waktu
fermentasi 3 hari dengan kemurnian asam sitrat 67,25 %, volume starter 14 ml,
dan memiliki pH 2. Sedangkan kadar asam sitrat terendah diperoleh pada waktu
fermentasi 7 hari dengan kemurnian asam sitrat 30,95 %, volume starter 14 ml,
dan memiliki pH 3. Puspadewi dkk. (2017) juga melakukan penelitian
pembuatan asam sitrat dengan menggunakan kulit singkong dengan fermentasi
substrat cair dan jamur yang digunakan adalah Aspergillus wentii. Aspergillus
wentii juga mampu menghasikan asam sitrat melalui proses fermentasi. Asam
sitrat yang terbentuk paling banyak adalah pada fermentasi hari ke-6.
Untuk mencapai produktivitas tinggi dan menguntungkan secara ekonomi,
pada percobaan ini dilakukan pembuatan asam sitrat dengan menggunakan
bahan baku lemo dengan fermentasi semi padat. Dengan variabel penambahan
nutrisi yaitu sekam padi, bekatul, urea, MgSO4, dan KH2PO4 diharapkan dapat
meningkatkan metabolisme sel dan mempercepat produksi asam sitrat dan
menggunakan mikroorganisme yaitu Aspergillus niger.

14
 P2

1.3. Tujuan Percobaan

1. Untuk membuat asam sitrat dari buah kiwi dengan cara fermentasi
2. Untuk mempelajari pengaruh perbedaan KH2PO4 dan urea terhadap asam
sitrat yang dihasilkan.
3. Untuk mempelajari pengaruh waktu terhadap pH.
4. Untuk mempelajari pengaruh waktu terhadap volume titran
1.4. Manfaat Percobaan
1.4.1. Industri
1. Industri asam sitrat dapat meningkatkan produktivitas asam sitrat
dengan menambah sumber bahan baku lain berupa lemon.
2. Bahan baku lemon mudah diperoleh keberadaannya.
1.4.2. Pendidikan
1. Mahasiswa dapat mempelajari pemilihan media fermentasi yang tepat
berdasarkan bahan baku yang digunakan baik itu fermentasi padat,
fermentasi cair, dan fermentasi semi padat.
2. Mahasiswa dapat melakukan penelitian lainnya dalam produksi asam
sitrat menggunakan bahan baku yang mengandung glukosa.
1.4.3. Pemerintah
1. Pemerintah dapat membentuk UKM (Usaha Kecil Menengah) untuk
mengolah salah satu limbah kegiatan industri pertanian yaitu tongkol
jagung menjadi asam sitrat dengan proses fermentasi.
2. Pemerintah dapat menaikkan pendapatan daerah karena naiknya nilai
ekonomi limbah tongkol jagung yang diolah menjadi asam sitrat.
1.4.4. Lingkungan
1. Pembuatan asam sitrat dengan cara fermentasi lebih ramah lingkungan.
2. Menggunakan bahan lemon yang mudah didapatkan untuk membuat
asam sitrat

15
 P2

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pengertian Asam Sitrat

Asam sitrat merupakan senyawa intermediet dari asam organik yang
berbentuk kristal atau serbuk. Pemecahan karbohidrat dengan cara fermentasi
dapat menghasilkan berbagai macam senyawa organik diantaranya adalah asam
sitrat. Dengan enzim amylase, glukoamilase, atau amiloglukosidase, senyawa
karbohidrat akan dipecah menjadi glukosa, dan melalui jalur EMP glukosa akan
diubah menjadi asam piruvat. Enzim amilase merupakan enzim pemecah pati,
glikogen dan polisakarida lain dengan cara menghidrolisis ikatan glikosidik α-
1,4 atau ikatan glikosidik α-1,6. Enzim glukoamilase atau amiloglukosidase (a-
1,4 glukan glukohidrolase EC 3.2.1.1) adalah eksoamilase yang menghidrolisa
ikatan α-1,4 secara berurutan dari ujung nonreduksi rantai amilosa, amilopektin
dan glikogen dengan melepaskan glukosa. Enzim ini juga menghidrolisa ikatan
α-1,6 dan α-1-3, kecepatannya bekerja dengan ikatan α-1,4 jauh lebih tinggi
(Naiola, 2006). Asam piruvat melalui siklus krebs atau siklus TCA akan diubah
menjadi menjadi asam sitrat. Kapang (mold) Aspergillus niger adalah kapang
yang dapat menghasilkan enzim yang dapat mengubah karbohidrat menjadi
asam sitrat. Penggunaan asam sitrat untuk industri misalnya makanan, minuman,
dan farmasi (Sasmitaloka, 2017).
Pembentukan asam sitrat melalui proses fermentasi dari bahan-bahan yang
mengandung gula didasarkan pada teori bahwa asam piruvat yang terbentuk dari
glukosa dapat mengalami dekarboksilasi menjadi asetil koenzim-A yang
selanjutnya terjadi kondensasi dengan asam oksaloasetat menghasilkan asam
sitrat dengan bantuan enzim sitrat sintesa seperti reaksi berikut :

Gambar 2.1. Siklus EMP atau glikolisis (Wahyuni, 2011)

16
 P2

Meyerhoff-Parnas (EMP) atau glikolisis dan lintas Etner-Doundroff yang

menyediakan senyawa antara asam piruvat sebagai senyawa kunci dalam
metabolisme sel. Delapan puluh persen glukosa diubah menjadi piruvat melalui
lintas glikolisis. Asam piruvat yang merupakan produk akhir lintas EMP atau
dioksidasi lebih lanjut dan kemudian dengan bantuan enzim dekarboksilase
membentuk asetat (dekarboksilasi). Asetat yang terbentuk berikatan dengan
koenzim-A menghasilkan asetil CoA. Selanjutnya asetil CoA dan oksaloasetat
yang merupakan salah satu senyawa “intermediet” dalam siklus asam sitrat
(TCA) berkondensasi membentuk asam sitrat dengan bantuan enzim
pengoksidasi sitrat sintase. Tahapan reaksi asam sitrat sebagai berikut :
Asetil KoA + oksaloasetat + H2O  sitrat + KoA-SH.
Reaksi total:
Asetil KoA + 3NAD+ + FAD + ADP (atau GDP) + Pi + H2O  2CO2 + KoA-
SH + 3NADH + 3H+ + FADH2 + ATP ( atau GTP).
(Wahyuni, 2011)

Gambar 2.2. Siklus asam sitrat (Sumber: Wahyuni, 2011)

2.2. Landasan Teori Aspergillus niger
Kondisi spora licin, tidak berwarna atau kuning kecoklatan, lemak atau
merupakan campuran tiga warna atau lebih, konidia berkepala hitam coklat/ungu
coklat besar dan berbentuk bola. Dalam kepala yang besar terdapat bubuk bola
yang mengembang. Serbuk pada seluruh permukaan kepalanya kering, menyusut
menyerupai kubah dari konidia spora pendek. Konidia spora terlihat bertangan
besar dan berwarna coklat hitam (Wangge dkk., 2012).
Aspergillus niger mempunyai banyak manfaat, seperti memiliki
kemampuan untuk memproduksi asam sitrat. Aspergillus niger merupakan jamur
yang dapat menghasilkan protease. Protease dari cendawan Aspergillus niger
memiliki lebih banyak keuntungan daripada protease bakteri dalam pemisahan

17
 P2

enzim karena miselium dapat dihapus hanya dengan filtrasi. Protease yang
dihasilkan oleh A. niger lebih baik karena menghasilkan protease yang lebih
tinggi, waktu produksinya lebih singkat dan biayanya relatif murah
(Indratiningsih et al., 2013 dalam Irma 2015). Aspergillus niger bersifat toleran
terhadap aktivitas air rendah, mampu tumbuh pada substrat dengan potensial
osmotik cukup tinggi dan sporulasi pada kelembaban relatif rendah (Rahman,
1989 dalam Irma, 2015).

Gambar 2.3. Aspergillus niger (Irma, 2015)

Menurut Oktariani (2017), pertumbuhan Aspergillus niger dan
pertumbuhan produk dipengaruhi oleh beberapa faktor:
1. Temperatur berpengaruh langsung pada kecepatan pertumbuhann
mikroorganisme, kecepatan sintesa enzim dan kecepatan. Jamur pada
umumnya tidak tahan terhadap temperatur tinggi, temperatur terlalu tinggi
dapat mengakibatkan proses pengeringan protein yang menyebabkan
kematian sel, sedangkan temperatur yang terlalu rendah akan mengurangi
aktifitas enzim hingga pertumbuhan mikroorganisme terganggu.
Aspergillus niger tumbuh optimum pada suhu 35-37°C, dengan suhu
minimum 6-8°C dan suhu maksimum 45-47°C.
2. Nilai pH media adalah salah satu faktor yang penting untuk pertumbuhan
mikroorganisme dan pembentukan produk fermentasi. Jamur umumnya
lebih toleran terhadap suasana asam sampai netral yaitu pada pH sekitar 3
sampai 7. Aspergillus niger mempunyai kisaran pH untuk tumbuh cukup
luas yaitu 2,8 – 8,8.
3. Zat makanan (nutrien), karbon adalah sumber nutrien utama yang
diperlukan dalam pertumbuhan jamur. Aspergillus niger akan tumbuh
dengan baik jika menggunakan glukosa, fruktosa, maltosa, sukrosa, xylosa
dan manosa sebagai sumber karbonnya. Nutrien lain yang cukup
memegang peranan penting adalah unsur nitrogen. Selama fase
pertumbuhan, jamur menggunakan nitrogen dengan cepat dan pada
periode ini enzim mulai terdapat di dalam media
18
 P2

2.3. Reaksi Pembentukan Asam Sitrat dan Pemurniannya

a. Reaksi Pembentukan
(C6H10O5)n(s) + n(H2O)(l) → (C12H22O11)(s)
Karbohidrat Sukrosa
(C12H22O11)(s)+ (H2O)(l) →(C6H12O6)(s)+ (C6H12O5)(s)
Sukrosa Air Glukosa Fruktosa
(C6H12O6)(s)+ O2(g) → (C6H8O7)(s)+ 2 (H2O)(l)
Glukosa Asam Sitrat Air
Reaksi pertama adalah hidrolisis karbohidrat menjadi sukrosa dengan
bantuan enzim amiloglukosidase. Enzim glukoamilase bersifat eksoamilase,
yaitu dapat memotong ikatan α-1,4 pada pati. Disamping itu
amiloglukosidase (glukoamilase) juga dapat memotong ikatan α-1,6,
sehingga molekul-molekul karbohidrat dapat dikonversikan menjadi
molekul-molekul glukosa bebas (Risnoyatiningsih, 2011).
Kemudian pada reaksi kedua molekul sukrosa yang terdiri dari molekul
glukosa dan fruktosa yang saling berikatan. Proses terjadinya reaksi invertase
berawal dari terikatnya molekul sukrosa pada enzim invertase yang kemudian
mengalami hidrolisis dengan penambahan H2O. Reaksi hidrolisis ini
mengakibatkan sukrosa dan enzim menjadi tercekam sehingga ikatan antara
fruktosa dan glukosa menjadi terpecah menghasilkan satu molekul glukosa
dan satu molekul fruktosa yang tidak berikatan dan terlepas dari enzim.
Hidrolisis sukrosa menghasilkan campuran glukosa dan fruktosa yang disebut
dengan gula invert (invert sugar) (Ningsih, 2013).
Reaksi ketiga adalah glukosa dipecah melalui reaksi-reaksi dalam
lintasan Embden Meyerhof Parnas (EMP). Asam piruvat yang merupakan
produk akhir dari lintasan EMP akan dioksidasi lebih lanjut dan kemudian
dengan bantuan enzim dekarboksilase membentuk asetat (dekarboksilasi).
Asetat yang terbentuk berikatan dengan koenzim-A menghasilkan Asetil–
CoA. Selanjutnya Asetil–CoA dan oksaloasetat yang merupakan salah satu
senyawa antara siklus TCA berkondensasi membentuk asam sitrat (Haryani,
2011). Pada percobaan ini reaksi pembentukan asam sitrat terjadi pada proses
fermentasi selama 7 hari.
b. Reaksi Pemurnian
(C6H8O7)(s)+ 3(Ca(OH)2)(l) → (Ca3(C6H5O7)2)(s)+ 6(H2O)(l)
Ca. Sitrat

19
 P2

(Ca3(C6H5O7)2)(s) + 3(H2SO4)(l) → 3(CaSO4)(s)+ 2 (C6H8O7)(s)

Ca. Sitrat As. Sitrat Ca. Sulfat As. Sitrat

(C6H8O7)(s)+ 3(NaOH)(l) → (Na3(C6H8O7))(s)+ 3 (H2O)(l)

Na. Sitrat
(Syamsuriputra dkk., 2006).
Asam sitrat direaksikan dengan kalsium hidroksida membentuk
kalsium sitrat. Penambahan kalsium hidroksida dilakukan untuk memisahkan
asam sitrat dengan asam oksalat dengan prinsip presipitasi yang
memanfaatkan sifat kelarutan garamnya, dimana asam oksalat akan tidak
larut sedangkan asam sitrat tidak larut (Padmudji, 2009).
Setelah itu kalsium sitrat direaksikan dengan asam sulfat. Penambahan
asam sulfat berfungsi untuk meregenerasi asam sitrat yang yang terisolasi
dalam kalsium sitrat (Noto, 2010). Penambahan natrium hidroksida berfungsi
untuk membuat suasana menjadi basa (Setiono, 1985 dalam Puspadewi dkk.,
2017). Filtrat akhir yang didapat adalah asam sitrat yang akan digunakan
untuk pengujian kuantitatif asam sitrat
2.4. Hal-Hal yang Berpengaruh
a) Waktu
Tujuh hari adalah optimum, bila kurang dari 7 hari, bahan baku belum
terfermentasi semua. Bila lebih mungkin asam sitrat berubah menjadi asam
oksalat (Widyanti, 2010).
b) Mikroba
Pada percobaan ini digunakan jamur Aspergillus niger. Keuntungan
dari penggunaan jamur ini adalah penanganannya mudah, dapat digunakan
bahan baku yang murah, yield tinggi dan konsisten, serta ekonomis (Marison,
1988).
c) Konsentrasi gula awal
Konsentrasi gula awal menentukan yield asam sitrat dan asam organik
lain. Untuk Aspergillus niger adalah 15-18%, jika lebih dari 18% tidak
ekonomis dan jika kurang dari 15% terbentuk asam oksalat (Marison, 1988).

20
 P2

d) pH
Pengaturan pH sangat penting dalam fermentasi. Ini disebabkan pada
pH tertentu, strerilisasi mudah dilakukan. Sterilisasi mulamula dilakukan
pada pH 2,2 atau lebih rendah. Sebagai pengatur digunakan asam asetat.
Sedang pH yang baik 3,4 - 4,5. Pada pH tinggi dihasilkan asam oksalat. Untuk
kondisi tertentu (misal percobaan) kadang akan menghasilkan enzim yang
hanya berfungsi mengubah karbohidrat menjadi asam sitrat. Untuk kondisi
lain akan dihasilkan enzim yang lain pula (Papagianni et al, 1999).
e) Pemberian Oksigen
Pemberian oksigen yang terlalu banyak menimbulkan efek merugikan
bagi hasil asam sitrat. Sebaliknya, bila pemberian oksigen terlalu sedikit akan
kurang menguntungkan (Widyanti,2010).
f) Suhu
Suhu yang baik adalah 28–30℃. Jika lebih dari 30℃, keasaman naik
dan akibatnya ada asam oksalat (Adham, 2001).

21
 P2

BAB III
METODE PRAKTIKUM

3.1. Rancangan Praktikum

3.1.1. Skema Rancangan Praktikum
1. Sterilisasi Alat dan Penyiapan Media

Sterilisasi Alat

Menyiapkan bahan

Tambahkan nutrient dan atur pH-nya

Tutup dengan alumunium foil dan panaskan hingga 70oC

Dinginkan lalu tanami suspensi spora

Inkubasi selama hari pada suhu 28-30oC

Disaring dan dites filtratnya

Gambar 3.1. Skema sterilisasi alat dan penyiapan media

2. Analisa Hasil

Panaskan filtrat dan tambahkan larutan Ca(OH)2 Alat

Saring endapan dan cuci dengan air panas

Larutkan dengan H2SO4 dan saring dengan kertas saring

Tutup dengan alumunium foil dan panaskan hingga 70oC

Encerkan filtrat dan titrasi dengan NaOH

Gambar 3.2. Skema analisa hasil

3.2. Alat dan Bahan
3.2.1. Alat
1. Petridish

22
 P2

2. Beaker glass
3. Erlenmeyer
4. Gelas ukur
5. Buret, statif, klem
6. Pipet
7. Inkubator
8. Oven
3.2.2. Bahan
1. Lemon
2. Bekatul
3. Sekam padi
4. Urea
5. KH2PO4
6. MgSO4.7H2O
7. Aspergillus niger
8. Ca(OH)2
9. H2SO4
10. NaOH
11. Aquadest
3.2.3. Variabel Operasi
Tabel 3.1. Variabel Operasi
Variabel MgSO4 KH2PO4 Urea Sekam Bekatul pH Hari
1 0,2 gr 0,7 gr 0,8 gr 2 gr 2 gr 3 7
2 0,1 gr 0,7 gr 0,8 gr 2 gr 2 gr 3 7
3 0,1 gr 0,7 gr 0,7 gr 2 gr 2 gr 3 7

3.3. Gambar Rangkaian Alat

Tabel 3.2. Gambar Rangkain Alat
No Nama Alat Gambar Alat
1 Petridish

23
 P2

2 Beaker glass

3 Erlenmeyer

4 Gelas ukur

5 Buret, statif, klem

6 Pipet

7 Inkubator

24
 P2

8 Oven

3.4. Cara Kerja

1.Sterilisasi Alat
a. Cuci erlenmeyer sampai bersih dan keringkan
b. Sterilisasi alat dengan alkohol semprot lalu keringkan.
2. Penyiapan Media
Media cair :
a. Siapkan lemon yang akan digunakan, timbang buah kiwi sesuai variabel
lalu tambahkan nutrient – nutrient dan aqudest hingga volume menjadi 100
mL dalam erlenmeyer lalu atur pH
b.Tutup menggunakan alumunium foil dan panaskan hingga mencapai suhu
70℃. Biarkan dingin pada suhu kamar.
c. Setelah dingin, tanami dengan suspensi Aspergillus niger secara aseptik di
ruang aseptik.
d. Cara penanaman suspensi spora
 Menyiapkan kawat osse, bunsen, alkohol, dan HCl
 Semprot ruang aseptik dengan menggunakan alkohol dan diamkan
selama ± 1 menit. Lalu bisa dilakukan penanaman suspensi spora.
 Penanaman suspensi spora dilakukan dengan cara mensterilkan kawat
osse: Panaskan kawat osse menggunakan bunsen, kemudian
memasukkan ke larutan HCl, kemudian panaskan kawat osse lagi.
 Ambil beberapa kawat osse Aspergillus niger dari biakan murni yang
telah disediakan dan masukkan ke dalam sampel yang sudah di
autoclave, lalu siap di inkubasikan.
e. Inkubasikan selama 7 hari sesuai variabel pada 28 - 30oC (dalam inkubator
goyang).
f. Setelah selesai inkubasi, saring dengan kertas saring atau pompa vakum
dan filtratnya ditest untuk asam sitratnya.
3. Analisa Hasil
a. Panaskan filtrat yang diperoleh dari percobaan diatas sampai 700C.
Tambahkan larutan Ca(OH)2 sebanyak 10 ml. buat larutan Ca(OH)2
dengan melarutkan 5 gram Ca(OH)2 dengan aquadest sampai 50 ml (juga
25
 P2

temperatur konstan)
b. Endapan yang timbul cepat-cepat disaring (dalam keadaan panas 700C),
kemudian dicuci dengan air panas 700C. Endapan tersebut adalah kalsium
sitrat.
c. Keringkan endapan di oven kemudian timbang dan catat beratnya.
d. Endapan tersebut dilarutkan dengan H2SO4 encer, sesuai perhitungan,
saring dengan kertas saring. Filtratnya merupakan asam sitrat dan
endapannya adalah kalsium sulfat.
e. Untuk mengetahui berat asam sitrat yang diperoleh pada percobaan,
encerkan 1 ml filtrat menjadi 10 ml dengan aquadest, lalu titrasi dengan
NaOH 0,1 N dan catat kebutuhan titran.
4. Menghitung kebutuhan H2SO4 encer
Ca3(C6H5O7)2(s) + 3H2SO4(l) →3CaSO4(s) +2C6H8O7(s)
xgr
 Amol 3A mol
BMCaSitrat
Buat larutan H2SO4 dengan melarutkan 5 mL H2SO4 pekat menjadi 100
mL
H2SO4 = vol H2SO4.ρH2SO4 .kadar H2SO4
= 5 ml. 1,84 gr/ml3.98/100
= 9,016 gr gr
MolarH2SO4 = mol/V  BM
V
9.016 gr
 98
0,1L
 0,92 M
Molar H2SO4 = mol/V
3 Amol
0,92 M =
V

26
 P2

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hubungan Waktu Fermentasi terhadap pH

3.5
3
2.5
2
pH

1.5 Variabel 1
1 Variabel 2
Variabel 3
0.5 Variabel 4
0
0 1 2 3 4 5 6
Waktu Feremntasi (hari)
Gambar 4.1. Hubungan waktu fermentasi terhadap pH
Berdasarkan grafik 4.1, dapat diketahui bahwa pada hari pertama sampai
dengan ketiga semua variabel tetap pada pH sama yaitu 3. Kemudian pada hari
keempat pada semua variabel mengalami penurunan pH menjadi 2. Pada hari
kelima pH pada semua variabel tidak mengalami perubahan.
Pada pembuatan asam sitrat pH berpengaruh dalam proses fermentasi. pH
pada pembuatan asam sitrat berada pada kondisi konstan pada pertama sampai
har ketiga kemudian mengalami penurunan pH yang menandakan tejadinya
pembentukan asam sitrat. pH berada dalam kondisi konstan disebabkan oleh
mikroorganisme sedang berada pada fase adaptasi. Fase adaptasi yang berjalan
lambat dapat dipengaruhi oleh medium, lingkungan, dan jumlah inokulum. Fase
adaptasi dapat berjalan lebih lambat karena mutan yang baru dipindahkan dari
fase statis ke medium baru dengan komposisi sama seperti sebelumnya
(Hamdiyati, 2014 dalam Aris, 2014). pH pada media juga mempengaruhi
produksi asam sitrat dari Aspergillus niger karena beberapa enzim yang berperan
dalam siklus TCA sensitif terhadap pH. Produksi asam sitrat akan optimal
dengan pH sekitar 2. Jika kondisi tersebut tidak diperoleh hasil produksi akan
berkurang (Mattey, 1992 dalam Sasmitaloka, 2017)
Praktikum yang dilakukan sesuai dengan teori yang mengatakan bahwa
pH akan mengalami penurunan. Hal ini mengindikasikan bahwa terbentuknyua
asam sitrat dalam proses fermentasi tersebut. pH berpengaruh terhadap
memproduksi asam sitrat dari Aspergillus niger. pH yang optimal dalam
pembentukan asam sitrat berkisar 2.

27
 P2

4.2. Hubungan Waktu Fermentasi terhadap Volume Titran

3
2.5

Volume Titran (ml)

2
1.5 Variabel 1
Variabel 2
1 Variabel 3
0.5 Variabel 4

0
0 1 2 3 4 5 6
Waktu Fermentasi (hari)

Gambar 4.2. Hubungan waktu fermentasi terhadap volume titran

Berdasarkan grafik 4.2, dapat disimpulkan bahwa variabel 1, 2, 3, dan 4
mengalami kenaikan volume titran setiap harinya. Variabel 1 mengalami
kenaikan dari 1,9 sampai dengan 2,8. Variabel 2 mengalami kenaikan dari 1,8
sampai dengan 2,6. Variabel ketiga mengalami kenaikan dari 1,7 sampai dengan
2,5. Variabel 4 mengalami kenaikan dari 1,2 menjadi 2,2.
Sesuai dengan yang telah disampaikan Mattey, 1992 dalam Sasmitaloka
(2017) menyatakan bahwa penurunan pH setiap hari mengindikasikan
terbentuknya asam sitrat. Asam sitrat yang terbentuk mengakibatkan
meningkatnya konsentrasi [H3O]+ dalam sebuah larutan, sehingga untuk
mendapatkan konsentrasi ekuivalen dengan [OH-] dibutuhkan titran basa dengan
jumlah yang lebih banyak.
Berdasatkan teori yang menyebutkan bahwa asam sitrat tiap harinya akan
bertambah memebuat volume titran bertambah. Hal ini disebabkan karena
dengan meningkatnya asam sitrat maka konsentrasi [H3O]+ dalam sebuah
larutan, sehingga untuk mendapatkan konsentrasi ekuivalen dengan [OH-]
dibutuhkan titran basa dengan jumlah yang lebih banyak

4.3. Kadar Optimum Penambahan MgSO4

Pada fermentasi asam sitrat, digunakan Aspergillus niger sebagai
pembentuk enzim selulase. Pada proses penggunaan Aspergillus niger,
dibutuhkan beberapa nutrien dalam pemebentukan enzim selulase diantaranya
MgSO4. Menurut Vendenberghe (2014), MgSO4 merupakan elemen dalam
kuantitas kecil yang berpengaruh dalam pembentukan produk asam sitrat dalam
fermentasi asam sitrat. Menurut Kapoor (1983) dalam jurnal Vendenberghe
(2014), MgSO4 merupakan sumber magnesium untuk pertumbuhan bakteri
maupun produksi asam sitrat, konsentrasi magnesium sulfat yang optimal berada
28
 P2

di rentang 2 gram sampai 5 gram per 10 ml sumber karbohidrat. Sekitar 4 sampai

10 gr per 20 ml.
Banyaknya MgSO4 yang digunakan dalam proses fermentasi asam sitrat
berturut-turut sesuai dengan variabel 1 dan 2 adalah 0,1 gram dan 0,25 gram
yang digunakan dalam media cair dengan 20 ml sumber karbohidrat. Sehingga
pada kedua variabel tersebut tidak ada yang melampaui batas optimum yang
dibutuhkan.
Berdasarkan teori yang telah dijelaskan, disimpulkan bahwa kedua
variabel tidak melebihi batas optimum yang dibutuhkan, dan untuk variabel 2
membutuhkan volume NaOH yang lebih tinggi dari pada variabel 1 dikarenakan
kandungan MgSO4 dalam sampel yang lebih banyak.

4.4. Kadar Optimum Penambahan KH2PO4

Di dalam proses fermentasi asam sitrat menggunanakan Aspergilus niger,
KH2PO4 digunakan sebagai sumber nutrisi fosfor/fosfat bagi Aspergillus niger.
Fosfat yang dapat diasimilasi juga merupakan salah satu hal penting untuk
pertumbuhan dan metabolisme mikroba. KH2PO4 berpartisipasi dalam
pembentukan dinding sel, dan juga banyak senyawa antara, dan koenzim,
penting untuk metabolisme dan proses intraseluler lainnya. Fosfat juga penting
sebagai penyangga, membantu mengatur konsentrasi ion hidrogen protoplasma
dan cairan sekitarnya. Parameter fermentasi kimia yang paling penting
mempengaruhi pertumbuhan Aspergillus niger pada substrat cair dan produksi
asam sitrat adalah: nutrisi, komposisi substrat, nitrogen, fosfor, kalium dan
garam lainnya (Gopinadh dkk., 2015). Dalam jurnal Vendenberghe dkk. (2014),
Shu dan Johnson (1948) mengatakan bahwa konsentrasi optimum fosfor yang
dibutuhkan oleh jamur Aspergillus niger dalam sebuah media cair untuk
memproduksi hasil fermentasi asam sitrat yang maksimal 0,5 g/L hingga 5,0 g/L
atau 0,1 g hingga 1 g per 20 mL.
Banyaknya KH2PO4 yang digunakan dalam proses fermentasi asam sitrat
berturut-turut sesuai dengan variabel 1 dan 3 adalah 0,5 gram dan 0,75 gram
yang digunakan dalam media cair dengan 20 ml sumber karbohidrat.
Berdasarkan teori yang telah dijelaskan, disimpulkan bahwa kedua
variabel tidak melebihi batas optimum yang dibutuhkan, dan untuk variabel 1
membutuhkan volume NaOH yang lebih tinggi dari pada variabel 3 dikarenakan
kandungan KH2PO4 dalam sampel yang lebih banyak

29
 P2

4.5. Kadar Optimum Penambahan Urea

Kebutuhan urea pada variabel 1 yaitu sebesar 1 gram sementara pada
variabel 4 sebesar 1,5 gram. Kadar optimum penambahan urea yaitu sebesar 0,3
g/L atau 0,06 gr per 20 mL (Fuadi dkk., 2015). Menurut teori semakin banyak
nutrisi nitrogen maka laju pertumbuhan mikroba meningkat dan mengakibatkan
jumlah pertumbuhan mikroba meningkat dan mengakibatkan jumlah gula
terkonversi menjadi asam sitrat semakin bertambah (Madonna dan Dias, 2006).
Pada hasil yang telah diperoleh sesuai dengan teori yang ada. Jika pemberian
nitrogen pada variabel terlalu berlebihan maka mengakibatkan metabolisme
jamur terpusatkan pada pembentukan sel daripada pembentukan asam sitrat. Dan
sebaliknya, jika pemberian nitrogen terlalu sedikit atau kurang dari kadar
optimum, Aspergillus niger mengalami kekurangan nutrisi yang digunakan
untuk pertumbuhannya dan untuk memproduksi asam sitrat (Syamsuriputra
dkk., 2006). Fungsi dari penambahan urea selain sebagai nutrisi nitrogen yang
diperlukan dalam proses fermentasi karena dapat mempengaruhi aktivitas dari
Aspergillus niger. Pada proses fermentasi untuk menghasilkan enzim selulase
sumber nitrogen yang optimal adalah urea. Selain itu penambahan nutrien
nitrogen dari senyawa urea juga dapat menurunkan pH media fermentasi
(Onikayanti, 2015).
Ditinjau dari volume titran maka pada variabel 1 dan 4 melebihi kadar
optimum urea sehingga variabel yang memiliki kadar asam sitrat yang tinggi
adalah variabel 1 karena mendekati dengan kadar optimum urea karena
mendekati kadar optimum.

30
 P2

BAB V
PENUTUP

5.1. Kesimpulan
1. Fenomena waktu fermentasi terhadap pH berbanding terbalik seiring
berjalannya waktu, dikarenakan terbentuknya asam sitrat selama proses
fermentasi.
2. Fenomena waktu terhadap volume titran yang dibutuhkan berbanding lurus
seiring dengan berjalannya waktu, dikarenakan terbentuknya asam sitrat yang
dapat meningkatkan konsentrasi asam.
3. Sampel dengan konsentrasi KH2PO4 yang melampaui batas optimum (1,5–
2,0 g/10 gram sumber karbohidrat) akan memicu pembentukan asam-asam
dari gula sehingga menurunkan yield asam sitrat.
5. Sampel dengan konsentrasi MgSO4 yang melampaui batas optimum (2–5
g/100 gram sumber karbohidrat) akan menimbulkan efek buruk pada
pertumbuhan miselium sehingga akan mengurangi produksi asam sitrat.

5.2. Saran
1. Untuk mempercepat proses penyaringan dengan pompa vakum, tutup sampel
dengan plastik dan beri karet di sekelilingnya untuk memberikan suasana
hampa udara dan dapat mempercepat penyaringan.
2. Cermat ketika mengukur dan menimbang tiap variabel.
3. Sebaiknya inkubator lebih dibersihkan dan dalam keadaan steril agar proses
fermentasi dapat berlangsung baik tanpa tercemar.

31
 P2

DAFTAR PUSTAKA

Adham, 2001, “Attempt at improving citric acid fermentation by Aspergillus niger in

beet- molasses”, Bioresource Technology, hal 97 – 100.
Fuady, AM, dkk. 2015. Pengaruh Kadar Glukosa dan Waktu Inokulasi Pada Optimasi
Pembuatan Enzim Selulase dengan Menggunakan Jamur Aspergillus niger dan
Substrat Kertas. Surakarta: Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Madonna, Naomi dan Rizki Nur Dias. 2009. Fermentasi Ubi Jalar menjadi Asam
Sitrat dengan menggunakan metode Surface Culture. Semarang: Seminar Tugas
Akhir/Jurusan Teknik Kimia UNDIP.
Marison, I.W. (1988). Citric Acid Production. In: Scragg, A.H. ed. Cell Chemistry
Biotechnology for Engineers. Ellis Horwood Ltd, Chichester, p. 323-328.
Onikayanti,dkk . 2011. Pembuatan asam sitrat dengan menggunakan aspergillus
niger dengan cara fermentasi dengan berbagai variabel. Semarang :
Universitas Diponegoro
Papagianni, M.; Mattey, M.; Berovic, M.; Kristiansen, B., Aspergillus niger
Morphology and Citric Acid Production in Submerged batch Fermentation:
Effects of Culture pH, Phosphate and Manganese Levels. Food Technol
Biotechnol, 1999, 37, 165-171
Sasmitaloka, K.S. 2017. Produksi Asam Sitrat Oleh Aspergillus niger Pada Kultivasi
Media Cair. Universitas Sultan Ageng Tirtayasa: Banten.
Syansuriputra, A.A.; Setiadi, T.; Kushandayani, R.; Yunus, R.F., Pengaruh Kadar Air
Substrat dan Konsentrasi Dedak Padi pada Produksi Asam Sitrat dari Ampas
Tapioka menggunakan Aspergillus niger ITBCCL 74. Prosiding Seminar
Nasional Teknik Kimia Indonesia, Palembang, 19 – 20 Juli 2006.
Wangge, E.S., Suprapta D,N., Susanta G,N. 2012. Isolasi Dan Identifikasi Jamur
Penghasil Mikotoksin Pada Biji Kakao Kering Yang Dihasilkan Di Flores.
Universitas Udayana: Bali
Widyanti. 2010. Produksi Asam Sitrat Dari Substrat Molase Pada Pengaruh
Penambahan Vco (Virgin Coconut Oil) Terhadap Produktivitas Aspergillus
niger Itbcc L74 Terimobilisasi. Magister Teknik Kimia Universitas Diponegoro:
Semarang.
Vendenberghe. 2014. “Microbial Production of Citric Acid”. Laboratorium Teknologi
Bioproses Departemen Teknik Kimia Universitas Federal do Parana; Prancis.

32
 P2

LEMBAR PERHITUNGAN

Ca3(C6H5O7)2(s) + 3H2SO4(l) →3CaSO4(s) +2C6H8O7(s)

𝑥𝑔𝑟
= 𝐴 𝑚𝑜𝑙 3A mol
𝐵𝑀𝐶𝑎𝑆𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡

Buat larutan H2SO4 dengan melarutkan 5 mL H2SO4 pekat menjadi 100 mL

H2SO4 = vol H2SO4.ρH2SO4 kadar H2SO4

= 5 ml. 1,84 gr/ml3.98/100

= 9,016 gr

gr
 BM
Molar H2SO4 = mol/V V
9.016 gr
 98
0,1L
 0,92 M
Molar H2SO4 = mol/V
3𝐴𝑚𝑜𝑙
0,92 M = 𝑉

1. Variabel 1
Berat kertas saring = 0,8 gram
Berat kertas saring + edapan = 3,5 gram
Berat endapan = 2,7 gram
2,7
𝑛= = 0,0054𝑚𝑜𝑙
498

3𝑥0,0054
0,92𝑀 =
𝑣
V = 0,018L
2. Variabel 2
Berat kertas saring = 0,8 gram
Berat kertas saring + edapan = 5,1 gram
Berat endapan = 4,3 gram
4,3
𝑛= = 0,0086𝑚𝑜𝑙
498
3𝑥0,0086
0,92𝑀 =
𝑣
V= 0,0196L
3. Variabel 3
33
 P2

Berat kertas saring = 0,8 gram

Berat kertas saring + edapan = 5,9 gram
Berat endapan = 3,1 gram
5,1
𝑛= = 0,0102 mol
498

3𝑥0,0102
0,92𝑀 =
𝑣
V= 0,033L
4. Variabel 4
Berat kertas saring = 0,8 gram
Berat kertas saring + edapan = 5,0 gram
Berat endapan = 4,2 gram
2,7
𝑛= = 0,0054𝑚𝑜𝑙
498
3𝑥0,0054
0,92𝑀 =
𝑣
V= 0,018L

34
 P2

DATA PENDUKUNG

Tabel A. Data hasil praktikum asam sitrat

Hari 0 Hari 1 Hari 2 Hari 3 Hari 4 Hari 5

pH 3 3 3 3 2 2
Volume
titran (ml) - 1,9 2,2 2,4 2,5 2,8
pH 3 3 3 3 2 2
Volume
titran (ml) - 1,8 2 2,2 2,4 2,4
pH 3 3 3 3 2 2
Volume
titran
(ml) - 1,4 1,8 2,1 2,3 2,5
pH 3 3 3 3 2 2
Volume
titran
(ml) - 1,2 1,8 1,9 2 2,2

35