Pendahuluan
Bayam merupkan salah satu sayuran yang memiliki gizi tinggi dan kalori yang rendah.
kandungan nutrisi pada bayam meliputi kandungan vitamin A (beta karoten), vitamin C, ribflavin,
asam amino tiamin dan niacin. Kandungan dalam sayur bayam juga berupa zat besi dan kalsium
(Badarinath, 2010). Bayam ( Amaranthus sp) memiliki kandungan vitamin A, vitamin C, Ca dan
K sebanyak 40% dan kandungan Fe-nya cukup tinggi yakni sekitar dua kali lebih banyak
daripada sayuran lainnya. Bayam baik untuk kesehatan limpa, urine, dan sistem pencernaan.
Bayam juga bersifat laksatif (pencahar) dan baik digunakan sebagai diet untuk mengurangi berat
badan. Kandungan karotenoid dan klorofil bayam yang tinggi bertindak sebagai pencegah kanker
karena menghalangi mutasi sel. Cukup setengah cangkir jus bayam sehari dapat mengurangi
risiko kanker terutama paru (Adi, 2006).
Beta karoten merupakan provitamin A yang berperan penting bagi pembentukan vitamin A
yang berfungsi sebagai antioksidan. Tubuh membutuhkan antioksidan yang bekerja dengan cara
mengurangi kecepatan reaksi inisiasi pada reaksi berantai pembentukan radikal bebas dan
bermanfaat sebagai pencegahan kanker, beragam penyakit kardiovaskular dan katarak (Madhavi
et al., 1995). Antioksidan alami dapat ditemukan pada sayur-sayuran yang mengandung
fitokimia, seperti flavonoid, isoflavin, flavon, antosianin, dan vitamin C (Syaifuddin, 2015).
Karatenoid merupakan kelompok besar senyawa karoten yang dijumpai sebagai pigmen
(zat warna) pada daun dan sayuran. Karatenoid berfungsi sebagai antioksidan yang kuat. Pigmen
yang telah diidentifikasi termasuk dalam karatoneid yang dapat dibagi menjadi karoten dan
xantofil berjumlah lebih dari 500 pigmen. Karatenoid secara umumm efektif sebagai antioksidan
yang menangkap radikal bebas. Sumber yang kaya karatenoid adalah sayuran berwarna hijau tua
dan daun-daunan berwarna oranye (Yuliarti, 2009).
Gambar 1. Struktur α-karoten
CH3 CH3
CH3
Gambar 2.Strukturβ-karoten
Proses pengambilan zat warna alam disebut dengan ekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan
merebus bahan menggunakan pelarut yang sesuai. Bagian tumbuhan yang diekstrak adalah
bagian yang diindikasikan paling banyak memiliki pigmen warna seperti daun, batang, akar, kulit
daun, biji, ataupun daunnya (Gratha, 2012). Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu bahan dari
campurannya menggunakan pelarut. Ekstraksi menggunakan pelarut didasarkan pada kelarutan
komponen terhadap komponen lain dalam campuran. Pelarut polar akan melarutkan solut yang
polar dan pelarut non polar akan melarutkan solut yang non polar atau disebut dengan “like
dissolve like”. Teknik ekstraksi lainnya misalnya menggunakan air untuk mengambil pigmen
alami dari tumbuhan, seperti: daun, dan lain-lain. Ekstraksi pigmen adalah proses pemisahan
pigmen dari suatu bahan campurannya dalam jaringan tumbuhan menggunakan suatu pelarut
(David, 2002).
Kromatografi adalah pemisahan dengan metode fisika, dimana komponen-komponen
yang akan dipisahkan didistribusikan antara dua fase, salah satunya merupakan lapisan stasioner
dengan permukaan yang luas, dan fase yang lain berupa zat alir yang mengalir lambat. Fase
stasioner dapat berupa zat padat atau cairan, dan fase geraknya dapat berupa cairan atau gas.
Kromatografi ada empat macam, yakni kromatografi padat-cair, padat-gas, cair-cair, dan cair-gas
(Day dan Underwood, 1999).
Ekstraksi pigmen dapat dilakukan dengan beberapa teknik, salah satunya adalah dengan
menggunakan teknik kromatografi lapis tipis. Kromatografi lapis tipis merupakan cara pemisahan
campuran senyawa menjadi senyawa murni dengan mengetahui kuantitasnya. Kromatografi lapis
tipis juga dapat dimanfaatkann untuk memisahkan senyawa senyawa yang bersifat hidrofilik,
seperti lipid-lipid dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. Bahan-
bahan lapis tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi-pereaksi
yang lebih reaktif seperti asam sulfat (Fessenden,2003).
Pemilihan teknik kromatografi berdasarkan pada sifat kelarutan senyawa yang akan
dipidahkan. Kromatografi lapis tipis menggunakan lapisan tipis adsorben halus yang tersangga
pada papan kaca alumunium atau plastik sebagai pengganti kertas. Fase diam berupa silika.
Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang
dianalisis. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa&senyawa yang sifatnya
hidro!obik seperti lipida&lipida atau hidrokarbon yang sukar. Komponen yang dipisahkan harus
larut dalam!ase gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk berinteraksi dengan fase diam
dengan cara melarut didalamnya teradsorpsi atau bereaksi secara kimia (Gritter, 1991)
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis akan mendapatkan hasil yang optimal jika
menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sampel yang
digunakan hendaknya tidak terlalu banyak, sehingga tidak akan menurunkan resolusi. Penotolan
sampel dapat dilakukan dengan tiga cara, yakni sebagai suatu bercak, pita, atau dalam bentuk zig-
zag. Sampel dengan pita yang sempit akan menjamin resolusi yang paling tinggi. Syarat
pemisahan campuran dalam teknik pemisahan kromatografi antara lain :
- terdapat tempat atau medium perpindahan
- terdapat gaya dorong untuk zat yang dapat bergerak sepanjang fase diam
- terdapat gaya tolakan yang selektif yang dapat menyebabkan pemisahan dari senyawa kimia
(Sienko, 1984).
Prinsip kromatografi akan digunakan dalam penentuan suatu pelarut dan komposisi pada
lapisan tipis. Sampel yang akan dipisahkan diteteskan dengan menggunakan penyuntik dengan
ukuran mikro. Suatu sampel atau campuran harus memiliki sifat non polar dan mudah menguap.
Resolusi kromatografi lapis tipis memiliki nilai lebih kecil dari kromatografi kertas.
Kromatografi memiliki resolusi yang lebih tinggi karena laju difusi yang berada pada lingkungan
memiliki nilai yang sama kecil dengan lapisan pengadsorbsi. Faktor-faktor yang mempengaruhi
kromatografi dapat mempengaruhi nilai Rf antara lain :
- temperatur dan kesetimbangan
- pelarut pada fase geraknya
- derajat kejenuhan
- derajat aktifitas dan sifat fase diam
- senyawa kimia yang dipisahkan dan struktur kimianya
(Sumono, 1986).
Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh suatu senyawa terhadap
jarak yang ditempuh oleh fase geraknya dengan waktu yang bersamaan. Nilai Rf dari suatu
senyawa yang telah diketahui maupun tidak diketahui direaksikan dengan pelarut yang berbeda
akan membuktikan senyawa yang identik. Senyawa yang identik dapat bergerak sepanjang pelat
lapis tipis secara horizontal yang akan menunjukkan sifat identiknya (Day dan Underwood,
1999). Nilai Rf dapat didefinisikan secara sistematis yaitu :
Alat
Alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu beakr glass, Mortar, pestle, spatula, tabung
reaksi, chamber TLC, gelas ukur, pipet tetes, pinset, penggaris, lampu UV.
Bahan
Bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu Aseton, kertas saring, pelarut
aseton:heksana (3:7), lempeng silika.
Prosedur Kerja
Potong-potong kecil 5 gram sampel (daun, buah atau umbi) yang sudah bersih dan kering
(dengan jumlah air minimum). Digerus sampel menggunakan mortar dan pestle dengan
menambahkan aseton 5 mL. Dekantasi larutan ekstrak sambil peras padatan yang tersisa
menggunakan spatula (pada dinding mortar) hingga ekstrak aseton maksimum yang diperoleh
atau gunakan bantuan kertas saring untuk memeras pasta tersebut. Dimasukkan ekstrak dalam
tabung reaksi (sampel 1). Disiapkan chamber TLC dan tempatkan pelarut aseton:heksana (3:7)
kira-kira setinggi 0.5 cm. Tempatkan lempeng silika ukuran tertentu, yang sebelumnya telah
ditotolkan sedikit sampel ekstrak: sampel 1 ( 1 cm dari batas bawah kertas), pada TLC chamber.
Lalu tutup chamber dan tunggu pergerakan pelarut hingga sampai batas atas ( 0.5 cm dari batas
atas kertas). Ambil lempeng dengan menggunakan pinset dan keringanginkan. Jika sudah kering,
amati pemisahan pigmen yang terjadi pada lempeng menggunakan sinar UV. Ukur jarak yang
ditempuh senyawa dan pelarut tersebut. Hitung factor retensi (Rf) untuk masing-masing
komponen.
Waktu yang dibutuhkan
No Kegiatan Pukul Waktu
Pembahasan
Percobaan kali ini membahas tentang ekstraksi dan analisa pigmen daun bayam. Bayam
memiliki kandungan senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, dan steroid/triterpenoid.
Flavonoid merupakan salah satu senyawa termasuk dalam fenol. Flavonoid terdapat dalam semua
tumbuhan hijau. Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang bersifat sedikit asam yang dapat
larut dalam basa. Flavonoid merupakan senyawa polar dan umumnya larut dalam dalam pelarut
polar seperti etanol, metanol, butanol dan aseton. Bayam jika dikonsumsi dapat mencegah dan
mengatasi anemia (Markham, 1988). Proses analisa daun bayam dilakukan melalui proses
kromatografi lapis tipis. Kromatografi lapis tipis atau TLC adalah suatu kromatografi cair yang
terdiri atas fase diam dan fase gerak. Fase gerak dalam kromatografi lapis tipis berupa pelarut
pengembang dan fase diamnya berupa serbuk-serbuk halus. Serbuk halus ini berfungsi untuk
menyerap permukaan pada kromatografi padat cair dan berfungsi sebagai penyangga pada
kromatografi cair-cair (Iskandar, 2007).
Perlakuan pertama yang dilakukan pada percobaan ini yaitu preparasi sampel melalui proses
ekstraksi. Bagian yang digunakan pada bayam yaitu bagian daun karena pigmen karotenoid
paling banyak terdapat pada daun bayam. Daun bayam dipotong kecil dan ditimbang sebanyak 5
gr. Daun bayam dicuci agar terdapat sedikiit air dan dibasuh dengan tisu agar kadaer air
minimalis. Sampel ini dibuat dengan cara menghaluskan daun bayam menggunakan mortar. Daun
bayam dihaluskan agar pori-porinya mudah dijangkau oleh pelarut. Hal ini karena daun bayam
yang sudah halus memiliki luas permukaan yang lebih besar sehingga laju reaksi lebih cepat
berjalan selain itu agar zat-zat yang terkandung di dalamnya mudah dijangkau. Daun bayam
diekstraksi dengan pelarut aseton 5 mL. Penggunaan aseton yang bersifat polar ini bertujuan agar
pigmen yang terkandung dalam bayam dapat larut dalam aseton. Ekstrak sampel daun bayam
yang diperoleh kemudian didekantasi untuk mendapatkan ekstrak daun bayam yang terbebas dari
padatannya. Ekstrak daun bayam yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
Perlakuan selanjutnya yaitu preparasi chamber TLC dengan pembuatan eluen atau larutan
pengembang dengan pelarut aseton:heksana (2:3). Larutan eluen berperan sebagai fase gerak
yang mana akan mengangkut senyawa yang akan dipisahkan melalui fase diam yaitu plat silika.
Larutan eluen yang bersifat volatil yang telah dibuat tersebut kemudian ditutup dan didiamkan
selama 5 menit agar tidak terkontaminasi dengan pengaruh luar. Hal ini juga bertujuan untuk
menjenuhkan eluen yang dibuat. Aseton dan n-heksana digunakan sebagai eluen karena n-
heksana bersifat nonpolar dan aseton yang bersifat polar. Heksana yang bersifat non polar
berfungsi untuk menarik pigmen warna yang bersifat nonpolar sesuai dengan prinsip like dissolve
like yang berbunyi senyawa non polar hanya akan larut pada senyawa non polar juga sehingga
karoten yang sifatnya nonpolar maka tertarik oleh n-heksana, sedangkan aseton yang bersifat
polar akan mengangkat pigmen warna yang bersifat polar seperti klorofil a dan klorofil b untuk
mengalir di fasa diam (silika) yang juga bersifat polar.
Perlakuan selanjutnya yauitu preparasi plat silika yang berperan sebagai fase diam. Plat silika
pada proses ini digunakan dikarenakan plat silika memiliki gugus hidroksi yang dapat
membentuk membentuk ikatan hidrogen dengan eluen. Plat dibuat garis dasar (base line) yang
horizontal dengan ukuran 1 cm pada bagian bawah dan 0,5 cm pada bagian atas sebagai batas atas
untuk mempermudah menghitung jarak noda yang terelusi sehingga Rf noda dapat dihitung.
Garis pada bagian bawah silika berfungsi untuk menentukan posisi awal dari sampel sedangkan
garis atas berfungsi untuk menentukan posisi akhir penyerapan dari pelarut. Garis pada fase diam
berguna untuk menunjukkan posisi asli campuran. Pemberian garis ini dilakukan dengan
menggunakan pensil. Hal ini dikarenakan pensil (karbon) merupakan suatu padatan inert
sehingga tidak akan bereaksi dengan eluen dan tidak akan ikut menyebar apabila plat silika
dimasukkan pada fase gerak (eluen), sehingga tidak akan mempengaruhi hasil pemisahan.
Plat silika atau fase diam yang sudah siap kemudian ditotolkan dengan sedikit sampel daun
bayam pada garis batas bawah menggunakan pipa kapiler. Penggunaan pipa kapiler bertujuan
agar sampel yang ditambahkan tidak berlebih sehingga sampel tidak menyebar sebelum
dimasukkan dalam chamber TLC. Plat silika yang telah ditotolkan dengan sampel kemudian
dielusi dengan eluen melalui proses pemasukkan dalam chamber TLC, hingga fase gerak
mencapai batas atas plat silika. Proses ini memiliki tujuan agar plat silika dapat mengalami
penyerapan atau elusi dari fase gerak. Plat silika yang telah direndam dalam larutan eluen akan
dapat digunakan untuk proses pemisahan sampel setelah ditambahkan pada fase diam. Proses
peredaman ini dilakukan pada sudut yang minimum, dimana sudut plat silika akan mempengaruhi
migrasi pergerakan fase geraknya. Hal ini dikarenakan karena dengan sudut kemiringan yang
minimum maka hambatan yang dialami larutan yang dipengaruhi oleh adanya gravitasi dapat
berkurang. Proses berjalannya aeluen ini tidak berjalan dengan baik, sehingga praktikum
dianggap selesai karna eluen yang tidak sampai pada tanda batas atas.
Komponen yang bersifat nonpolar akan bergerak bersama aseton:heksana karena komponen
tidak tertahan oleh plat silika yang bersifat polar sehingga jaraknya akan semakin jauh.
Sedangkan komponen yang bersifat sedikit lebih polar akan memiliki jarak tempuh yang lebih
pendek daripada yang lebih nonpolar karena berinteraksi lebih kuat dengan plat silika. Fase gerak
yang sudah mencapai batas garis atas silika yang sudah ditandai, kemudian diambil plat silika
tersebut dan dikeringkan-keringkan. Proses pengeringan ini bertujuan untuk menguapkan pelarut
sehingga nanti akan diperoleh noda yang akan terlihat jelas. Plat yang sudah kering disinari
dengan sinar UV untuk mengetahui warna dan jarak pergerakan dari sampel yang digunakan.
Penggunaan sinar UV ini untuk membantu proses analisa pergerakan sampel melalui fase diam.
Hasil yang diperoleh saat disinari dengan sinar UV akan terbentuk noda warna yang akan
terlihat. Noda tersebut adalah jarak yang ditempuh oleh sampel pada fase diam. Pada hasil elusi
fase diam ini ditemukan noda berwarna hijau dan kuning. Pigmen berwarna hijau yang
terkandung yaitu pigmen klorofil sedangkan pigmen bewarna kuning yaitu pigmen karotenoid.
Klorofil adalah pigmen hijau yang ditemukan dalam banyak tanaman. Klorofil a dan b adalah
pigmen tumbuhan yang dibutuhkan dalam reaksi fotosintesis, diproduksi di kloroplast pada
jaringan fotosintesis yang ada di daun. Klorofil a berwarna hijau biru memiliki panjang
gelombang maksimum pada 430 nm dan 669 nm, sedangkan klorofil b berwarna kuning memiliki
panjang gelombang maksimum pada 453 nm dan 652 nm. Struktur dari klorofil a dan b dapat
diamati melalui gambar berikut:
Gambar 2. Struktur klorofil (Sumber: Sumono, 2010)
Pigmen karotenoid mempunyai struktur alifatik atau alisiklik yang pada umumnya disusun
oleh delapan unit isoprena, dimana kedua gugus metil yang dekat pada molekul pusat terletak
pada posisi C1 dan C6, sedangkan gugus metil lainnya terletak pada posisi C1 dan C5 serta
diantaranya terdapat ikatan ganda terkonjugasi. Struktur dari salah satu senyawa yang termasuk
dalam jenis karotenoid yaitu β-karoten adalah sebagai berikut:
H3C
H3C CH3 CH3 CH3
Referensi
David, W. 2002. Konsep Dasar Organik. Jakarta: UI – Press.
Fessenden. 2003. Kimia Organik. Jakarta: Erlangga.
Gratha, B. 2012. Panduan Mudah Belajar Membatik. Jakarta: Agromedia Pustaka.
Heriyanto. 2006. Komposisi dan kandungan pigmen utama tumbuhan taliputri Cuscutaaustralis.
Jurnal Marka Sains Vol.10 No. 2 November. 69-97
Kondororik, Federika, dkk. 2010. Identifikasi Komposisi Pigmen, isolasi dan aktivitas
antioksidan karoten pada rumput laut merah hasil budidaya. Jurnal kelautan
Rohman. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu.
Rubiyanto, D. 2013. Teknik Dasar Kromatografi. Yogyakarta: Deepublish.
Yuliarti, N. 2009. A to Z Food Supplement. Yogyakarta: Andi.
ScienceLab. 2019. Material Safety Data Sheet of aseton [Serial Online].
https://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927321 (diakses pada tanggal 08 April
2019).
ScienceLab. 2019. Material Safety Data Sheet of heksana [Serial Online].
http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927133 (diakses pada tanggal 08 April
2019).
Tim Penyusun. 2019. Petunjuk Praktikum Kimia Organik. Jember: Universitas Jember
Nama Praktikan :
Waladatus Sholikhah (171810301005)