IRWAN LAKANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
ii
ABSTRAK
IRWAN LAKANI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Proteksi Tanaman
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
iv
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. Dr. Ir. Tri Asmira Damayanti, M.Agr.
Ketua Anggota
Diketahui
Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc. Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc.
RIWAYAT HIDUP
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga penulis
dapat menyusun tesis dengan judul “Deteksi dan Identifikasi Penyebab Penyakit
Belang pada Tanaman Lada (Piper nigrum L) di Indonesia”. Tesis ini merupakan
salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi
Entomologi-Fitopatologi Departeman Proteksi Tanaman Sekolah Pascasarjana Institut
Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih penulis ucapkan kepada komisi pembimbing, Dr. Ir. Gede
Suastika, M.Sc. dan Dr. Ir. Tri Asmira Damayanti, M.Agr. atas segala arahan, bimbingan,
dan masukan saran-saran serta bantuan moril dan materil sejak penyusunan rencana
penelitian sampai penyusunan tesis ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ir.
Rodiah Balfas,M.Sc dan Dr.Ir. Sukamto, M.Sc. yang telah membantu untuk
menyediakan sebagian biaya sebagai bentuk kerjasama penelitian dan juga atas saran dan
masukan untuk penyusunan tesis ini. Ucapan terima kasih pula disampaikan kepada Dra.
Dewi Sartiami, M.Si. atas bantuannya dalam identifikasi serangga vektor.
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dekan Fakultas Pertanian dan Rektor
Universitas Tadulako Palu, atas dorongan dan izin yang diberikan untuk mengikuti
pendidikan S2 di IPB. Ucapan terima kasih juga kepada Dekan Sekolah Pascasarjana
IPB, Ketua Departemen Proteksi Tanaman, dan Ketua PS Entomologi-Fitopatologi atas
kesediaan menerima penulis untuk studi di IPB.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Kepala Laboratorium Virologi
Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman atas izin penggunaan bahan dan peralatn
laboratorium. Kepada laboran, Pak Edi, Ibu Aisyah terima kasih atas bantuan teknis dan
pengetahuan teknis yang diberikan selama penelitian dilaksanakan.
Terima kasih yang sebesar-besarnya kepada sahabat dan senior di Laboratorium
Virologi Tumbuhan, Tuty Leg iastuty yang tidak bosan menjawab pertanyaan-pertanyaan
bila penulis mengalami kesulitan, Ir. Noor Aidawati, M.Si, Ir. Elisa S. Rusli, M.Si, Dr.
Ir. Muhamma d Taufik, M.Si., Ir. Ummu S.R, M.Si, Firdaus, SP,M.Si., Supriyanto,
SP,M.Si. atas bantuan dan saran-saran selama penelitian. Juga kepada teman-teman
seangkatan, Pak Rustam, Pak Andre, Pak Jekvy, Ibu Yayuk, Ibu Rita, penulis ucapkan
terima kasih atas kebersamaan selama menempuh pendidikan S2.
Kepada rekan-rekan di Himpunan Mahasiswa Pascasarjana Sulawesi Tengah
(Himpast) dan teman-teman serumah Bang Suhaedi, Pak Nur Sangadji, Pak Iskandar, Pak
Wahid serta Fajar, penulis haturkan terima kasih atas dukungan semangatnya.
Kepada Ayahanda (Alm) dan Ibunda (Alm), penulis ucapkan terima kasih yang tak
terhingga atas asuhan dan didikkan sehingga penulis dapat bertahan dan melanjutkan
hidup tanpa sempat didampingi sejak SD hingga sekarang, kepada paman dan bibi serta
kakak dan adiku terima kasih atas dukungan moril dan materil yang tiada hentinya.
Rasa terima kasih yang tulus penulis ucapkan kepada istri tercinta Dian Astuti,
yang begitu sabar ditinggal selama menempuh pendidikan S2 hingga hadirnya buah hati
tercinta “Afiqah Syazana”. Terima kasih pula sedalam-dalamnya kepada mertua, Bapak
Soebandjar S dan Ibu Dra. Farida S. Amu, M.Si atas bantuan yang amat tulus dan
dorongan semangat.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan yang terdapat dalam tulisan ini,
namun demikian penulis harapkan semoga tesis ini dapat memberikan informasi dan
banyak manfaat kepada pembaca.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... ix
PENDAHULUAN
Latar Belakang ........................................................................................ 1
Tujuan Penelitian .................................................................................... 4
Hipotesis ................................................................................................. 4
TINJAUAN PUSTAKA
Gejala Infeksi Virus Pada Tanaman Lada.............................................. 5
Karakter Molekuler Virus Penyebab Penyakit Belang........................ 6
Penularan Virus Penyebab Penyakit Belang........................................ 8
Deteksi dan Identifikasi Virus Penyebab Penyakit Belang................. 9
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................... 11
Survei Lokasi dan Pengambilan Sampel................................................ 11
Persiapan Vektor dan Tanaman Lada..................................................... 11
Penularan Virus...................................................................................... 13
Deteksi CMV dan PYMV dengan Teknik Serologi............................... 14
Deteksi Molekuler PYMV dengan PCR................................................ 16
Purifikasi Virus....................................................................................... 18
Perunutan Susunan Nukleutida............................................................... 18
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kejadian Penyakit Virus di Pertanaman Lada........................................ 20
Penularan Virus Belang................................................................................ 23
Purifikasi Virus...................................................................................... 29
Perunutan Nukleutida PYMV................................................................. 30
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan ........................................................................................... 33
Saran...................................................................................................... 33
DAFTAR PUSTAKA...................................................................................... 34
LAMPIRAN ................................................................................................... 38
viii
DAFTAR TABEL
Nomor Halaman
DAFTAR GAMBAR
Nomor Halaman
8 Hasil PCR PYMV asal Bogor pada agarose gel 1,5% TBE
yang dianalisa lebih lanjut dengan sequencing; (M) Marker
100 bp (P) PYMV asal Bogor..................................................... 30
Latar Belakang
Tanaman lada (Piper nigrum L.) merupakan salah satu komoditas ekspor
tradisional andalan yang sudah cukup dikenal di dunia. Tanaman lada bukan
tanaman asli Indonesia, namun sejak dibudidayakan di beberapa daerah
keberadaannya sangat penting dalam menunjang perdagangan luar negeri. Lada
sangat dibutuhkan terutama sebagai produk rempah-rempah, maupun bahan baku
industri produk lain.
Ekspor lada Indonesia tertinggi dicapai pada tahun 2000 yaitu sebanyak
65.011 ton dengan nilai $ 221 juta. Hal ini telah membuktikan kontribusi lada
Indonesia dalam pemenuhan kebutuhan lada dunia yaitu 38% kebutuhan lada
dunia (172.000 ton) (Deptan, 2003).
Produksi lada Indonesia selama 10 tahun terakhir cukup berfluktuasi,
produksi terendah terjadi pada tahun 1997 sedang tertinggi pada tahun 2003.
Lada yang dihasilkan adalah lada hitam dan lada putih. Lada hitam dihasilkan di
Lampung dan dikenal dengan sebutan lampung black pepper, sedangkan lada
putih di Bangka dan daerah lainnya dikenal dengan sebutan muntok white pepper.
Sekitar 80% dari produksi lada Indonesia merupakan komoditas ekspor , sehingga
tingkat harga lada internasional akan sangat dipengaruhi kondisi perladaan
Indonesia (Fery et al. 2004).
Berdasarkan data Departemen Pertanian (2004) (Tabel 1), produksi lada
Indonesia sejak tahun 2000 sampai 2002 meningkat namun volume ekspor al da
Indonesia terus mengalami penurunan. Produktivitas lada pada selang waktu yang
sama mengalami penurunan. Tahun 2000 produktivitas lada mencapai 0,46 ton/ha
sedangkan tahun 2003 produktivitasnya turun menjadi 0,44 ton/ha. Penurunan
produktivitas ini merupakan akibat dari beberapa faktor, diantaranya teknik
budidaya yang belum intensif dan terdapatnya gangguan beberapa organisme
pengganggu tanaman, diantaranya adalah infeksi virus. Kehilangan hasil akibat
serangan hama dan penyakit pada tanaman lada tahun 1999 diperkirakan
menyebabkan kerugian sebesar 6 juta US$ (Manohara dan Rizal 2002).
2
Tabel 1 Luas areal, produksi, produktivitas dan ekspor komoditi lada Indonesia
tahun 1990 - 2003
Ekspor
Luas Areal Produksi Produktivitas
Tahun (ha) (ton) (ton/ha) Volume Nilai
(ton) (000 US$)
1990 127.582 69.899 0,55 48.442 80.575
1991 126.783 62.549 0,49 50.300 66.820
1992 127.200 65.014 0,51 62.317 62.406
1993 130.676 65.782 0,50 27.689 46.044
1994 127.673 54.043 0,42 36.045 78.636
1995 134.689 58.955 0,44 57.781 155.430
1996 126.632 52.168 0,41 36.848 98.864
1997 111.263 46.708 0,42 33.386 163.144
1998 131.265 64.538 0,49 38.724 188.917
1999 136.842 61.224 0,45 36.293 191.241
2000 150.531 69.087 0.46 65.011 221.090
2001 186.022 82.078 0.44 53.638 100.507
2002 204.068 90.181 0.44 63.214 89.197
2003 *) 204.107 90.413 0.44 54.350 93.454
Sumber : Direktorat Jenderal Bina Produksi Perkebunan
Keterangan : *) Data Sementara
Adapun beberapa virus yang menginfeksi tanaman lada yaitu antara lain
Piper Yellow Mottle Badnav irus (PYMV) dan Cucumbar Mosaic Cucumo virus
(CMV) yang bergejala umum belang dan keriting. Penyakit ini dikenal dengan
beberapa nama yaitu penyakit kuning lada (Ben 1988), penyakit kerdil (Firdaus il
1988), penyakit keriting (Balfas et al. 2001), dan penyakit belang (mottle) (Eng
2002). Penyakit ini dan beberapa hama dan penyakit lainnya yang menginfeksi
tanaman lada, menyebabkan rendahnya produksi lada di Bangka, Lampung dan
Kalimantan Barat, yait u rata -rata 1,07 ton/ha (Manohara dan Rizal 2002).
Pada awalnya penyakit dengan gejala bervariasi kuning, keriting dan
belang ini diduga disebabkan oleh mikoplasma (fitoplasma) (Ben 1988). Di
Serawak (Malaysia), penyakit belang pada tanaman lada diketahui disebabkan
oleh dua jenis virus yaitu PYMV dan CMV yang saling berasosiasi dalam
3
Serawak terlihat bahwa tanaman yang terinfeksi oleh Badnavirus hanya bergejala
belang dan tidak memperlihatkan gejala kerdil (keriting) serta ukuran daun tidak
berkurang. Balfas et al. (2001) mengemukakan penyakit keriting tanaman lada di
Indonesia belum dapat dipastikan penyebabnya. Hasil penelitian penularan
penyakit keriting yang dilakukan Balfast et al. (2001) mengindikasikan
keberadaan PYMV tetapi hasilnya belum dapat dipastikan karena hanya
berdasarkan pengamatan gejala dan pengamatan dengan mikroskop elektron,
namun oleh Febrianti (2004) dilaporkan bahwa penyakit keriting pada lada di
daerah Sukamulya disebabkan oleh CMV.
Berdasarkan uraian tersebut perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang
deteksi dan identifikasi penyebab penyakit belang pada tanaman lada yang ada
pada beberapa lokasi pertanaman lada di Indonesia.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mendeteksi dan mengidentifikasi virus penyebab penyakit belang (mottle ),
pada tanaman lada yang terdapat di Bangka, Lampung, Sukamulya, dan
Bogor.
2. Mengetahui efisiensi penularan penyakit belang (mottle) melalui vektor P.
minor, F.virgata, dan A.gossypii.
Hipotesis
1 Penyakit belang pada tanaman lada di Bangka, Lampung, Sukabumi, dan
Bogor berasosiasi dengan CMV dan PYMV.
2 Serangga vektor P. minor lebih efis ien menularkaan virus dibanding
F.virgata dan A.gossypii.
5
TINJAUAN PUSTAKA
golongan tripartite virus, yaitu virus yang memiliki tiga partikel CMV berbentuk
polihedral dengan diameter 30 nm. Berat molekul keseluruhan partikel 5.8 – 6.7 x
106 dalton, tersusun dari asam nukleat dan selubung protein, berukuran 28-30 nm
(Smith 1972). Menurut Agrios (1997), virus ini terdiri atas 180 sub unit protein
dan memiliki RNA utas tunggal. CMV mempunyai titik panas inaktivasi 70 oC
(10 menit), titik batas pengenceran 10-4 , dan ketahanan in vitro pada suhu 20 oC
selama 3 - 6 hari (Gibbs dan Harrison 1970).
CMV terdiri atas 3 RNA fungsional yaitu RNA 1, RNA 2, dan RNA 3 serta
satu subgenom RNA yaitu RNA 4 yang merupakan hasil transkripsi dari RNA 3
pada proses replikasi (Hu et al. 1995). RNA 1, RNA 2, dan RNA 3 memiliki
ukuran berturut-turut sekitar 3,4 kb, 3,0 kb, dan 2,2 kb (Pares et al 1992). Tiga
RNA tersebut terbungkus dalam tiga partikel icosahedral dengan diameter sekitar
28 nm. CMV memilki berat molekul berkisar antara 5,8 – 6,7 x 106 yang terdiri
dari 18% RNA dan 82% protein (Ferraira dan Bolley 1992). Empat jenis RNA
yaitu 1270 kDa (RNA-1), 1130 kDa (RNA-2), 820 kDa (RNA3), dan 350 kDa
(RNA4) terbungkus sebagai RNA-1 dan RNA-2 secara terpisah dan RNA-3 dan
RNA-4 bersama dalam satu partikel. RNA-1, -2, dan -3 infektif, sebaliknya
RNA-4 mengandung gen untuk coat protein. Beberapa isolat CMV mengandung
small ssRNA (10 kDa) yang dikenal sebagai satelit. Coat protein satelit
mengandung polypeptida tunggal berukuran 24,5 kDa (Sutic et al. 1999).
CMV mempunyai banyak strain yang berbeda dalam urutan nukleotida
strain -strain tersebut (Kaper dan Waterworth, 1981). Ragam strain CMV yang
paling banyak dikenal menurut Gibbs dan Harrison (1970) adalah: yellow strain
menyebabkan mosaik kuning yang sangat jelas pada Nicotiana sp. dan lesio
nekrotik pada Zinnia elegans; Y strain pada Vigna sinensis menyebabkan gejala
mosaik seperti yellow strain , namun dengan gejala yang lebih ringan; dan spinach
strain pada N. tabacum, menyebabkan lesio lokal, atau mosaik sistemik, atau
bercak cincin diikuti dengan salah bentuk dan nekrosis pada tulang daun.
Belum banyak informasi molekuler yang diketahui tentang virus ini. Hasil
pengamatan dengan mikroskop elektron menunjukkan bahwa PYMV berbentuk
bacilliform tidak memiliki pembungkus, berukuran 30 x 125 nm. Partikel
memiliki double-stranded DNA. Virus ini termasuk dalam genus badnavirus
(Lockhart et al. 1997).
Genus Badnavirus memiliki beberapa anggota spesies selain PYMV, yaitu :
Banana streak virus (BSV), Cacao swollen shoot virus (CSSV), Canna yellow
mottle virus (CaYMV), Commelina yellow mottle virus (ComYMV), Dioscorea
bacilliform virus (DBV), Kalanchoe top -spotting virus (KTSV), Rice tungro
bacilliform virus (RTBV), Schefflera ringspot virus (SRV), dan Sugarcane
bacilliform virus (SCBV).
Salah satu anggota Badnavirus yaitu RTBV telah diketahui berukuran 8,0
kbp. RTBV memiliki open reading frame (ORF) yang panjang, menyandi
poliprotein (P3). Poliprotein tersebut terdiri atas gen penyandi capsid protein
(CP), movement protein (MP), aspartat protease (PR), dan reverse transcriptase
(RT) dengan aktivitas ribonuklease H (Marmey et al. 2005).
ditularkan ke keturunan kutudaun tersebut (Gibbs dan Harrison 1970; Kaper dan
Waterworth 1981).
Kisaran tumbuhan inang CMV sangat luas, meliputi berbagai spesies dari
Famili Ranunculaceae, Cruciferae, Violaceae, Polygonaceae, Phytolacaceae,
Chenopodiaceae, Geraniaceae, Tropaeolaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae,
Leguminosae, Apocynaceae, Solanaceae, Compositae, Primulaceae, dan
Asclepiadaceae (Smith 1972). Menurut Agrios (1997) CMV dapat menyerang
tanaman sayuran, tanaman hias dan jenis tanaman lainnya. Selain menyerang
tanaman ketimun, virus ini juga menyerang tanaman cabai, melon, labu, lada,
bayam, seledri, tomat dan tanaman polong-polongan.
PYMV tidak dapat ditularkan secara mekanis namun dapat ditularkan
melalui penyambungan, serangga vektor kutu putih dan D. distansi dan melalui
benih dengan efisiensi hanya 5% (de Silva et al. 2002). Efisiensi penularan
PYMV dengan vektor F.virgata mencapai 70% sedangkan secara mekanis tingkat
keberhasilannnya kecil yaitu sekitar 10% (Bhat et al. 2003)
penggunaan antiserum yang sedikit, dan hasilnya dapat diperoleh secara kualitatif
dan kuantitatif, serta prosedur pengujian yang mudah. Karena keuntungan-
keuntungan tersebut, ELISA denga n cepat menggantikan semua teknik seri
diagnostik yang lain (Agrios 1997).
Identifikasi CMV pada sampel tanaman lada yang berasal dari Sukabumi
telah dilakukan oleh Febrianti (2004) menggunakan antiserum CMV dan
menunjukkan bahwa 92% sampel yang diuji positif terinfeksi CMV. Bhat et al.
(2002) melakukan pengujian pada sampel lada di India untuk mendeteksi
keberadaan PYMV menggunakan metode Direct antigen-coated ELISA (DAC-
ELISA) dengan antiserum Commelina yellow mottle badnavirus (CoYMV),
Banana streak badnavirus (BSV), Rice tungro bacilliform badnavirus (RTBV)
and Sugarcane bacilliform badnavirus (ScBV), Potato virus potyvirus Y (PVY),
Tobacco streak virus ilarvirus (TSV), Groundnut bud necrosis tospovirus
(GBNV) , dan CMV, hasilnya menunjukkan hanya 2 antiserum bereaksi positif
dengan PYMV yaitu antiserum BSV dan antiserum ScBV.
Dewasa ini karakterisasi maupun identifikasi virus tumbuhan selain
menggunakan teknik serologi, telah banyak dikembangkan teknik molekuler
melalui analisis sidik jari DNA. Ide ntifikasi virus banyak mengunakan teknik
Polymerase chain reaction (PCR). Teknik PCR dapat mengatasi masalah
konsentrasi virus yang rendah, walaupun sampel yang digunakan sedikit dan dapat
berupa bahan segar, beku ataupun kering (Rojas et al. 1993; Wyatt dan Brown
1998).
Pengujian dengan teknik PCR memerlukan sepasang primer yang spesifik
yang akan menginduksi pembentukan dan perbanyakan asam nukleat atau untai
DNA dengan bantuan enzim Taq polymerase dalam mesin PCR atau
thermocycler. Pemilihan primer yang tepat sangat menentukan keberhasilan
identifikasi suatu jenis virus (Rojas et al. 1993). Febrianti (2004) melakukan
teknik PCR untuk mendeteksi CMV pada tanaman lada menggunakan sepasang
primer CMV -R dan CMV-F yang dibuat berdasarkan sekuen CMV-B2 (RNA2)
diperoleh ukuran pita 940 bp. Metode PCR untuk mendeteksi PYMV dengan
menggunakan sepasang primer berhasil mengamplifikasi ukuran pita DNA 450 bp
11
(5’-primer BADNA 2 dan 3’-MYS) dan 700 bp (primer Badna-T dan SCBV R1)
(Lockhart et al. 1997; de Silva et al. 2002).
100% selama 10 menit, lalu ditambahkan tiga tetes minyak cengkeh dan ditunggu
selama 10 menit. Tahap akhir, kutu putih yang telah diproses sebelumnya
diletakkan pada gelas objek dan ditambahkan balsam kanada, posisinya diatur dan
ditutup dengan gelas penutup.
Pembuatan preparat awetan kutu daun. Preparat awetan dibuat
menurut metode Blackman dan Eastop (1994). Kutu daun dimasukkan dalam
tabung reaksi yang berisi 5 ml alkohol 95% dan dipanaskan dalam penangas air
selama 10 menit. Se lanjutnya kutu daun diangkat dipindahkan dalam tabung
reaksi yang berisi 5 ml KOH 10% dan dipanaskan kembali sampai kutu daun
tersebut telihat transparan. Kemudian larutan KOH bersama kutu daun dituang ke
dalam cawan sirakus, lalu isi tubuh serangga dikeluarkan dengan cara dilubangi
dengan jarum serangga dan ditekan secara perlahan-lahan. Kemudian serangga
dicuci dengan akuades sebanyak tiga kali. Perlakuan berikutnya adalah dehidrasi
kutu daun dengan cara merendam secara berurut-turut dalam alkohol 50% , 70%,
95% dan 100% masing-masing selama 5 menit. Selanjutnya kutu daun diletakkan
di atas gelas obyek dan ditetesi minyak cengkeh dan dibiarkan 2 menit.
Kemudian minyak cengkeh dikeluarkan dengan cara diserap menggunakan kertas
tissue. Langkah selanjutnya, kutu daun ditetesi dengan balsam kanada dan diatur
posisinya lalu ditutup dengan gelas penutup.
Perbanyakan Vektor
Imago P.minor diperoleh dari tanaman lada di rumah kaca Balitro
Cimanggu dan diperbanyak pada umbi kentang yang telah bertunas, sedangkan
imago F. virgata diperoleh dari tanaman lada di Kebun Percobaan Balitro
Sukamulya dan diperbanyak pada bibit tanaman lada sehat. Imago A. gossypii
diambil dari tanaman tapak dara (Catharathus roseus (L) G.Don .) di halaman
Balitro Cimanggu, kemudian dipelihara dan diperbanyak pada jenis tanaman yang
sama. Perbanyakan serangga vektor di atas dilakukan di laboratorium hama
Balitro Cimanggu. Vektor yang akan digunakan dalam uji penularan adalah
generasi ketiga untuk membebaskan vektor dari virus yang mungkin terbawa dari
lapangan.
14
Penularan Virus
Uji penularan virus dilakukan terhadap kedua jenis virus yang berasosiasi
dengan tanaman lada yaitu CMV dan PYMV. Sumber inokulum berasal dari
koleksi tanaman sakit Balitro Cimanggu yang positif terinfeksi CMV dan PYMV
berdasarkan uji ELISA (Gambar lampiran 2). Penularan dilakukan menggunakan
vektor, P. minor, F.virgata dan A.gossypii. Serangga instar pertama hasil
perbanyakan dipindahkan ke tanaman sakit dengan periode akuisisi selama satu
jam untuk A.gossypii dan 24 jam untuk kedua jenis vektor lainnya. Vektor
kemudian dipindahkan ke tanaman sehat dengan periode inokulasi sela ma 24 jam
untuk A.gossypii dan 36 jam untuk P. minor dan F.virgata. Penularan virus
dilakukan terdiri atas perlakuan tiap jenis serangga dengan jumlah masing-masing
serangga vektor yaitu kontrol, 1, 3, 7, dan 10 ekor serangga untuk setiap tanaman
yang diulang sebanyak lima kali. Perlakuan kontrol digunakan 10 ekor serangga
yang tidak ditularkan ke tanaman sakit (Gambar lampiran 3). Peubah yang
diamati adalah masa inkubasi dan persentase tanaman terserang (kejadian
penyakit) serta deskripsi gejala yang muncul. Seluruh tanaman hasil penularan
dideteksi dengan ELISA untuk konfirmasi terjadinya penularan.
Visualisasi DNA
DNA virus hasil amplifikasi dielektroforesis menggunakan gel agarose
1,5% (w/v) (dalam TBE 1X) yang ditambahkan ethidium bromide (0,5 µl /10 ml
TBE). Untuk pengukuran DNA digunakan Marker 100 bp ladder. Sampel
disiapkan dengan mencampurkan 12 µl DNA dan 2 µl loading buffer. Selanjutnya
masing-masing sampel diisikan dalam sumuran gel dengan pipet mikro
(Sambrook et al. 1989). Elektroforesis dilakukan pada tegangan 70 V DC selama
60 menit. Hasil visualisasi elektroforesis tersebut dilihat dibawah transilluminator
ultraviolet dan dipotret menggunakan gel dok.
Purifikasi Virus
Purifikasi virus dilakukan mengikuti prosedur yang dimodifikasi dari de
Silva et al. (2002). Daun lada terinfeksi PYMV dihomogenasi selama 90 detik
pada suhu 4 oC dalam bufer ekstraksi [0.25 M Tris-HCI pH 7.4 yang mengandung
0.5% (w/v) Na2SO3, 4% (w/v) polyvinyl pyrrolidne (PVP-40), 0,5% (v/v) 2-B
mercaptoethanol, 0.25% diethyldithio-carbamic acid (DIECA)]. Perbandingan
daun ter hadap bufer adalah 1:10 (b/v).
Sap disaring dengan kain kasa dan kemudian disentrifugasi pada kecepata n
12.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC. Partikel PYMV dipresipitasi dengan
menambahkan polyethylene glycol (PEG, MW 6000) (konsentrasi PEG 4% dan
mengandung 1,75% NaCI) kemudian diaduk dengan stirer selama 1 jam pada
suhu 4 o C, lalu dipeletkan dengan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 15 menit pada suhu 4 oC). Pelet yang diperoleh diresuspensikan dalam
larutan suspensi semalam [10 ml sap dalam 100 ml bufer suspensi (50 mM Tris-
HCI, 150 mM NaCI pH 7.4) ] pada suhu 4 oC. Ekstrak kasar hasil fitrasi
ditambahkan 0,25% Triton X-100 sambil diaduk dengan strirer selama 30 menit
pada suhu 4 oC, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 20
menit pada suhu 4 oC. Supernatan diambil dan diultrasentrifugasi pada kecepatan
30.000 rpm selama 1,5 jam pada suhu 4o C). Pelet yang merupakan virus murni
19
a b
c d
Gambar 1 Gejala tanaman yang terinfeksi virus di lapangan, (a) malformasi daun,
(b) bercak klorotik/mottle, (c) keriting, (d) dompolan buah yang tidak
terbentuk sempurna
Tabel 2 Gejala infeksi penyakit belang dan keriting serta hasil uji ELISA
terhadap sampel tanaman yang positif terinfeksi CMV dan PYMV
(NAE)
SAMPEL GEJALA
CMV PYMV
Kontrol Negatif CMV 0,102
Kontrol Negatif PYMV 0,175
Daun mengecil, malformasi, klorotik, malai bunga
Bangka I.1 0,214 -
memendek, ruas tanaman pendek
Malformasi, klorotik, malai bunga memendek, ruas
Bangka I.3 0,176 -
tanaman pendek
Bangka I.5 0,189 0,265 Daun normal, warna bercak klorotik/ belang
Bangka II.3 0,156 0,274 Daun keriting, warna bercak klorotik / belang
Bangka II.2 1,321 - Bentuk daun keriting, Vein clearing.
Bangka III.5 0,804 - Daun keriting
Bangka IV.4 0,806 - Daun klorotik, keriting.
Bangka V.6 0,664 - Daun menguning, bercak klorotik
Bangka VI.3 0,799 - Daun keriting, bercak klorotik
Bangka VII.4 0,993 - Bercak klorotik, ukuran daun normal
Bangka VIII.3 0,988 - Bercak klorotik, ukuran daun normal
Bangka Paniur 0,232 0,513 Bentuk daun normal, gejala samar, sedikit klorosis
Bangka LDL - 0,413 Daun tidak simeris, belang, daun bergelombang
Bangka LDK - 0,325 Idem LDL
Bangka Natar 1 - 0,353 Bentuk daun normal, mottle
Gunung Labuan
0,891 - Daun keriting, bercak klorotik
Waikanan
Talang Empang 0,845 - Daun keriting, bercak klorotik
Lampung 1 1,175 - Daun keriting, bercak klorotik
Lampung 3 1,561 - Daun keriting, bercak klorotik
Lampung 5 1,252 - Daun keriting, bercak klorotik
Bengkayan Sukabumi 1,476 - Bentuk daun keriting, warna bercak belang/ klorosis
Lada Liar (Rhino) 0,817 - Bercak klorotik, ukuran daun normal
LDL Sukamulya 0,859 - Bentuk daun keriting, bercak klorotik/ belang
Bogor, Cunuk 0 0,381 0,600 Malformasi, permukaan bergelombang, belang
Bogor, Cunuk 1 - 0,288 Bentuk daun normal, belang keseluruhan daun
Bogor, LDL - 0,270 Daun normal, hijau muda, belang kurang jelas
Bogor, Petaling 1 - 0,263 Malformasi, permukaan bergelombang, belang
Bogor, Petaling 2 - 0,271 Daun oval, belang, permukaan bergelombang
Bogor, Natar 1 0,231 0,332 malformasi, permukaan bergelombang, belang
Bogor, Natar 2 - 0,316 Daun normal, belang
Bogor, Bangka - 0,346 Daun oval kecil, warna hijau muda, belang
Bogor, Talang Empang - 0,323 Daun ter gulung kearah bawah, belang
Keterangan : NAE = Nilai Absorban ELISA ; ( - ) = < 1,5 kali NAE kontrol negatif
23
M 1 2 3 4 5 6
700 bp
650 bp
300 bp
Gambar 2 Hasil visualisasi pita DNA PYMV pada agarose gel 1,5% TBE;
(M) marker 100 bp (1) sampel lada dari Sukabumi (2) Bangka
(3) Lampung (4-5) Bogor (6) Tanaman lada sehat sebagai
kontrol negatif.
terlihat anal lobe bar pada bagian dasar seta apikal Terdapat pori multikular di
bagian anterior di bawah tungkai depan dengan jumlah tertentu. Di sekitar vulva
juga terdapat pori multikolar berbaris ganda melintas bagian posterior dari
abdomen segmen III-VII dan baris tunggal melintas bagian anterior segmen IV-
VI, terkadang terdapat pada bagian tengah antara toraks dan kepala.
anterior
posterior
a b c
Gambar 6 Gejala yang muncul pada tanaman lada hasil penularan, (a) belang,
(b) malformasi, (c) bercak klorotik, setelah diinokulasi virus dengan
vektor P.minor dan F.virgata.
Hasil uji efisiensi penularan virus menunjukkan bahwa satu ekor P.minor
sudah mampu menularkan PYMV dengan efisiensi 40% dan 100% dengan vektor
F.virgata (Tabel 3).
Tabel 3 Periode inkubasi dan persentase kejadian penyakit serta gejala penyakit
belang pada tanaman lada uji setelah diinokulasi melalui vektor P.minor
dan F.virgata.
Periode Kejadian
Serangga Jumlah vektor
inkubasi penyakit * Gejala
vektor (ekor)
(hari) (%)
P.minor Kontrol 0 0 TB
1 32,0 40 LK, N.
3 22,3 80 MF, M, VC
7 22,5 100 MF, M, VC
10 19,3 100 MF, M, VC,K
F.virgata Kontrol 0 0 TB
1 31,3 100 M, VC
3 28,0 100 LK
7 18,8 100 MF, LK, VC
10 16,8 100 MF, M, VC,K
Keterangan : Kontrol = 10 ekor serangga yang tidak mengakuisisi virus pada tanaman sakit
* Dikonfirmasi dengan uji ELISA
TB = Tidak bergejala; MF = Malformasi daun; LK= Lesio Klorotik; M = Motel
N = Nekrotik; VC = Vein Clearing ; K = Kerdil
.
Menurut laporan Omura et al. (1983) genom Badnavirus pada ORF III
diduga berperan dalam penularan oleh kutu putih seperti penularan BSV, CoYMV
dan SCBV serta transmisi RTBV oleh masing-masing vektornya..
Purifikasi Virus
Pada pemurnian virus penyebab penyakit belang diperoleh hasil dan tingkat
kemurnian yang masih rendah. Hal ini disebabkan daun tanaman lada
mengandung senyawa fenolik yang tinggi, se hingga mudah teroksidasi. Hasil
purifikasi dengan densitas sentrifugasi gradien sesium clorida (CsCl)-sukrosa,
melalui pengamatan menggunakan penglihatan dengan bantuan cahaya diperoleh
tiga fraksi yaitu fraksi 1 dan 2 merupakan larutan bufer yang bercampur dengan
debris dan fraksi 3 merupakan campuran partikel virus merupakan campuran
larutan CsCl dan sukrosa serta partikel lain yang berukuran besar (Gambar 7).
Salah satu fraksi yaitu fraksi 3 diperoleh nilai absorbansi pada A 260/280 yaitu
1,08 untuk sampel Bogor dan 1,29 untuk sampel Sukamulya. Hasil sesuai
penelitian yang dilaporkan oleh de Silva et al. (2002) pada tanaman lada yang
terinfeksi PYMV menggunakan gradien CsCl-sukrosa diperoleh tiga fraksi
(band). Steere (1964) menyatakan, jika sampel larutan virus di sentrifugasi
dengan gradien CsCl, molekul garam berukuran berat akan bergerak ke arah dasar
tabung dan kerapatan akan menjadi stabil selama sentrifugasi. Partikel dalam
larutan dengan kerapatan lebih besar dan lebih kecil akan mengapung pada
kerapatan yang sesuai dengan kondisi kerapatan fraksi.
Fraksi 1
Fraksi 2
Fraksi 3
M P
600 bp
Gambar 8 Hasil PCR PYMV asal Bogor pada agarose gel 1,5% TBE, yang
dianalisa lebih lanjut dengan sequencing; (M) Marker 100 bp
(P) PYMV asal Bogor.
31
PYMV_Bgr: 1 CTCCTTTATCTCCTCAAAGAGCTTCCAAGACTCCGACGGATAGGGTTCAACGAGTACATA 60
|||||| |||||||||| ||| | ||||| ||||| |||||||||||| || ||||||
PYMV_DS : 1 CTCCTTCATCTCCTCAAGAAGCCTTCAAGAGTCCGATGGATAGGGTTCACTGATTACATA 60
Urutan basa antara sekuen PYMV Bogor dan PYMV de Silva et al. yang
tidak sama yaitu, T7C, A18G, G19A, T23C, C25T, C31G, C37T, A50C, C51T,
G54T, C63A, A71G, A72G, T77A, T83A, C89A, C94A, G107A, C115T, A126T,
T136C, T160A, A169T, T221A, A240G, G243C, T254A, A259G, G264A,
G265C, G268C, T272C, G275A, A291G, G292A, C293T, C308T, T311C,
32
Kesimpulan
Pada pertanaman lada di Bangka, Lampung dan di Jawa Barat ditemukan
penyakit keriting dan belang yang berasosiasi dengan CMV dan PYMV.
Berdasarkan hasil uji serologi, PCR, uji penularan dan pengamatan partikel virus
serta perunutan susunan nukleotida amplikon PCR membuktikan bahwa penyakit
belang pada tanaman lada di Bogor berasosiasi dengan infeksi PYMV. Uji
penularan CMV dan PYMV menunjukkan bahwa vektor F.virgata lebih efisien
menularkan PYMV dibandingkan dengan P.minor, sedangkan vektor A.gossypii
tidak berhasil menularkan kedua jenis virus tersebut.
Saran
Beberapa penelitian lanjutan tentang PYMV perlu dilakukan antara lain
yang berkaitan dengan :
1. Pembuatan antibodi monoklonal PYMV.
2. Kloning gen PYMV secara lengkap untuk mengetahui organisasi genom dan
sekuennya
3. Keragaman genetik PYMV pada beberapa lokasi pertanaman lada di
Indonesia dan penyebarannya.
34
DAFTAR PUSTAKA
Agrios GN. 1997. Plant Pathology. Edisi ke -4. New York: Academic Press.
Daniells, J., J.E. Thomas and M. Smith. 1995. Seed transmission of banana streak
virus confirmed. Infomusa 4:1-7.
Ben FA. 1988. Deteksi penyebab penyakit kerdil pada tanaman lada (piper
nigrum.L) [tesis]. Bogor: Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Blackman RL, Eastop VF. 1994. Aphids on The World’s Trees. An Identification
and Information Guide. Willingford: CAB International.
Crowther JR. 1995. ELISA Theory and Practice. Totowa : Humana Press.
Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of Plant DNA from fresh tissue. Lifr
Technical Incorporated Focus 12, 13-15.
Duarte MLR, Filho PC, Dantas MSF. 2002. Pests and diseases of black pepper in
Brazil. International Pepper News Bul. Jul-Des. Hlm 24-31.
Eng L. 2002. Viral disease and root-knot nematoda problems of black pepper
(Piper nigrum.L) in Sarawak, Malaysia. International Pepper News Bul.
Jul-Des. Hlm 39-45.
35
Ferraira SA, Bolley RA. 1992. Cucumber Mosaik Virus. http:// www.extento.
hawai. edu/kbase/crop/type/cucvir.htm. [1 Juni 2003].
Firdausil AB. 1988. Deteksi penyebab penyakit kerdil pada tanaman lada (Piper
nigrum L.) [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Gibbs AJ, Harrison BD. 1970. Cucumber mosaic virus. Di dalam : Gibbs AJ,
Harrison BD, Murant AF, editor. Description of Plant Viruses. Scotland:
Commonwealth Mycologycal Institute and Association of Applied
Biologist. Hlm 1-4.
Gumpf DJ, Bar-Joseph M, Dodds JA. 1981. Purification of citrus tristeza virus
(CTV) on sucrose-cesium sulfate cushion gradients and estimation of its
RNA size. Pathology 71:878.
Henson JM, French R. 1993. The Polimerase chain reaction and plant disease
diagnoses. Annu Rev. Pythopathol.
Hobbs HA, Reddy DVR, Rajeshwari R, Reddy AS. 1987. Use of direct antigen
coating and protein coating ELISA procedures for detection of three peanut
viruses. Plant Diseases 71: 747-749.
Hu JS, Li HP, Bany K, Wang M. 1995. Comparison of dot blot, ELISA and RT-
PCR assay for detection of two Cucumber mosaic virus isolates infecting
banana in Hawaii. Plant Diseases 79: 902-906.
Koenig R. 1981. Indirect ELISA methods for the broad specificity detection of
plant viruses. J Gen Virol. 55: 53-62.
Manohara D, Rizal M. 2002. Pest and diseases on pepper in Indonesia and their
management. International Pepper News Bul. Jul-Des. Hlm 34-39.
Matthews REF. 1970. Student Edition, Plant Virology. New York: Academic
Press.
Pares RD, Gillings MR, Gunn LV. 1992. Differentiation of biologically distinct
Cucumber mosaik virus isolates by PAGE of double-stranded RNA.
Intervirologi 34: 23-29.
Rojas ME, McLaughlin WA, Nakhla MK, Maxwell DP. 1993. Use of the
generate primers in the polymerase chain reaction to detect whitefly extract,
saliva, hemolymph, and honeydew. Phytopathol 89: 239-246
Smith KM. 1972. A Textbook of Plant Virus Diseases. London: Longman Group
Ltd.
Steere RL. 1964. Purification. Di dalam: Corbett MK, Sisler HD, editor. Plant
Virology. Gainesville: University of Florida Press. Pr. Hlm 211-234.
Sutic DD, Ford RE, Tosic MT. 1999. Handbook of Plant Virus Diseases. Boca
Raton : CRC Press.
Williams DJ, Watson GW. 1988. The Scale Insect of The Tropical South Pasific.
Part 2 : The Mealybugs (Pseudococcidae). London: CAB International
Institut of Entomology.
37
Williams DJ, de Willink MCG. 1992. Mealybugs of Central and South America.
Willingford: CAB International.
Wyatt SD, Brown JK. 1998. Detection of subgroup III geminiviruses isolates in
leaf extract by degenerate primers and polymerase chain reaction.
Pythopathol 86: 1288-1293.
LAMPIRAN