D.

Sekuensing DNA

DNA Sequencing, yaitu metode yang digunakan untuk menentukan urutan

basa nukleotida (adenine, guanine, cytosine dan thymine) pada molekul DNA (Ahsan,

2015). Sekuensing dilakukan untuk menentukan urutan nukleotida pada fragmen

DNA yang terdeteksi dari hasil visualisasi DNA yang teramplifikasi dalam proses

PCR menggunakan mesin sekuensing DNA otomatis (Fatimawali, dkk., 2011).

Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun

fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuensnya

dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Teknik ini digunakan dalam riset

dasar biologi maupun berbagai bidang terapan seperti kedokteran,

bioteknologi, forensik, dan antropologi.

Pada mulanya, sekuensing DNA dilakukan dengan mentranskripsikannya ke

dalam bentuk RNA terlebih dahulu karena metode sekuensing RNA telah ditemukan

sebelumnya. Kemajuan teknik biologi molekular dalam mengungkap sekuens biologis

dari protein (sejak awal 1950-an) dan asam nukleat (sejak 1960-an) mengawali

perkembangan basis data dan teknik analisis sekuens biologis. Basis data sekuens

protein mulai dikembangkan pada tahun 1960-an di Amerika Serikat, Pada tahun

1965, Robert Holley dan timnya dari Cornell University di New York, Amerika

Serikat, mempublikasikan sekuens tRNA alanin dari khamir yang terdiri atas 77

nukleotida. Sekuensing tRNA tersebut membutuhkan waktu 7 tahun dan hasilnya

merupakan sekuens molekul asam nukleat yang pertama kali dipublikasikan Sekuens

DNA yang pertama kali dipublikasikan adalah DNA sepanjang 12 nukleotida dari

suatu virus, yaitu bakteriofag lambda, pada tahun 1971, yang ditentukan dengan cara

serupa oleh Ray Wu dan Ellen Taylor, keduanya juga dari Cornell University.
 Basis data sekuens DNA dikembangkan pada akhir 1970-an di Amerika

Serikat dan Jerman (pada European Molecular Biology Laboratory, Laboratorium

Biologi Molekular Eropa). Penemuan teknik sekuensing DNA yang lebih cepat pada

pertengahan 1970-an menjadi landasan terjadinya ledakan jumlah sekuens DNA yang

berhasil diungkapkan pada 1980-an dan 1990-an, menjadi salah satu pembuka jalan

bagi proyek-proyek pengungkapan genom, meningkatkan kebutuhan akan

pengelolaan dan analisis sekuens, dan pada akhirnya menyebabkan lahirnya

bioinformatika. Pada tahun 1975, Frederick Sanger dan Alan Coulson dari

laboratorium biologi molekular Medical Research.

Council Inggris di Cambridge mempublikasikan metode sekuensing DNA

secara langsung yang disebut teknik plus–minus. Dengan teknik tersebut, tim mereka

berhasil melakukan sekuensing DNA sebagian besar genom bakteriofag ΦX174

sepanjang 5.375 nukleotida yang dipublikasikan pada Februari 1977. Pada bulan yang

sama, metode sekuensing DNA yang dicetuskan Allan Maxam dan Walter Gilbert

dari Harvard University di Cambridge, Massachusetts, Amerika Serikat,

dipublikasikan.

Sejak pertengahan tahun 1980-an, metode Sanger menjadi lebih umum

digunakan. Pada tahun 1986, tim Leroy Hood di California Institute of Technology

dan Applied Biosystems berhasil membuat mesin sekuensing DNA automatis

berdasarkan metode Sanger.

Prinsip Sekuensing DNA

DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction)

sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan

sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi (perbanyakan)

menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada

penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Gambar 1. Proses cycle sequencing

Yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:

1. Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua

(sepasang) seperti PCR

2. ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan

menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa.

Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA

salinan dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada

DNA cetakannya. Jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses

polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH yang

seharusnya bereaksi dengan gugus 5′-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan

posfodiester.

Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA

dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan

elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu

basa.
Gambar 2. Struktur Molekul dNTP dan ddNTP