BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi
nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938)
yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara
Pneumococcus
dan bakteri
Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negatif,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Contoh
dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas,
sedangkan bakteri gram negatif misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri
tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium sp, karena dinding
selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk
mengidentifikasinya. Pada pewarnaantersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi
sel jaringan akan berwarna hijau (James, 2002).
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula
diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah
satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu
prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari
pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan
penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram
negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan

1
Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari
satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu
mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan
menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.

1.2 Tujuan

a) Mempelajari teknik pewarnaan mikroba

b) Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri

c) Membedakan golongan bakteri gram positif dan gram negatif.

1.3 Manfaat
a) Mengetahui dan memahami teknik pewarnaan mikroba

b) Mengetahui bentuk dan struktur dari masing masing sel bakteri

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2
 Mikrobioligi adalah ilmu yang mempelajari makhluk-makhluk hidup yang kecil,
yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop (mikros= kecil, bios= hidup, dan logos=
ilmu). Makhluk hidup yang kecil ini disebut mikroba atau mikro-organisme. Bakteri
berasal dari kata latin bacterium (jamak, bacteria) , adalah kelompok raksasa dari
organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler
(bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nucleus (inti sel,
cytoskeleton, dan organel lain seperti mitoondria dan kloroplas. Istilah “bakteria”
telah diterapkan untuk semua prokariota atau kelompok besar mereka, tergantung
pada gagasan mengenai hubungan mereka. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan
dari semua organisme. Mereka tersebar (tersebar dimana-mana) di tanah, air, dan
sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak pathogen merupakan bakteri.
Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5, meski ada jenis yang
dapat mencapai 0,3 mm. Meski umumnya memiliki dinding, seperti sel tumbuhan dan
jamur, tertapi dengan komposisi yang sanngat berbeda (peptidoglikan). Banyak yang
bergerak menggunakan flagella, yang berbeda dalam strukturnya dari flagella
kelompok lain. Bakteri pertama ditemukan oleh Anthony van Leewenhoek pada tahun
1674. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-
sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana el-sel bakteri tersebut di suspensikan,. salah
satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi
ialah degan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui
serangakaian pengecatan (Entjang, 2003).
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang
yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada
sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1
sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat, batang dan

3
spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna
kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk,
susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat
berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks)

Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay,1994)
Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan
sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan
tipis yang sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba dari
pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan differensial digunakan untuk bakteri.
Menurut Hadioetomo (1991), dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen
yaitu :
 Zat warna utama (violet kristal).
 Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk
mengintensifkan warna utama.
 Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang
digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
 Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali
sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama (ungu)
terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dengan zat
warna yang berlainan, yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita
cuci dengan air lau dengan alkohol maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat
tambahan terhapus, sehingga yang tampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini
sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan
hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) jika kita katakana
gram negatif (Dwidjoseputro, 1998)

4
 Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus
dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Anonim, 2008).

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna

metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri
gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di
bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda.
Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010).

Metode-metode dalam pewarnaan gram :

5
 Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, Kristal
violet. Larutan iodine kemudian ditambahkan, semua bakteri akan diwarnai biru pada
fase ini. Sel kemudian diberi alcohol. Sel gram positif akan tetap mengikat senyawa
Kristal violet-iodine, tetap berwarna biru, sel warna negatifwarna hilang oleh alcohol.
Sebgai langkah terakhir, countersain (Mis.safranin pewarna merah) ditambahkan,
sehinnga sel gram negative yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras,
sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru. Dasar perbedaan reaksi gram
adalah struktur dinding sel.

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negative (Manurung,
2010).

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap
penisilin Lebih sensitive Lebih tahan
Penghambatan oleh
pewarna basa (VK) Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebanyakan spesies relatif
Kebutuhan nutrisi kompleks Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan

6
 perlakuan fisik

BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan di Laboraturium Terpadu I, Universitas Islam

Al-Azhar, Mataram. Waktu yang digunakan dalam praktikum ini pada hari Jumat,
tanggal, 18 Januari 2019, pukul 09.40 WITA sampai dengan 11.20 WITA.

7
3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
1. Ose
2. Bunsen
3. Cover glass
4. Objek glass
5. Mikroskop
6. Bak pewarnaan
7. Oil emersi
8. Korek api

3.2.2 Bahan
1. Media Biakan murni bakteri (S. Aureus dan E. Coli)
2. Kristal violet (Gram I)
3. Iodim (Gram II)
4. Alkohol (Gram III)
5. Salfranin (Gram IV)
6. Aquadest
7. Alkohol
8. Tissue
9. Larutan NaCl

3.3 Cara Kerja

1. Bersihkan objek glass dengan melewatkan di atas Bunsen atau lampu
spiritus beberapa kali.
2. Setelah itu teteskan sedikit saja NaCl pada objek glass.
3. Secara aseptis mengambil 1 ose biakan, letakkan di atas objek glass,
ratakan seluas ± 2 cm, kering anginkan.
4. Fiksasi di atas nyala lampu spiritus beberapa kali, sehingga sel-sel bakteri
mati.
5. Teteskan 2-3 tetes larutan Gram I pada preparat dan mendiamkan selama 1
menit.
6. Cuci dengan air mengalir sampai cat tercuci semua, kering anginkan.
7. Teteskan 2-3 tetes larutan Gram II dan mendiamkan selama 1 menit. Cuci
dengan air mengalir sampai cat tercuci semua, kering anginkan.
8. Lunturkan dengan larutan Gram III sampai lapisan tampak pucat (± 30
detik), dan langsung cuci dengan air mengalir lalu kering anginkan.

8
 9. Teteskan cat Gram IV dan biarkan selama 2 menit. Cuci dengan air
mengalir dan kering anginkan.
10. Mengeringkan bagian bawah kaca objek dengan tissue, amati di bawah
mikroskop mulai dari perbesaran lemah, sedang dan kuat.
11. Gambar dan memberi keterangan bakteri yang tampak serta
memperhatkan bentuk, warna, dan reaksi pengecetan.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Nama Bakteri Jenis Bentuk Warna Gambar
bakteri
E. Coli Gram - Batang Merah

9
Staphylococcus aurens Gram + Bulat Ungu kebiruan

4.2 Pembahasan
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di
laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi
mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan
sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan
untuk identifikasi awal.

Dari hasil pewarnaan Gram dan setelah diamati dengan bantuan mikroskop elektron
dapat diketahui bahwa :

· Esterichia coli merupakan bakteri gram negatif karena berwarna merah,

morfologinya kokobasil, dan bentuk yang cenderung ke batang panjang. Bakteri ini
ada yang soliter, namun ada juga yang tampak bergerombol atau berpasangan.
· Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu,
morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh
bergorombol sehingga tampak seperti anggur.
Untuk mengamati bakteri di bawah mikroskop, kita memerlukan pewarnaan
bakteri dengan menggunakan pewarna karena sebagian bakteri tidak berwarna.
Tujuannya adalah untuk memudahkan dalam mengidentifikasi bakteri.

10
 Ada 3 macam pewarnaan yang bisa digunakan untuk mengidentifikasi bakteri,
yaitu pewarnaan sederhana (simple stain), pewarnaan diferensial (differential stain),
dan pewarnaan khusus (special stain).Namun dalam praktikum ini kami hanya
melakukan pewarnaan sederhana dan pewarnaan diferensial yaitu pewarnaan gram.
Hal pertama yang harus dilakukan sebelum melakukan pewarnaan adalah
pembuatan preparat oles. Caranya adalah dengan membersihkan kaca objek dengan
fiksasi sehingga bebas dari lemak. Kemudian membuat sediaan preparat dalam
bentuk suspensi. Lalu memijarkan ose dan didinginkan. Setelah itu mencelupkan ose
ke dalam suspensi bakteri dan goreskan pada kaca objek. Jika bakteri yang akan
diperiksa terdapat pada medium padat(media agar), maka meneteskan NaCl
Fisiologis terlebih dahulu pada kaca preparat kemudian menggoreskan bakteri
tersebut dengan ose. Dan yang terakhir adalah mengeringkan preparat dan melakukan
fiksasi. Mengeringkan preparat dilakukan dengan mengangin anginkan pada suhu
ruang dan fiksasi dilakukan dengan cara melewatkan preparat di atas api sebanyak
tiga kali. Fiksasi dilakukan agar bakteri tetap berada di kaca preparat dan tidak
berpindah kemana-mana. Karena ada kemungkinan besar bakteri yang sudah di
fiksasi itu mati dan tetap tinggal di kaca preparat.
Setelah pembuatan preparat oles selesai, dilanjutkan dengan prosespewarnaan.
Pada pewarnaan sederhana digunakan 4 macam pewarna yaitu Kristal violet (Gram
1), iodium (Gram 2), alcohol (Gram 3), dan salfranin (Gram 4) bertujuan mewarnai
seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat
terilihat.
Pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki reaksi
yang berbeda untuk setiap bakteri sehingga digunakan untuk membedakan bakteri.
Pewarnaan gram ini mampu membedakan dua kelompok besar bakteri, yaitu Gram
positf dan Gram negatif.
Pada praktikum ini bakteri yang digunakan dalam pewarnaan gram adalah
Eschericia coli, dan St.Aureus menggunakan zat warna kristal violet, larutan iodium,
alkohol, dan safranin.

11
 Hal pertama adalah membuat preparat oles dari bakteri Eschericia coli,
dan St.Aureus. Setelah pembuatan preparat dan proses fiksasi selesai maka
dilanjutkan dengan proses pewarnaan. Zat warna pertama yang digunakan adalah
kristal ungu. Preparat diberi kristal ungu dan didiamkan selama 1 menit. Kelebihan
kristal ungu dibuang dan membilas preparat dengan air. Lalu mengeringkan dengan
tissue. Hasil yang terjadi adalah kedua bakteri menjadi berwarna ungu. Tidak ada
perbedaan antar keduanya.
Kemudian preparat ditetesi iodin yang merupakan mordant (penajam). Setelah
iodin dicuci, baik Eschericia coli, dan St.Aureus tampak berwarna ungu. Selanjutnya
preparat diberi alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna)
pada spesies bakteri tertentu. Setelah alkohol dicuci, bakteri dan St.Aureus tampak
masi berwarna ungu. Namun untuk bakteri Eschericia coli menjadi tidak berwarna.
Warna ungu nya telah hilang.
Zat warna terakhir yang diberikan adalah safranin. Safranin merupakan zat
warna basa berwarna merah. Preparat kemudian dicuci dan dikeringkan. Hasilnya
adalah bakteri St.Aureus tetap berwarna ungu sedangkan bakteri Eschericia
coli menjadi berwarna merah. Dari hasil pewarnaan gram, dapat diketahui bahwa
St.Aureus digolongkan ke dalam Gram Positif dan bakteri Eschericia
coli digolongkan ke dalam Gram Negatif.
Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan Gram negatif disebabkan
oleh adanya perbedaan struktur pada dinding sel nya. Dinding bakteri Gram positif
banyak mengandung peptidoglikan sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak
mengandung lipopolisakarida.Kompleks kristal ungu-iodin yang masuk ke dalam
dinding sel bakteri Gram positif tidak dapat dicuci oleh alkohol karena adanya lapisan
peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel; sedangkan pada bakteri Gram negatif,
alkohol akan merusak lipopolisakarida. Kompleks kristal ungu-iodin yang pada
dinding sel bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak
transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin.

12
 Untuk melihat morfologi bakteri, kita harus mengamatinya di bawah
mikroskop. Ada beberapa bentuk dasar bakteri yaitu bulat (tunggal: coccus, jamak:
cocci), batang (tunggal: bacillus, jamak: bacilli), dan spiral yaitu batang melengkung
atau melingkar-lingkar. Bentuk bulat dibedakan menjadi coccus, diplococci,
streptococci, tetrad, sarcina, dan staphylococci. Sedangkan bentuk batang dibedakan
menjadi bacillus, diplobacilli, streptobacilli, dan coccobacillus. Dan bentuk spiral
dibedakan menjadi vibrio, spirilla, dan spirochaeta.
Sebelum pengamatan dengan mikroskop, preparat di tetesi oleh oleum
emersi dahulu. Dari pengamatan yang terlihat bahwa Esterichia coli morfologinya
kokobasil, dan bentuk yang cenderung ke batang panjang. Bakteri ini ada yang
soliter, namun ada juga yang tampak bergerombol atau berpasangan.Staphylococcus
aureus morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh
bergorombol sehingga tampak seperti anggur.

BAB V
PENUTUP

5.1 KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa
pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk
membedakan antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering
digunakan untuk identifikasi dan klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri
gram positif berbeda dengan bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram
akan berbeda.

13
 Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene
blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan
yang tebal.

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna

methylene blue sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan
peptidoglikan yang tipis.

Pewarnaan struktur sel bakteri dilakukan dengan cat gram A, gram B, gram C,
dan gram D. pewarnaan endospora dengan menggunakan malakit. Bentuk sel bakteri
yang ditemukan adalah basil (Escherichia coli., Staphylococcus aereus). Bakteri yang
termasuk gram positif adalah Bacillus subtillis. dan gram negartif Eschericia coli dan
Staphylococcus aereus. Lama pewarnaan dan langkah-langkah urutan pewarnaan
harus diperhatikan.

DAFATR PUSTAKA

Cappuccino, J., G., & Natalie., S, 1983, Microbiology A Laboratory Manual,

Addison-Wesley Publishing Company : New York.

Hadiotomo, Ratna Siri., 1990, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek.

Jakarta : Pt Gramedia.

Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD.

Dwidjoseputro. Analisis Mikroba di Laboratorium . Jakarta: Raja Grafindo, 1994.

14
Pelczar & Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta : Universitas

Indonesia.

15