BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Karakteristik mikroorganisme dapat dilakukan dengan beberapa metode
seperti pengamatan mikroskopik koloni, pewarnaan mikroba untuk
mengetahui penampakan mikroskopik sel maupun membedakan golongan-
golongan mikroorganisme, serta karakteristik dengan serangkaian uji-uji
biokimia yang mencerminkan aktivitas metabolisme enzimatik
mikroorganisme. Reaksi-reaksi biokimia bagi mikroorganisme dapat
dikatakan sebagai sidik jari biokimia (biochemical fingerprints), sebagaimana
sidik jari pada manusia yang menjadi pembeda antara satu orang dengan orang
lainnya.
Satu spesies mikroba akan memiliki “sidik jari” biokimia atau karakter
biokimia idenriras yang berbeda dengan spesies mikroba lainnya. Aktivitas
metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Berdasarkan tempat
bekerjanya, bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim dan
eksoenzim. Endoenzim yaitu enzim yang berkerja dalam sel. Sistem
endoenzim selain bersifat anabolik dapat juga bersifat katabolik. Sedangkan
eksoenzim yaitu enzim yang disekresikan ke luar sel dan berdifusi kedalam
media. Sebagian besar eksoenzim bersifat hidroliktik, yang berarti bahwa
eksoenzim menguraikan molekul kompleks menjadi molekul yang molekul-
molekul yang lebih sederhana. Molekul-molekul yang lebih kecil ini
kemudian dapat memasuki sel dan digunakan untuk kepentingan sel. (Waluyo,
2004). Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari
interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia.
Kemampuan bakteri menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon
dan sumber energy yang dapat digunakan untuk identifikasi
(Backmann,2006). Identifikasi Bakteri dapat dilakukan dengan beberapa uji
antara lain uji dalam melakukan fermentasi, uji oksidase, produksi katalase,
uji motilase dan uji oksidase (Funke 2004).
Dalam mengidentifikasi suatu bakteri maka dari itu harus memperhatikan
dalam hal pengelolaan sampel yaitu cara pengambilan, penyimpanan sampai
 pwngiriman specimen. Adapun tujuan dari penangganan dan penyimpanan
sampel agar dapat memberikan hasil yang akurat dalam pemeriksaan. Maka
hal ini yang melatar belakangi penulis dalam pembuatan makalah ini agar
dapat mengetahui cara uji biokimia serta penanganan dan penyimpanan
sampel mikrobiologi.
1.2 Rumusan Masalah
1. Media apa saja yang termasuk dalam uji Biokimia ?
2. Bagaimana cara penanganan dan penyimpanan sampel mikroba ?
1.3 Tujuan Penulisam
1. Untuk mengetahui media yang termasuk dalam uji biokimia
2. Untuk mengetahui cara penanganan dan penyimpanan sampel mikroba
 BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Uji Biokimia
Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di
dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara
morfologis biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa,
tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organic yang
diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik
dan klasifikasi sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi
enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media
memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi
mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna
reagen (Murray, 2005).
Biokimia bertujuan untuk memahami bagaimana interaksi biomolekul satu
dengan lainnya membawa sifat-sifat keadaan hidup ini. Belum pernah dalam
pengamatan dalam logika molekul sel hidup, kita menemukan suatu
pelanggaran terhadap hukum-hukum fisis yang telah dikenal, seiring dengan
itu pula, kita belum pernah memerlukan pendefinisian hukum baru. Mesin
organic lunak sel hidup berfungsi di dalam kerangka hukum-hukum yang
sama yang mengatur mesin buatan manusia, akan tetapi, reaksi-reaksi kimia
dan proses pengaturan sel telah maju demikian pesat, melampaui kemampuan
kerja mesin buatan manusia (Lehninger, 1995).
Uji fisiologi biasanya identik dengan uji biokimia. Uji-uji biokimia yang
biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme
yang antara lain uji katalase, koagulase, ujinitrit, hidrolisis gelatin, uji
hidrolisis kanji, uji hidrogen sulfit dan lain-lain. Pengujian biokimia
merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam dunia mikrobiologi
(Lim, 1998)
Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri
atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah uji koagulase, uji katalase, uji
MRVP, uji nitrit, hidrolisisgelatin, uji H2S dan lain-lain. Salah satu uji yaitu
adalah uji hidrolisis urea. Uji ini sangat penting dalam identifikasi bakteri-
 bakteri pathogen penghuni usus, begitu pula uji yang lain sebenarnya
digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dengan karakter tertentu, yang
mana dengan karakter tersebut ia dapat dibedakan dengan jelas dari bakteri-
bakteri yang lain yang hidup disekitarnya (Dwidjoseputro,1994).
2.2 Macam-macam Uji Biokimia
Berikut beberapa uji Biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri
antara lain:
A. Reaksi Fermentasi Karbohidrat (Gula-gula)
Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan
oleh mikroba. Fermentasi adalah proses pengubahan senyawa
makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh
aktivitas mikrobia pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan
berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat
menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionet,
ester-ester, keton dan gas (Pelczar, 2008).
Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat
berupa karbohidrat yang selanjutnya difermentasi menghasilkan asam-
asam organic (seperti asam laktat, format, asetat), dengan disertai atau
tidak disertai pembentukan gas. Oragnisme-organisme yang berbeda akan
menggunakan karbohidrat/gula-gula yang berbeda tergantung dari
komponen enzim yang dimilikinya. Perbenihan gula-gula digunakan untuk
melihat adanya pembentukan asam yaitu dengan adanya perubahan warna
indicator (merah fenol atau biru bromtimol) yang terdapat dalam
perbenihan menjadi kuning yang sebelum ditanami berwarna merah
(indicator merah fenol) atau berwarna biru (indicator biru bromtimol) serta
untuk pembentukan gas, yaitu dengan terlihatnya udara di dalam tabung
peragian/fermentasi (tabung Durham). Degradasi fermentasi dalam kondisi
anaerob dilakukan dalam kaldu fermentasi yang mengandung tabung
durham, sebuah botol batin terbalik untuk mendeteksi produksi gas
sebagai ilustrated. media fermentasi karbohidrat yang khas mengandung :
Nutrisi bahan kaldu untuk mendukung pertumbuhan semua organisme.
 Karbohidrat tertentu yang berfungsi sebagai substrat untuk
menentukan kemampuan fermentasi organisme. Indikator pH merah fenol,
yang berwarna merah pada ph netral (7) dan perubahan kuning pada pH
sedikit asam dari 6,8 menunjukkan bahwa jumlah sedikit asam akan
menyebabkan perubahan warna. Jenis karbohidrat yang digunakan pada
uji fermentasi karbohidrat antaralain : sukrosa, laktosa, maltosa dan
manitol. Glukosa dapat langsung masuk dalam jalur fermentasi tahap
pertama sedangkan sukrosa, laktosa, manitol dan maltosa akan dihidrolisis
terlebih dahulu menjadi monosakarida penyusunnya. Laktosa dihidrolisis
menjadi galaktosa dan glukosa. Sukrosa dihidrolisis menjadi glukosa dan
fruktosa. Manitol diubah menjadi manosa atau galaktosa. Sedangkan
maltosa akan dihidrolisis menjadi dua molekul glukosa. Monosakarida
jenis manosa dan galaktosa terlebih dahulu akan diubah menjadi glukosa
melalui reaksi epimerisasi . Sedangkan fruktosa akan diubah terlebih
dahulu menjadi fruktosa 6-fosfat dan kemudian fruktosa 6-fosfat diubah
menjadi glukosa 6-fosfat. Glukosa 6-fosfat dan glukosa hasil epimerisasi
galaktosa dan manosa akan masuk dalam tahap awal proses fermentasi
untuk menghasilkan asam piruvat, asam asetat dan CO2 dan kemudian
pada tahap kedua fermentasi asam piruvat dan asam asetat direduksi
kembali oleh atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap
pertama,membentuk asam laktat dan etanol.
B. Uji Imvic (Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer, Simmon’s Citrate)
Uji Indol Media yang dipakai adalah pepton 1%. Uji indol digunakan
untuk mengetahui apakah kuman mempunyai enzim triptophanase
sehingga kuman tersebut mampu mengoksidasi asam amino triptophan
membentuk indol. Adanya indol dapat diketahui dengan penambahan
reagen Ehrlich/Kovac’s yang berisi paradimetil amino bensaldehid.
Interpretasi hasil : negatif (-) : Tidak terbentuk lapisan cincin berwarna
merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol
dari triptophan sebagai sumber karbon. Positif (+) : Terbentuk lapisan
cincin berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini
membentuk indol dari triptophan sebagai sumber karbon (Cowan, 2004).
 Gambar (1) Uji Indol
Uji MR Media yang digunakan adalah pepton glukosa phosphat. Uji
ini digunakan untuk mengetahui adanya fermentasi asam campuran
(metilen glikon). Interpretasi hasil : negatif (-) : Tidak terjadi perubahan
warna media menjadi merah setelah ditambah methyl red 1%. Positif (+) :
Terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan
methyl red 1%. Artinya bakteri menghasilkan asam campuran (metilen
glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam media MR
(Cowan, 2004).

Gambar (2) Uji MR

Uji VP Media yang dipakai adalah pepton glukosa phosphat. Uji ini
digunakan untuk mengetahui pembentukan asetil metil karbinol (asetoin)
dari hasil fermentasi glukosa. Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadi
perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan a naphtol 5%
dan KOH 40%. Positif (+) : terjadi perubahan warna media menjadi merah
setelah ditambahkan a naphtol 5% dan KOH 40%, artinya hasil akhir
fermentasi bakteri adalah asetil metil karbinol (asetoin) (Colome, 2001).
 Gambar (3) Uji VP
Uji Citrat Media yang dipakai adalah Simons citrat. Tujuan dari uji ini
adalah untuk mengetahui apakah kuman menggunakan sitrat sebagai
sumber karbon. Pada media Simons citrat berisi indikator BTB (Brom
Tymol Blue). Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon
maka media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru.
Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadinya perubahan warna media
dari hijau menjadi biru. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat
permease yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel.
Sehingga kuman tidak menggunakan citra sebagai salah satu/satu-satunya
sumber karbon. Positif (+) : terjadinya perubahan warna media dari hijau
menjadi biru, artinya kuman menggunakan citrat sebagai salah satu/satu-
satunya sumber karbon (Ratna, 2012).

Gambar (4) Uji Citrat

C. Uji Katalase
Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu
untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob,
anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. Dan digunakan unrtuk mengetahui
kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan hydrogen peroksida
dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen
manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi
bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya anti
metabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat
 mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi
sebagai : 2H2O 2H2O + O2 (Volk dan Wheeler, 1993).
Enzim merupakan katalisator sejati, dimana molekul ini meningkatkan
dengan nyata kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan
berlangsung sangat lambat. Enzim tidak dapat mengubah titik
keseimbangan reaksi yang dikatalisnya, enzim juga tidak akan habis
dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi ini. Enzim
merupakan biokatalis yang berfungsi untuk membantu proses
metabolisme. Enzim memiliki kemampuan untuk mengkatalisis suatu
reaksi. Suatu enzim adalah suatu katalis biologis. Hampir tiap rekasi
biokimia dikatalis oleh enzim.Enzim merupakan katalis yang lebih efisien
daripada kebanyakan katalis laboratorium atau industri. Enzim juga
memungkinkan suatu selektivitas pereaksi-pereaksi dan suatu
pengendalian laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelaskatalis lain.
Kespesifikan enzim disebabkan oleh bentuknya yang unik dan oleh gugus-
gugus polar (atau nonpolar) yang terdapat dalam struktur enzim tersebut.
Beberapa enzim bekerja bersama suatu kofaktor nonprotein, yang dapat
berupa senyawa organik maupun anorganik (Lehninger, 1995). Hidrolisis
Gelatin terdapatEnzim-enzim yang menguraikan golongan potein disebut
protenase/protease, keduanama ini dianggap sinonim. Contoh pada
hidrolisis gelatin dimana protein diperoleh dari hidrolisis kalogen, yaitu
zat pada jaringan penghubung dan tendon dari hewan. Gelatin akan terurai
oleh mikrobia yang mensintesis enzim proteolisis. Larutan gelatine
bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila berada di
dalam refrigerator. Dan apabila gelatin sudah dihidrolisis oleh mikroba,
maka akan tetap bersifat cair (Hadioetomo, 1993).
D. Uji Oksidase
Uji TSA (Triple Sugar Iron Agar) Tujuan dari tes ini adalah untuk
mengetahui kemampuan kuman untuk memfermentasikan karbohidrat.
Pada media TSIA berisi 3 macam karbohidrat yaitu glukosa, laktosa dan
sukrosa. Indikatornya adalah phenol red yang menyebabkan perubahan
warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. Glukosa
berada di dasar media sedangkan laktosa dan sukrosa berada di bagian
lereng. Selain menggunakan media TSIA dapat pula digunakan media KIA
(Kligers Iron Agar), bedanya adalah pada media KIA hanya berisi 2
macam karbohidrat yaitu glukosa dan laktosa. Interpretasi hasil : hanya
memfermentasi glukosa : Bila pada dasar (butt) media berwarna kuning
(bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa) Al/Ac
atau K/A. Memfermentasi semua karbohidrat : bila pada dasar (butt)
media berwarna kuning (bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna kuning
(bersifat asam) Ac/Ac atau A/A. Tidak memfermentasi semua karbohidrat
: bila pada dasar (butt) media berwarna merah (bersifat basa) dan lereng
(slant) berwarna merah (bersifat basa) ? Al/Al atau K/K. Fermentasi pada
TSIA juga disertai dengan pembentukan gas CO2 yang dapat dilihat dari
pecahnya dan terangkatnya agar. Media TSIA juga dapat digunakan untuk
mengetahui pembentukan H2 S yaitu melihat apakah kuman
memfermentasi metionin dan sistein (Asam amino yang mempunyai gugus
S). Pada media TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika
kuman memfermentasi kedua asam amino ini maka gugus S akan keluar
dan gugus S akan bergabung dengan H2O membentuk H2S. Selanjutnya
H2S bergabung dengan Fe2+ membentuk FeS berwarna hitam dan
mengendap (Buchanan, 2003).

Gambar (5) UJi TSIA

2.3 Penanganan dan Penyimpanan Sampel Mikrobiologi
Penentuan teknik penyimpanan atau pengawetan mikroba memerlukan
penelitian yang rumit, jangka waktu lama, dan pemantauan, serta dana yang
besar. Hal ini berkaitan dengan tujuan utama preservasi, yaitu
1. Mereduksi atau mengurangi laju metabolisme dari mikroorganisme
hingga sekecil mungkin dengan tetap memperta-hankan viabilitas (daya
hidupnya) dan
2. Memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh ang-ka perolehan
(recovery) dan kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-
ciri yang minimum.
Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan
secara berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke
media baru. Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak. Beberapa
teknik penyimpanan sederhana yang efektif untuk penyimpanan isolat jangka
pendek atau menengah, dan biasanya tidak sesuai untuk penyimpanan jangka
panjang. Di antara teknik tersebut ialah penyimpanan dalam minyak mineral,
parafin cair, tanah steril, air steril, manik-manik porselin, lempengan gelatin,
dan P2O5 dalam keadaan vakum. Walaupun tidak digunakan secara luas,
teknik tersebut hanya memerlukan peralatan yang sederhana dan mudah
diperoleh, sehingga dapat bermanfaat bagi lembaga yang belum memiliki
peralatan canggih.
Metode penyimpanan jangka panjang yang paling efektif dan banyak
dilakukan ialah metode liofilisasi atau kering beku (liophylization atau freeze
drying) dan kriopreser-vasi (cryopreservation atau cryoge-nic preservation).
Kedua teknik tersebut dilaporkan paling berhasil untuk penyimpanan jangka
panjang berbagai mikroba. Kendala utamanya adalah tidak semua
laboratorium mempunyai peralatan tersebut.
A. Peremajaan Berkala
Peremajaan dengan cara memindahkan atau memperbarui biakan
mikroba dari biakan lama ke medium tumbuh yang baru secara berkala,
misalnya sebulan atau dua bulan sekali. Teknik ini merupakan cara paling
tradisional yang digunakan peneliti untuk memeli-hara koleksi isolat
 mikroba di laboratorium. Cara ini juga digunakan untuk penyimpanan dan
pemeliharaan isolat mikroba yang belum diketahui cara penyimpanan
jangka panjangnya. Peremajaan berkala tidak dianjurkan untuk
penyimpanan jangka panjang. Teknik ini mempunyai berbagai kendala, di
antaranya (1) kemungkinan terjadi perubahan genetik melalui seleksi
varian, (2) peluang terjadinya kontaminasi, dan (3) terjadi kekeliruan
pemberian label. Kendala tersebut memberi peluang yang lebih besar
terjadinya kehilangan isolat dibandingkan dengan teknik lain.
B. Penyimpanan dalam Aquades Steril
Beberapa jenis bakteri, terutama yang berbentuk batang dan bereaksi
Gram negatif seperti Pseudomonas dapat disimpan cukup lama dalam
akuades steril pada suhu ruang atau suhu 10-15oC. Tidak semua bakteri
dapat disimpan dengan baik menggunakan cara ini, misalnya pada anggota
genus Pseudomonas, Agrobacterium, dan Curtobacterium. Pada kondisi
penyimpanan ini bakteri yang disimpan masih berpeluang tumbuh dengan
lambat, sehingga tidak dapat dijamin stabilitas genetiknya untuk jangka
panjang. Penyimpanan dengan cara ini juga memungkinkan terjadinya
kontaminasi. Oleh karena itu, cara ini lebih dianjurkan sebagai alternatif
penyimpanan jangka sedang atau sebagai pendamping penyimpanan
jangka panjang (De Vay dan Schnathorst, 1963; McGinnis et al., 1974).
Tahap penyimpanan mikroba dalam akuades steril adalah sebagai
berikut:
1. Akuades steril disiapkan dalam botol dengan tutup berdrat ukuran 25
ml, 5-10 ml/botol (Sly, 1983) atau dalam tabung ependorf (Machmud,
1996 tidak dipublikasi).
2. Mikroba yang akan disimpan ditumbuhkan dalam bentuk biakan murni
pada medium agar miring yang sesuai.
3. Biakan bakteri berumur 24 - 48 jam disimpan dengan beberapa cara
seperti: menambahkan 3-5 ml akuades steril ke dalam biakan miring,
mengocok tabung hingga diperoleh suspensi pekat bakteri (108-109
sel/ml), dan memindahkan 1 ml suspensi kedalam tiap botol yang berisi
air steril.
 4. Memindahkan satu ose biakan miring bakteri ke dalam tabung reaksi
berisi 3-5 ml akuades steril, tabung dikocok hingga suspensi merata,
dan memindahkan 1 ml suspensi ke dalam tiap botol yang berisi air
steril.
5. Memindahkan satu ose biakan miring bakteri langsung ke dalam tiap
botol yang berisi air steril dan mengocok hingga merata.
6. Botol ditutup rapat dan disimpan pada suhu ruang atau suhu 10-15oC.
C. Penyimpanan dalam Minyak Mineral
Memelihara biakan bakteri, khamir dan jamur adalah dengan cara
menyimpan dalam tabung agar miring dan menutup dengan minyak
mineral atau parafin cair. Dasar teknik penyimpanan ini adalah
mempertahankan viabilitas mikroba dengan mencegah pengeringan
medium, sehingga waktu pere-majaan dapat diperpanjang hingga beberapa
tahun. Beberapa jenis jamur dapat bertahan hidup sampai 20 tahun. Daya
tahan hidup mikroba lebih baik apabila biakan disim-pan pada suhu kulkas
(4o C).
Cara penyimpanan dalam minyak mineral menurut Elliot (1975)
adalah sebagai berikut:
1. Penyediaan tabung reaksi dengan tutup berdrat atau botol McCartney
berisi medium agar miring yang sesuai untuk mikroba yang akan
dipelihara.
2. Penyediaan minyak mineral atau parafin cair steril, diautoklaf pada
suhu 121oC selama 60 menit.
3. Menumbuhkan mikroba yang akan disimpan dalam tabung agar miring
selama 24-48 jam dan memeriksa kemurnian biakan untuk menghindari
kontaminasi.
4. Setelah mikroba tumbuh baik, parafin cair steril dimasukkan ke dalam
botol secukupnya, sehingga permukaan parafin atas berada 10-20 mm
di atas permukaan medium agar.
5. Botol biakan yang telah diberi parafin cair disimpan pada suhu ruang
atau di kulkas.
 6. Uji viabilitas mikroba dan pemeliharaan isolat dilakukan secara
periodik dan rutin, paling tidak setiap tahun.
Penumbuhan kembali (recovery) mikroba (bakteri, khamir) dilakukan
dengan cara mengambil secara aseptik sebagian biakan dari tabung,
memindahkan dan mensuspensikan pada medium cair. Minyak mineral
mengapung di permukaan suspensi dan sebagian suspensi digoreskan pada
medium agar yang sesuai. Biakan jamur digoreskan langsung pada
medium agar
D. Penyimpanan dalam Tanah Steril
Teknik penyimpanan mikroba pada tanah kering terutama berguna
untuk fungi, Streptomyces spp., dan bakteri yang membentuk spora seperti
Bacillus spp. dan Clostridium spp. Rhizobium spp. juga dapat disimpan
dengan baik dengan cara ini. Teknik ini mempunyai beberapa keuntungan,
yaitu biaya murah, penyimpanan pada suhu ruang, dan stabilitas genetik
mikroba dapat dipertahankan.
Cara penyimpanan dalam tanah steril adalah sebagai berikut:
1. Diambil tanah yang agak liat, dikering anginkan dan diayak untuk
memisahkan partikel tanah yang agak besar dan membuang sisa-sisa
tanaman.
2. Tanah yang sudah kering dan diayak dimasukkan ke dalam tabung atau
botol dengan tutup berdrat ukuran 25 ml hingga 1 cm dari permukaan
tutup.
3. Tabung atau botol yang berisi tanah diberi akuades steril hingga
kebasahan 50% kapasitas lapang, kemudian diautoklaf pada suhu 121 oC
tiga kali berturut- turut selama tiga hari masing- masing selama satu
jam.
4. Bilamana diperlukan, sterilitas tanah diuji dengan menumbuhkan
contoh tanah pada medium agar.
5. Selanjutnya, botol dioven kering pada suhu 105oC selama satu jam dan
setelah dingin disimpan di dalam desikator hingga digunakan.
6. Suspensi mikroba yang akan disimpan (sel, spora atau konidia, miselia)
dibuat dalam larutan steril pepton 2% dalam akuades.
 7. Suspensi mikroba (0,1 ml) diambil dengan pipet steril dan dimasukkan
ke dalam tiap botol yang telah disiapkan.
8. Botol dikembalikan ke desikator untuk disimpan di dalamnya atau
setelah kering diambil dan disimpan di ruangan.
9. Mikroba yang disimpan diuji viabilitasnya setiap tahun dengan
menumbuhkan pada medium agar.
Penumbuhan kembali bakteri dilakukan dengan cara mengambil
secara aseptik sebagian contoh tanah dari botol penyimpanan,
memindahkan ke medium cair diikuti dengan menggoreskan suspensi
medium cair pada medium agar yang sesuai atau langsung dengan
menumbuhkan contoh tanah pada medium agar.

E. Penyimpanan dengan Manik-manik Porselin

Cara sederhana lain untuk pemeliharaan berbagai jenis mikroba adalah
mengeringkan suspensi sel pada manik-manik porselin (porcelain beads)
atau gelas (glass beads) menggunakan gel silika sebagai pengering. Selapis
gel silika diletakkan di alas botol dengan tutup berdrat, kemudian di
atasnya ditutup dengan lapisan kapas atau slag wool dan di atasnya
diletakkan manik-manik porselin atau kaca yang diimpregnasi dan telah
dicelupkan dalam suspensi mikroba yang akan disimpan. Kelembaban
yang ada pada manik-manik diserap oleh gel silika yang ada di bawahnya.
Kelebihan gel silika juga berfungsi menjaga kekeringan udara di dalam
botol.
Prosedur penyimpanan dan pemeliharaan dengan manik-manik
porselin adalah sebagai berikut:
1. Gel silika (berwarna biru bila kering dan ungu bila lembab) sebanyak 3-
4 g dimasukkan ke dalam botol tutup berdrat ukuran 25 ml.
2. Di atas gel silika dilapisi kapas atau slag wool setebal 1 cm agar tidak
bergerak tetapi tetap berpori.
3. Di atas lapisan kapas diletakkan 20-50 manik-manik porselin atau gelas
yang diimpregnasi (No. 2).
4. Botol dibuka tutupnya dan disterilkan dengan oven kering suhu 160oC
selama 1-2 jam. Tutup botol karena berlapis karet disterilkan dengan
 autoklaf, suhu 121oC selama 15 menit, kemudian di oven kering dengan
suhu 100oC selama 1 jam, dan setelah dingin ditutupkan ke botolnya
secara aseptik.
5. Mikroba yang akan disimpan dibiakkan 24-48 jam dalam tabung reaksi
yang berisi 1 ml medium cair yang sesuai.
6. Manik-manik porselin dituangkan ke dalam tabung reaksi yang berisi
biakan mikroba dan kelebihan suspensi bakteri dibuang.
7. Manik-manik yang basah oleh suspensi bakteri dikembalikan ke dalam
botol dan ditutup rapat. Sebagian gel silika di dalam botol akan berubah
warna menjadi merah jambu, sedangkan sisanya tetap berwarna biru.
Apabila seluruh gel silika berubah warna menjadi merah jambu,
hendaknya botol tidak digunakan.
8. Botol yang berisi mikroba disimpan pada suhu ruang atau di kulkas.
9. Uji viabilitas bakteri dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak
setiap tahun.
F. Penyimpanan Menggunakan Lempeng Gelatin
Teknik penyimpanan ini sederhana, tetapi sangat efektif untuk
penyimpanan bakteri. Mula-mula teknik ini dilaporkan oleh Stamp pada
tahun 1947 untuk penyimpanan jangka panjang bakteri. Tetapi saat ini
sangat sedikit data tentang keefektifan penyimpanan dan daya tahan hidup
bakteri dalam penyimpanan, sehingga teknik ini perlu diuji lebih lanjut.
Penumbuhan kembali bakteri dilakukan dengan cara mengambil
secara aseptik satu lem- pengan gelatin dari botol penyimpanan,
memindahkannya ke medium cair, kemudian menggoreskan suspensi
medium cair pada medium agar yang sesuai, serta menginkubasikan pada
suhu optimal untuk pertumbuhan mikroba.
G. Penyimpanan Menggunkan Kertas Filter
Tahapan teknik penyimpanan bakteri menggunakan potongan kertas
filter menurut adalah sebagai berikut:
1. Mikroba yang akan disimpan dibiakkan pada medium yang sesuai.
2. Suspensi pekat bakteri (108-109 sel/ml) dibuat dalam larutan pepton
1%, susu skim 1%, atau Na-glutamat 1%.
 3. Bundaran kertas steril dibuat dengan alat pelubang kertas, dimasukkan
ke dalam botol kecil ukuran 10 ml dengan tutup berdrat, 25-50
bundaran kertas filter/botol. Botol disterilkan dengan oven 105oC
selama 1 jam.
4. Beberapa tetes suspensi mikroba dimasukkan secara aseptik ke dalam
botol yang berisi kertas filter hingga menjadi jenuh air.
5. Isi botol dikeringvakumkan menggunakan alat vaccum freeze dryer,
kemudian ditutup rapat dan disimpan pada suhu ruang atau di kulkas.
6. Uji viabilitas bakteri dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak
setiap tahun.
Penumbuhan kembali bakteri dilakukan dengan cara mengambil
secara aseptik satu bundaran kertas filter dari botol penyimpanan,
memindahkannya ke medium cair, menggoreskan suspensi medium cair
pada medium agar yang sesuai, serta menginkubasikan pada suhu optimal
untuk pertumbuhan mikroba.

H. Penyimpanan In Vacuo dalam Gas Fosfopentaoksida

Teknik penyimpanan ini disebut juga teknik Sordelli, karena
mulamula ditemukan oleh Sordelli. Biakan mikroba disimpan dalam
serum kuda yang ditempatkan dalam tabung gelas kecil atau ampul.
Tabung ini ditempatkan di dalam tabung lain yang lebih besar berisi
sedikit fosfopentaoksida (P2O5) dan disimpan pada suhu ruang atau di
kulkas. Teknik ini sesuai untuk penyimpanan jangka panjang bakteri,
khamir, dan jamur. Mikroba tersebut dapat bertahan hidup dengan baik
selama 5-28 tahun, tergantung pada strain mikroba yang disimpan.
I. Penyimpanan dengan Teknik Kering Beku
Teknik kering beku atau teknik liofilisasi merupakan teknik
penyimpanan yang paling populer dan banyak digunakan untuk penyim-
panan jangka panjang mikroba. Teknik ini cocok untuk menyimpan
berbagai jenis mikroorganisme termasuk virus), bakteri, khamir, jamur
berspora dan jamur yang tidak berspora, bahkan algae dan protozoa. Bagi
lembaga koleksi dan pemasok biakan mikroba, teknik ini juga sangat
sesuai, karena ampul dalam jumlah besar dapat diproduksi dan dengan
mudah disebarluaskan. Banyak biakan mikroba yang disimpan dengan
cara ini dapat bertahan hidup hingga puluhan tahun, tetapi beberapa
mikroba memerlukan media pengawet tertentu yang sesuai.
Teknik kering beku merupakan teknik yang paling rumit apabila
dibandingkan dengan beberapa teknik penyimpanan lain, karena teknik ini
memerlukan keterampilan teknis dan modal dasar yang relatif tinggi untuk
membeli peralatan pengering beku (freeze dryer). Namun, apabila
peralatan tersedia, maka teknik ini menjadi sederhana dan sangat
memuaskan. Sesung- guhnya alat pengering beku tidak selalu merupakan
alat yang canggih dan mahal, karena peralatan yang sederhana dapat
dirakit sendiri dengan mengkombinasikan pompa vakum dan kompresor
pendingin. Saat ini berbagai model alat pengering beku dijumpai di
pasaran yang harganya terjangkau oleh suatu lembaga penelitian.
Proses kering beku merupakan kombinasi dua teknik penyimpanan
jangka panjang yang paling baik, yaitu pembekuan dan pengeringan. Garis
besar tahapan proses ini meliputi pembuangan uap air dengan cara
sublimasi vakum dari status beku. Sebelum proses pengeringan, teknik ini
menggunakan salah satu dari dua cara pembekuan suspensi sel. Pada tahap
pembekuan (prefreezing), suspensi sel mikroba dapat dibekukan dengan
menambahkan campuran pendingin seperti es kering (dry ice) dalam
etanol. Alternatif lain adalah pembekuan dengan cara pembekuan
sentrifugal, di mana suspensi sel dibekukan dengan cara pendinginan dan
penguapan pada kondisi vakum, sementara ampulnya diputar dengan
kecepatan rendah untuk menghindari timbulnya buih. Selanjutnya suspensi
beku mikroba di dalam ampul dikeringkan dalam kondisi vakum. Cara ini
menghilangkan kendala yang terjadi pada pengeringan biakan dari kondisi
cair. Selanjutnya ampul kering beku dapat disimpan pada suhu ruang di
tempat gelap. Kemampuan bertahan hidup jangka panjang mikroba dapat
ditingkatkan dengan penyimpanan di kulkas.
J. Penyimpanan dengan Teknik Pengeringan Cairan
Tahapan teknik pengeringan cairan adalah sebagai berikut:
1. Ampul steril bertutup kapas dan diberi label kertas filter di dalamnya
disediakan seperti untuk penyimpanan dengan teknik kering beku.
2. Suspensi pekat biakan mikroba (108-109 sel/ml) dibuat dalam cairan
pengawet seperti larutan mist dessicant, pepton 1%, susu skim 1% atau
Na-glutamat 1%.
3. Pada tiap ampul dimasukkan 0,1-0,3 ml suspensi mikroba, tutup kapas
dipasang dan digunting, kemudian dimasukkan ke dalam ampul hingga
leher ampul atau tepat di atas label.
4. Ampul dipasang pada alat pengering beku dan dilakukan proses kering
beku. Bilamana perlu bawah ampul dicelupkan dalam air (waterbath)
25oC.
5. Sebelum ampul dipotong dianjurkan untuk memasukkan gas nitrogen
murni ke dalamnya.
6. Uji viabilitas bakteri dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak
setiap tahun.
K. Penyimpanan secara Kriogenik
Virus, bakteriofah, khamir, jamur, beberapa jenis algae, dan protozoa
dapat disimpan lama dalam kondisi beku dengan cara mereduksi sebagian
besar aktivitas atau kecepatan metabolismenya. Mikroba tersebut telah
disimpan dalam freezer yang bersuhu -20o C dan -70o C. Semakin rendah
suhu penyimpanan, semakin kecil peluang kehilangan viabilitasnya.
Penyimpanan pada suhu lebih tinggi dari -70o C sebaiknya tidak terlalu
lama dilakukan, paling lama setahun.
 BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Berdasarkan pembahasan di atas, maka dapat disimpulkan bahwa dalam
uji biokimia terdiri atas beberapa macam yaitu uji indol, uji MR, uji VP, uji
citrat, uji motilitas, uji urenase, uji TSIA, uji gula-gula. Sedangkan untuk
terdiri atas teknik penyimpanan sampel mikrobiologi yaitu penyimpanan
dalam aquadest steril, penyimpanan dalam minyak mineral, penyimpanan
dalam tanah steril, penyimpanan dengan manik-manik porselin, penyimpanan
menggunakan lempeng gelatin, penyimpanan menggunakan potongan kertas
filter, penyimpanan dengan teknik kering beku, dan penyimpanan dengan
teknik pencairan.
 DAFTAR PUSTAKA

Buchanan,RE. & Gibbons,NE.2003. Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology. The William & Wilkins Company Baltimore.USA.

Cowan,ST. 2004. Manual for the Identification of Medical Fungi. Cambridge

University Press. London

Funke BR. Tortora GJ, Case CL, 2004. Microbiology:an introduction (edisi ke-8th
ed). San Francisco: Benjamin Cummings.

Gandasoebrata R. 2004. Penuntun Laboratorium Klinik. Jakarta : Dian Rakyat.

Lim,D. 2006. Microbiology. McGraw-Hill. New York.

Machmud, Muhammad. 2001. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba.

Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor. VOL 4, NO. 1.

Misnadiarly., dan Husjain Djajaningrat. 2014. Mikrobiologi untuk Klinik dan

Laboratorium. Jakarta : Rineka Cipta.
 MAKALAH BAKTERIOLOGI III
“UJI BIOKIMIA, DAN PENANGAN DAN PENYIMPANAN
SAMPEL MIKROBIOLOGI”
Makalah ini dibuat sebagai salah satu tugas dari mata kuliah Bakteriologi III
yang di ampuh oleh ibu Nur Indah Umadji, S.Pd., M.Si

OLEH :
NAMA : DEVRIYANTI OSKAR BAU
NPM : 85AK17038
KELAS :B

PROGRAM STUDI D-III ANALIS KESEHATAN

STIKES BINA MANDIRI GORONTALO
2019
 KATA PENGANTAR
Puji syukur saya panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan
rahmat serta karunia-Nya kepada saya sehingga dapat menyelesaikan makalah ini
yang berjudul “Uji Biokimia, Penanganan dan Penyimpanan Sampel Mikrobiologi
penyusunan makalah ini merupakan salah satu tugas dari mata kuliah Bakteriologi
III.
Saya menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu
kritik dan saran dari semua pihak yang bersifat membangun selalu diharapkan,
penulis berharap semoga makalah ini bisa berguna bagi yang lain juga.
Sekian dari saya hanya itu yang dapat kami sampaikan mohon maaf bila ada
salah penulisan, wassalamualaikum warahmatullahi wabarakatu.

Gorontalo, Maret 2019

Penulis
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .......................................................................................i

DAFTAR ISI ......................................................................................................ii
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang .....................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................2
1.3 Tujuan Penulisan .................................................................................2
BAB II PEMBAHASAN
2.1 Uji Biokimia ........................................................................................3
2.2 Macam-macam Uji Biokimia ..............................................................4
2.3 Penanganan dan Penyimpanan Sampel Mikrobiologi .........................10
BAB III PENUTUP
3.1 Kesimpulan ..........................................................................................12
DAFTAR PUSTAKA