NEW RESEARCH IN COSMECEUTICALS

TEKNOLOGI GENE ARRAY DAN PENCARIAN AKTUAL

COSMECEUTICAL

Jumlah produk cosmeceutical di pasaran yang mengklaim berbagai efek

menguntungkan pada struktur dan fungsi kulit berkembang pesat dengan
perkenalan produk baru yang hampir terjadi setiap hari. Produk yang mengklaim
efektivitas dalam merangsang produksi kolagen dan elastin, menghalangi aktivitas
metaloproteinase matriks, dan memperlambat proses penuaan tersedia secara luas
dan sebagian besar mengiklankan bahwa 'penelitian ilmiah' ada di belakang
perkembangannya. Pada kenyataannya, beberapa bahan dalam produk kosmetik
telah ditunjukkan, dengan analisis laboratorium yang ketat, memiliki efek antiaging
yang spesifik. Catatan-pengecualian yang layak adalah asam retinoat dan
turunannya, vitamin C, dan Matrixyl (palmitoyl-L-lysyl-L-threonyl-L-threonyl-L-
lysyl-L-serine), yang merupakan tiga senyawa dimana data ilmiah yang kredibel
ada Untuk mendukung klaim anti penuaan. Pengembangan cosmeceuticals yang
benar-benar berkhasiat meliputi:

1) Penggunaan program skrining berbasis sel dan molekuler berbasis biologi

untuk mengidentifikasi senyawa aktif dengan aktivitas biologis yang
diinginkan (misalnya stimulasi gen kolagen I, III, atau VII).
2) Penerapan program skrining ini untuk menentukan bahwa bahan 'aktif' yang
diidentifikasi tidak juga menghasilkan efek biologis yang tidak diinginkan
pada sel kulit, mis. Merangsang aktivitas protein matrik metaloproteinase 1
(MMP-1).
3) Perkembangan formulasi topikal yang dapat ditunjukkan dengan analisis
penyerapan perkutan kulit untuk menghasilkan jumlah yang cukup dari
bahan 'aktif' di stratum korneum dan turun ke sel target untuk mencapai efek
biologis yang dibutuhkan.
4) Penggunaan studi klinis double blind dan terkontrol plasebo dengan jumlah
pasien yang cukup untuk menghasilkan data statistik yang signifikan
mengenai keefektifan produk.
 Karena langkah pertama dalam mengembangkan produk cosmeceutical
yang efektif adalah untuk menunjukkan bahwa bahan 'aktif' yang bersifat putatif
tidak hanya menghasilkan tindakan biologis yang diinginkan tetapi juga tidak
memiliki efek merusak pada struktur atau fungsi kulit, akan lebih menguntungkan
jika memiliki akses ke Alat skrining biologis tunggal yang bisa menyelesaikan
kedua kebutuhan secara simultan. Metode penyaringan semacam itu
memungkinkan seseorang untuk memprediksi keefektifan senyawa sebelum
melakukan pengembangan formulasi yang sulit dan sebelum melakukan studi klinis
yang mahal. Penggunaan teknologi gene array memenuhi persyaratan ini.

PRINSIP DASAR ANALISIS ARRAY GEN

Semua sel dalam tubuh terus menghasilkan sekumpulan protein spesifik

yang mendefinisikan struktur dan fungsi dari tipe sel tertentu. Sebagai contoh, sel
hati menghasilkan reseptor hormon unik untuk glukagon dan insulin, sementara sel
ginjal menghasilkan protein untuk reseptor vasopresin dan bagi mereka yang
terlibat dalam pengangkutan ion. Protein ini dikodekan oleh gen yang menghasilkan
mRNA unik dan, dengan demikian, setiap jenis sel mengekspresikan 'jejak' unik
dari mRNA ini. Dalam kondisi tertentu seperti radiasi ultraviolet (UVR), pengaruh
hormon, dan penuaan, profil ekspresi mRNA ini berubah seperti protein yang
dikodekan oleh 'utusan' ini. Jadi, misalnya, pada kulit muda, fibroblas dermal
mengekspresikan mRNA untuk protein kolagen I, III, dan VII, sedangkan pada kulit
usia fibroblas menghasilkan lebih sedikit mRNA untuk kolagen tetapi lebih banyak
mRNA untuk enzim MMP-1 (matriks metaloproteinase 1; Kolagenase 1) yang
menghancurkan kolagen. Dengan munculnya susunan gen biologi molekuler
modern, sekarang mungkin untuk mengisolasi 'kolam' mRNA dari sel yang
mengekspresikan fenotipe yang berbeda (misalnya fibroblas manusia muda dan tua)
dan, dari analisis mRNA ini, tentukan gen mana yang sedang diekspresikan. Atau
ditekan pada jenis sel yang berbeda atau pada sel yang terpapar pada kondisi yang
berbeda.

Gene array adalah filter atau slide kaca yang terikat potongan kecil yang
diketahui dan tidak diketahui (EST-expression sequence tags) gen manusia. Aliran
gen nilon tipikal filter mungkin mengandung lebih dari 5000 urutan gen yang
berbeda pada satu filter dan beberapa susunan telah dirancang dengan jaringan atau
penyakit tertentu. Misalnya, filter gen telah dirancang agar gen spesifik kulit lebih
dari 4000 'diikatkan, memungkinkan seseorang menilai efek pengubah biologis
seperti hormon, sitokin, dan UVR pada ekspresi gen yang penting pada kulit.

MASA DEPAN COSMECEUTICALS DERMATOLOGIS

Seiring pertumbuhan populasi yang menua dan pilihan cosmeceuticals

menjadi semakin berbeda, komposisi kosmetik sangat penting di bidang
antipenuaan. Tetapi sangat penting bahwa kekuatan di balik garis perawatan kulit
inovatif bersifat klinis dan ilmiah. Generasi baru cosmeceuticals ini berfokus pada
perlindungan sel dari kekuatan lingkungan dan genetik.

ANTIOXIDANTS

Kulit kita terus-menerus terpapar tekanan oksidatif yang menyebabkan

penuaan dipercepat dengan merusak DNA, lipid, dan protein. Berbagai sistem
antioksidan endogen dirancang untuk melindungi kita dari tekanan oksidatif ini.
Stres oksidatif berasal dari banyak sumber termasuk genetika, faktor lingkungan,
dan radiasi ultraviolet (UV). Mekanisme aksi antioksidan dalam induksi adalah
sedemikian rupa sehingga mencegah radikal bebas membentuk reaksi berantai yang
memiliki kemampuan merusak sel selama oksidasi molekul lainnya. Antioksidan
terdiri dari berbagai molekul seperti alpha lipoic acid (ALA), koenzim Q-10,
polifenol, idebenon, kinetin, dan vitamin A, B, C, dan E. Antioksidan banyak
digunakan sebagai perawatan pada banyak penyakit manusia dan sekarang Menjadi
sumber vital dalam cosmeceuticals karena efek fotoprotektif yang kuat, sehingga
mengakibatkan reduksi eritema, pembentukan sel sunburn, perubahan DNA, dan
karsinogenesis.
 Gambar 1. Teori penuaan radikal bebas

POLYPHENOLS

Polifenol adalah kelompok zat kimia dengan struktur kimia yang beragam
dan kompleks yang ditemukan pada tanaman. Flavonoid adalah satu subkelompok
polifenol, termasuk ekstrak biji anggur dan isoflavon kedelai. Flavonoid ditemukan
dalam berbagai jenis makanan, sehingga diet tinggi fitokimia beserta aplikasi
topikal dapat melindungi kulit dari stres endogen dan eksogen. Hal ini diyakini
bahwa polifenol tidak hanya melindungi sel dari kerusakan lebih lanjut tetapi juga
meningkatkan kebangkitan sel. Sebuah penelitian dilakukan untuk mengukur
tingkat efektivitas polifenol pada kerusakan kulit UV. Epigallocatechin-3-gallate
(EGCG), salah satu komponen utama teh hijau, telah dilaporkan memiliki efek
anticarcinogenic pada kulit saat terkena radiasi UV. Dalam satu penelitian, tikus
terkena UVB dua kali seminggu selama 20 minggu (dosis radiasi antara 280 dan
375 nm). Beberapa tikus kemudian diberi perlakuan topikal dengan EGCG (3,0 mg,
6,5 μmol) lima hari seminggu selama 18 minggu. Beberapa tikus diobati dengan
kafein. Pembentukan tumor diukur. Kelompok kontrol, yang terpapar UVB namun
tidak diobati dengan apapun, mengembangkan rata-rata 4,5 tumor per tikus setelah
12 minggu. Kelompok yang diobati dengan kafein mengembangkan 1,3 tumor per
tikus dan kelompok yang diobati dengan EGCG mengembangkan 0,8 tumor per
tikus. Setelah 18 minggu, kelompok kontrol mengembangkan 6,9 tumor sementara
kelompok kafein dan EGCG masing-masing mengembangkan 3,6 dan 2,5 tumor.

GENISTEIN

Genistein adalah isoflavon kedelai yang pertama kali diisolasi dari kacang
kedelai pada tahun 1931. Ini adalah antioksidan kuat dengan inhibitor spesifik
protein tirosin, kinase, dan fitoestrogen, meningkatkan ketebalan kulit melalui efek
estrogenik. Telah ditemukan bahwa ia menunjukkan sifat yang mencegah hemolisis
sel darah merah dengan asam dialurat atau H2O2 dan menghambat peroksidasi lipid
mikrosomal yang diinduksi oleh kompleks Fe2 + -ADP dan NAPDH. Ini adalah
penghambat yang paling potensial dari aktivasi p450-mediator benzo [a] pyrene di
antara semua isoflavon.

Beberapa penelitian selama dekade terakhir telah memberi dukungan pada

keyakinan bahwa bahan alami ini memiliki efek pencegahan dan penyembuhan
pada kanker payudara dan prostat, osteoporosis, penyakit kardiovaskular (pada
manusia dan hewan), dan sindrom pascamenopause. Genistein memiliki efek
signifikan dalam hal penghambatan karsinogenesis kimiawi, karsinogenesis kulit
akibat sinar UV dan kerusakan foto pada manusia dan tikus.

Meskipun banyak penelitian in vitro telah menunjukkan potensinya dalam

sifat antikanker, bukti kurang berpengaruh pada karsinogenesis kulit, namun ada
dukungan ilmiah untuk potensinya. Genistein telah ditemukan memiliki
kemopreventif dan aktivitas antikanker yang kuat. Telah ditunjukkan untuk
menghambat aktivitas tirosin protein kinase (TPK), topoisomerase II (Topo II), dan
ribsomal S6 kinase (RS6K) dalam kultur sel. Hal ini juga telah terbukti
menghambat pertumbuhan ras onkogen dan menurunkan fraksi c-fos dan c-jun
yang dikuatkan oleh PD6F pada fibroblas. Percobaan dilakukan untuk
membuktikan bahwa genistein secara substansial menghambat kerusakan kulit
kasar subakut dan kronis UVB dan PUVA.
Tabel 1. Efek klinis genistein
Pencegahan dan efek terapeutik pada hewan dan manusia berikut ini:
Kanker payudara
Kanker prostat
Sindrom postmenopause
Osteoporosis
Penyakit kardiovaskular
Image Menghambat karsinogenesis karsinogen kimia dan karsinogen sinar UV,
photoaging, dan photodamage
Image Menghambat pembentukan tumor kulit pasca radiasi UVB
Gambar 2. Efek genistein pada luka bakar akut yang disebabkan UVB
pada tikus
Gambar 3. (A-C) Pengaruh genistein terhadap perubahan histologis pada tikus
yang terpapar UVB
 ASAM FOLAT DAN BIONIK: ASAM HIDROKSI GENERASI
BERIKUTNYA

Asam polihidroksi (PHA) dan asam bimik polihidroksi (bionik) mewakili

generasi berikutnya dari asam alfa hidroksi (AHA) untuk digunakan dalam
perawatan kulit kosmetik dan dermatologis. Secara struktural mirip dengan AHA
tradisional, asam polihidroksi dan bionik adalah bagian dari keluarga molekul
AHA; PHA adalah AHA yang mengandung beberapa gugus hidroksil pada
molekul, dan bionik adalah PHA dengan molekul gula tambahan yang menempel
pada struktur PHA. PHAs dan bionik memberikan efek antipenuaan dan efek
perampingan kulit secara klinis yang sebanding dengan AHA, sekaligus
menawarkan beberapa keuntungan terapeutik. Mereka kurang menjengkelkan
terhadap kulit dibandingkan dengan AHA, dan menyebabkan kurang menyengat
dan terbakar. Dengan demikian, PHA kompatibel dengan jenis kulit yang sensitif
secara klinis termasuk pasien yang didiagnosis dengan dermatitis atopik dan
rosacea. PHAs juga meningkatkan penghalang kulit, sebuah manfaat penting bagi
orang dengan kondisi kulit yang terganggu. Selain itu, molekul ini berfungsi
sebagai humektan dan pelembab, serta memberikan efek khasiat antioksidan karena
struktur polihidroksinya. PHA memberikan efek pemulungan radikal bebas, dan
tidak meningkatkan sensitivitas kulit terhadap sinar matahari. Bionik memiliki
manfaat tambahan dari enzim penghambat matriks metaloproteinase (MMP), yang
memberikan efek pencegahan antipenuaan. Beberapa manfaat kulit telah terbukti
untuk PHA dan bionik, menjadikannya bahan ideal untuk digunakan dalam
dermatologi saja atau dikombinasikan dengan agen kosmeceiter dan kosmetika
pelengkap lainnya dan / atau prosedur kosmetik.

• Struktur PHA dan bionik

Asam polihidroksi dan asam bionat adalah asam karboksilat organik, yang
memiliki dua atau lebih gugus hidroksil pada struktur molekul alifatik atau alisiklik.
Bila salah satu gugus hidroksil terjadi pada posisi alfa, PHA adalah AHA
polihidroksi. 33.1; Bila gula tambahan melekat pada struktur PHA, molekulnya
adalah asam bionik (Gambar 33.1). Karena mereka memiliki struktur AHA yang
umum, PHA dan bionik memiliki kemampuan untuk memberikan efek kulit yang
serupa dengan AHA tradisional, seperti asam glikolat.

Gambar 4. PHAs: gluconolactone dan asam laktobionat

GLUCONOLACTONE: Sebuah PHA REPRESENTATIF

Gluconolactone (gluconic acid delta lactone) adalah komponen kulit yang

tidak beracun dan alami. Ukuran molekul yang agak lebih besar (berat molekul 178
vs 76 untuk asam glikolat) memudahkan penetrasi bertahap ke dalam kulit,
sehingga meminimalkan iritasi. Molekul asam glikolat yang lebih kecil menembus
kulit lebih cepat, sering menyebabkan rasa sakit dan terbakar. Potensi
Gluconolactone untuk peningkatan hidrasi dikaitkan dengan sifat humektan dari
gugus hidroksil multipel, yang dapat menarik dan ikatan hidrogen air. 33.2.
 Gambar 5. Sifat pengikatan air dari PHA

• Antioksidan dan efek pemulungan radikal bebas gluconolactone

Sifat antioksidan gluconolactone terbukti dalam makanan dan zat obat, di

mana gluconolactone telah terbukti menghambat oksidasi dan membantu menjaga
integritas produk.
 Gambar 6. Efek antioksidan dari PHA: gluconolactone dan asam
laktobionat menghambat penggelapan oksidatif anthralin dan hydroquinone
oksidatif dan mencegah penggandaan oksidatif kulit pisang yang terpapar pada
kondisi sekitar. Foto menunjukkan proses penyaringan

Bernstein dkk menunjukkan bahwa gluconolactone memberikan efek

pemulungan radikal bebas yang sebanding dengan senyawa terkenal lainnya seperti
asam askorbat dan tokoferol alfa-a menggunakan model in vitro dari fotoaging
kulit. Dalam model ini, senyawa diukur untuk kemampuan mereka mencegah
ultraviolet (UV) menginduksi aktivasi promotor elastin di kulit melalui aktivitas
pemulungan radikal bebas. Peningkatan ekspresi promoter elastin menyebabkan
pengendapan abnormal bahan elastis yang tidak terstruktur dengan baik pada kulit
- kondisi yang dikenal sebagai elastosis matahari. Perlindungan maksimal oleh
pemulung radikal bebas terjadi pada tingkat sekitar 50%; 50% lainnya disebabkan
oleh kerusakan UV langsung pada sel dan DNA seluler. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa gluconolactone memberikan perlindungan hingga 50%
terhadap radiasi UV. Efek ini tidak dapat dijelaskan dengan skrining UV, dan oleh
karena itu dikaitkan dengan kemampuan gluconolactone untuk mengkelat logam
pengoksidasi-oksidasi yang mungkin melalui efek pemulungan radikal bebas bebas
gluconolactone.

• Efek klinis gluconolactone

Studi klinis in vivo dari formulasi yang mengandung gluconolactone telah

menunjukkan manfaat terukur termasuk efek antipenuaan dan pengencangan kulit
yang sebanding dengan AHA yang umum digunakan (misalnya asam glikolat),
dengan potensi iritasi yang berkurang. Selain itu, manfaat antipenuaan yang
signifikan termasuk pigmentasi yang berkurang dan tekstur kulit yang membaik
telah diamati pada rentang jenis kulit Fitzpatrick yang lebih gelap (IV-VI) yang
ditunjukkan oleh populasi penelitian orang Afrika-Amerika, Asia, dan Hispanik.

Gluconolactone sangat sesuai untuk penggunaan tambahan dengan obat

topikal. Ini meningkatkan perputaran sel epidermis, yang sebagian membantu
menjelaskan manfaat tambahan PHAs dalam perawatan jerawat. Studi klinis
double-blind yang dikendalikan kendaraan pada jerawat ringan sampai sedang
menunjukkan efek anti-jerawat dengan sedikit iritasi larutan gluconolactone 14%
jika dibandingkan dengan lotion peroksida benzoyl 5%. Selain itu, PHA dapat
digunakan untuk menghidrasi dan mengkondisikan kulit selama perawatan dengan
obat pengeringan atau pengiritasi termasuk retinoid topikal, benzoyl peroxide, dan
asam azelaic. Manfaat ini ditunjukkan dalam studi klinis yang dirancang untuk
mengevaluasi efek penggunaan alat pembersih PHA standar ditambah pelembab
PHA yang dikombinasikan dengan gel asam azelaic 15% untuk pengobatan
rosacea. Hasil menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam penilaian global
dan eritema yang relatif terhadap kelompok perlakuan asam azelaic yang belum
distandarisasi dengan PHAS adjunctive (P <0,05). Kompatibilitas krim 15
mengandung gluconolactone 15 (pH 3,3) yang dikombinasikan dengan penggunaan
harian gel tretinoin 0,1% juga telah ditunjukkan.
 PERBAIKAN DNA

DNA adalah operator utama sel kulit. Mengumpulkan bukti menunjukkan

bahwa kerusakan DNA adalah penyebab utama efek akut dari paparan sinar
matahari, serta kondisi kronis penuaan dan photoaging. Sementara sistem perbaikan
alami kami menawarkan perlindungan yang signifikan, bahan baru memasuki pasar
cosmeceutical menawarkan janji untuk memperbaiki perbaikan DNA. Bab ini akan
memeriksa metode dan bukti untuk mendukung klaim ini.

SUMBER KERUSAKAN DNA

Kerusakan DNA berasal dari dua sumber: metabolisme intrinsik sel dan
penghinaan lingkungan.

• Metabolisme intrinsik

Selama pembangkit energi aerobik sekitar 2% dari semua oksigen yang

terbakar berakhir sebagai spesies oksigen reaktif (ROS). Kerusakan DNA ini paling
sering dilakukan dengan mengoksidasi dasar guanin menjadi 8-okso-guanin
(8oGua), yang sering salah dibaca oleh mesin replikasi DNA yang menyebabkan
perubahan urutan untaian progeni, yang mengakibatkan mutasi. Ini sangat serius
untuk DNA mitokondria, yang paling dekat dengan sumber ROS berumur pendek.
Daerah penelitian yang terungkap adalah peran DNA mitokondria pada penyakit
kronis penuaan.

• Menghina lingkungan

Sejauh ini kerusakan paling parah pada DNA kulit berasal dari sinar
matahari. Radiasi ultraviolet matahari (UV) juga menyebabkan pembentukan ROS
yang menghasilkan 8oGua. Pada mitokondria, dosis UVA yang berulang
menghasilkan akumulasi mutasi delesi karakteristik pada DNA mitokondria.
Frekuensi mutasi karakteristik ini pada kulit manusia meningkat dengan paparan
sinar matahari, menunjukkan bahwa ini adalah dosimeter internal untuk paparan
sinar matahari kumulatif. Tapi 10 kali lebih sering daripada 8oGua adalah redam
pirimidin dimer (CPD), yang merupakan kerusakan DNA yang disebabkan oleh
penyerapan langsung foton UV tanpa perantara ROS. UV menyebabkan dua basis
DNA yang berdekatan saling menyatu dalam cincin siklobutane, dalam reaksi
fotokimia yang memakan waktu sekitar 15 picoseconds; Antioksidan tidak bisa
menghentikannya karena tidak ada radikal bebas yang terlibat. Tipe kedua dari fusi
dasar, yang disebut produk photopodel 6-4, juga terbentuk sekitar seperenam
sesering CPD. Karena basis yang menyatu ini mendistorsi DNA lebih dari 8oGua,
mereka jauh lebih mutagenik daripada 8oGua, dan akibatnya lebih bersifat
karsinogenik. CPD menyebabkan tipe karakteristik mutasi DNA, dan mutasi tanda
tangan ini sering ditemukan pada gen kanker kunci pada karsinoma sel skuamosa
dan basal. Ini adalah senjata merokok yang menghubungkan CPD dengan kanker
kulit.

Lkylation adalah jenis ketiga dari kerusakan DNA dimana gugus alkil
ditambahkan ke DNA. Penambahan yang paling umum ada pada posisi 7 guanin
(N7meGua) dan fosfat tulang punggung DNA, namun bentuk kerusakan yang jauh
lebih umum - alkilasi dari 6 posisi guanin (O6meGua) - adalah yang paling
mutagenik dan karenanya paling berbahaya. Jenis kerusakan ini biasanya
disebabkan oleh racun, seperti dari beberapa bahan kimia dalam asap rokok, dan
oleh obat-obatan terlarang. Tanda penuaan dini pada kulit yang disebabkan oleh
merokok dapat dikaitkan dengan kerusakan alkilasi dari agen alkilasi pada asap
rokok yang diangkut melalui peredaran ke kulit. Selain itu, paparan zat kimia lain
melalui paparan polusi industri dan obat-obatan dengan potensi alkilasi DNA
mungkin memiliki beberapa peran dalam apa yang telah dianggap sebagai penuaan
kulit normal.

PERBAIKAN DNA

Karena kerusakan DNA terus-menerus, sistem perbaikan DNA ditemukan

di semua organisme untuk membalik atau menghilangkan basa yang berubah ini.
Banyak tanaman dan hewan (tapi bukan manusia) memiliki enzim yang disebut
photolyase yang mampu menyerap cahaya tampak dan menggunakan energi untuk
memisahkan secara langsung basa yang menyatu dalam produk kelas CPD atau 6-
4, mengembalikan urutan DNA asli. Manusia bergantung pada kompleks enzim
perbaikan DNA yang mengenali distorsi pada DNA, seperti yang disebabkan oleh
CPD atau 8oGua, dan menghilangkannya dengan memotong satu untai DNA.
Enzim khusus yang disebut endonuklease (misalnya endonuklease T4,
endonuklease UV) secara khusus hanya menargetkan CPD dan glikosilase OGG1
yang mengikat hanya untuk 8oGua. Begitu basis yang rusak telah dilepas, celah
DNA dipulihkan dengan menambahkan basis yang tidak rusak, menggunakan untai
yang berlawanan sebagai tempelan.

O6meGua dalam DNA diperbaiki dengan cara yang mengejutkan oleh

enzim perbaikan DNA alkilguanine transferase (AGT) yang sebenarnya
menghilangkan gugus alkil dari DNA dan memindahkannya ke residu sistein dari
enzim, tanpa menghilangkan basis DNA apapun.

MENGUKUR PERBAIKAN DNA

Perbaikan DNA adalah proses multistep dan tidak ada satu pun pengujian
yang mengukur semua aspeknya. Yang lebih penting lagi, kesimpulan yang keliru
kadang-kadang diambil dari penggunaan uji yang salah untuk mengukur perbaikan.

1. Perbaikan DNA diukur dengan tes comet

Uji komet (elektroforesis gel sel tunggal) adalah metode sederhana
dan sensitif untuk mengukur DNA SBs. Sel tertanam di agarosa pada slide
mikroskop, dilisis, dan elektroforesis. DNA patah ditarik ke arah anoda,
membentuk 'ekor komet'; Itu diwarnai dengan pewarna pengikatan DNA
dan diamati dengan mikroskop fluoresensi (Gambar 1a). Pengujian
bergantung pada fakta bahwa DNA di nukleus mamalia disusun sebagai
rangkaian loop DNA, yang melekat pada kerangka nuklir, atau matriks,
pada interval. DNA adalah (negatif) supercoiled, berdasarkan
pengaturannya sebagai nukleosom, dan setiap loop superkoilena harus
dianggap sebagai unit struktural. Lisis sel dengan deterjen dan garam tinggi
(menghilangkan membran, komponen sel terlarut dan sebagian besar
histon), membuat DNA tetap menempel pada matriks, dan dikenal sebagai
nukleoid; Supercoiling masih ada, dan saat supercoiling ini rileks oleh DNA
SB, hanya lingkaran yang berisi jeda yang terpengaruh. Uji ini dapat
dilakukan pada pH 'netral' (sekitar 10 - tidak cukup tinggi untuk
menandakan DNA [Ostling & Johanson, 1984] atau pada pH tinggi di atas
pH 13 [Singh et al., 1988]). Kedua versi netral dan alkali mendeteksi SSB,
karena satu SB cukup untuk mengendurkan supercoiling. Pengujian tidak
tergantung pada denaturasi alkali untuk mengungkapkan SSB (tidak seperti
pengujian lainnya seperti elusi netral / basa, dan pembilasan alkali), namun
analogi yang tampak telah menyebabkan banyak kebingungan, dan sering
dinyatakan bahwa uji netral hanya mendeteksi DSB. Uji komet netral dan
alkali memang berbeda dalam satu hal penting; Pada pH tinggi, APsites
diubah menjadi istirahat
Semakin banyak istirahat yang ada, semakin banyak loop yang
rileks, dan semakin kuat adalah fluoresensi dari ekor komet yang relatif
terhadap inti nukleoid ketika nukleoid diwarnai dengan pewarna pengikatan
DNA yang sesuai. Komet (biasanya 30 sampai 100 per gel) dinilai, paling
umum, dengan analisis citra berbasis komputer, dengan 'DNA ekor ekor'
sebagai parameter pilihan, walaupun teknik 'teknik penilaian visual
alternatif' masih banyak digunakan (Collins, 2004) . Untuk analisis statistik,
unit analisis adalah rata-rata atau median% tail DNA dari komet yang
mewakili satu sampel independen sel. DNA ekor dapat dikonversi menjadi
unit 'nyata' seperti jeda per 109 Da dengan menggunakan kurva kalibrasi,
berdasarkan penyinaran γ atau X-sel, karena tingkat kerusakan per Gy
diketahui.
Uji komet dapat diterapkan pada hampir semua jenis sel eukariotik
yang dapat diperoleh sebagai sel tunggal atau suspensi nuklir. Kultur sel dan
sel darah putih banyak digunakan, namun juga metode telah dikembangkan
untuk memisahkan beberapa jenis jaringan tanpa menyebabkan kerusakan
pada DNA sel. Sperma, dengan DNA yang sangat padat, dapat dikenai
analisis komet setelah diobati dengan protease atau dithiothreitol. Strategi
yang paling sering diadopsi dengan sel tumbuhan adalah melepaskan nuklei
hanya dengan memotong jaringan tanaman dengan pisau tajam. Adanya
kloroplas pada jaringan daun dapat menyebabkan pelepasan radikal bebas
dan kerusakan oksidatif pada DNA kecuali isolasi dilakukan di bawah
kondisi safelight.
Uji komet dasar terbatas pada kegunaannya karena hanya untai
terputus (dan situs alkalilabil) terdeteksi. Langkah tambahan - pencernaan
DNA nukleoid, setelah lisis, dengan enzim spesifik lesi - mengubah
berbagai jenis kerusakan DNA pada pemecahan DNA (Gambar 1b). Jadi
formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) mengenali purin
teroksidasi, terutama 8-oxoguanine (8-oxoG), tetapi juga purin yang dibuka
dengan cincin atau formamidoprimidin (dan sebagai tambahan beberapa
basa teralkilasi). Endonuclease III (EndoIII) mengubah pirimidin
teroksidasi menjadi istirahat, sementara DNA-glikosilase 3-methyladenine
(AlkA) bekerja pada basis teralkilasi (terutama 3-methyladenine).
Emulpirin pirimidin yang diinduksi sinar UV terdeteksi oleh endonuklease
UV, endonukleaseV T4 (T4endoV).
 Gambar 7. Skema uji komet standar (a), dan uji dimodifikasi termasuk
pencernaan dengan enzim spesifik lesi (b)

Kondisi perawatan dapat bervariasi tergantung pada jenis sel, dan

dianjurkan terlebih dahulu untuk menetapkan kondisi optimal; Lesi induksi
tingkat tinggi, tapi tidak cukup untuk memenuhi uji atau kapasitas sel untuk
memperbaiki kerusakan tanpa memasuki apoptosis.

Setelah sel perawatan diinkubasi dalam medium dan kondisi kultur

sel yang sesuai (biasanya dalam inkubator pada suhu 37 ° C dengan 5%
CO2) untuk waktu yang berbeda. Tepat setelah perawatan (waktu 0), sebuah
aliquot sel diambil untuk memeriksa tingkat kerusakan yang diinduksi.
Aliquot lebih lanjut diambil pada waktu inkubasi yang berbeda, termasuk
waktu segera setelah dimulainya inkubasi untuk memperkirakan tingkat
awal perbaikan secara akurat.
 Untuk menghindari perbaikan kerusakan DNA saat memproses sel
setelah pengambilan sampel pada titik waktu yang berbeda, sel harus tetap
berada di atas es selama manipulasi mereka. Hal ini sangat penting saat
interval waktu yang sangat singkat diuji.

Apa yang menyebabkan jeda dalam DNA? UV sendiri tidak secara

langsung memotong DNA, jadi komet yang terbentuk setelah UV
merefleksikan perbaikan DNA yang sedang berjalan, yang merupakan
langkah awal pengenalan jeda pada untai ganda. Bahan kosmetik yang
mengurangi komet setelah UV dapat merugikan dengan menghambat
perbaikan DNA. Radiasi pengion dan radikal bebas, di sisi lain, secara
langsung menghasilkan pemecahan DNA, jadi bahan kosmeceutikal yang
mengurangi komet setelah perawatan ini mungkin bermanfaat. Oleh karena
itu, pengujian komet saja tidak membuktikan bahwa perbaikan DNA
meningkat atau terhambat.

Gambar 8. komet dengan berbagai tingkat kerusakan DNA.

Uji komet dilakukan seperti yang dijelaskan di atas; Baik versi dasar
(untuk menilai SSB bergabung kembali) atau dengan enzim pencernaan
(untuk menilai BER atau APL). Langkah lisis uji komet dapat berlangsung
antara 1 jam dan 24 jam (atau bahkan lebih lama) sehingga sel / sel tertanam
 sel dapat disimpan dalam larutan lisis sampai semua sampel telah diproses.
Kemudian sampel dari semua timepoint dapat dijalankan dalam eksperimen
yang sama, yang sekaligus praktis praktis, menghindari variabilitas
eksperimental.

Untuk dapat membandingkan kinetika perbaikan yang berbeda,

separuh waktu penghilangan kerusakan (t1 / 2) harus dihitung. Untuk
mendapatkan estimasi parameter yang akurat, pilihan titik waktu yang
berbeda sangat penting. Umumnya perbaikan SSB cepat, dengan t1 / 2 dari
10 menit atau lebih sementara perbaikan basis teroksidasi dan teralkilasi dan
dimer siklimutan C yang diinduksi UV memerlukan waktu beberapa jam
(Lorenzo et al., 2009). Parameter lain yang berguna adalah tingkat
perbaikan awal, namun ini sulit untuk memperkirakan secara akurat jika
perbaikan berlangsung cepat.

2. Apoptosis dan sel kulit terbakar

Apoptosis adalah bentuk kematian sel terprogram yang memainkan
peran penting dalam perkembangan dan homeostasis tubuh manusia.
Terutama dalam memperbaharui jaringan secara terus menerus seperti kulit,
pertumbuhan sel dan kematian sel harus diatur secara ketat untuk
memastikan fungsi jaringan yang benar dan mencegah pertumbuhan
berlebihan yang tidak tepat.
Kulit terdiri dari tiga lapisan yang berbeda. Lapisan terdalam adalah
lemak subkutan yang ditutupi oleh dermis. Dermis berisi pembuluh darah,
saraf, folikel rambut dan kelenjar keringat. Lapisan atas disebut epidermis,
epitel multilen yang terus diperbarui dengan tingkat perputaran yang tinggi.
Epidermis terdiri dari tiga jenis sel: sel Langerhans (LC), melanosit dan
keratinosit. Keratinosit adalah sel yang membentuk sebagian besar
epidermis. Keratinosit basal dan suprabasal merupakan kompartemen yang
berkembang pesat yang dikenal sebagai lapisan dasar stratum. Diferensiasi
keratinosit terminal dimulai pada detasemen dari membran dasar yang
mendasari ke stratum spinosum. Keratinosit bergerak ke atas melalui
stratum spinosum ke dalam stratum granulosum dimana sel-sel melepaskan
nukleusnya. Produk akhir adalah amplop keratinous yang terikat secara
mekanis dan berikatan silang di stratum korneum dan ditumpahkan sebagai
corneocyte enukleat. Sel Langerhans adalah sel dendritik perumahan
epidermis. Melanosit menghasilkan pigmen yang sebagian besar terdiri dari
melanin dan berada di lapisan basal epidermis.
Peraturan kematian sel sangat penting dalam homeostasis epidermis.
Tingkat perputaran keratinosit sangat tinggi dan keratinosit basal dan
suprabasal terus membelah dan akhirnya mati setelah diferensiasi terminal
di stratum granulosum. Selanjutnya, kulit terus menerus terpapar faktor
eksternal seperti bahan kimia dan sinar matahari yang bisa merusak
keratinosit. Kematian sel memastikan bahwa keratinosit yang rusak parah
dikeluarkan untuk mencegah disfungsi sel-sel ini.
Apoptosis di kulit bisa diinduksi oleh bahan kimia dan radiasi
pengion, namun yang paling relevan adalah paparan kulit terhadap sinar
matahari. Radiasi ultraviolet (UVR) adalah inducer kuat apoptosis di kulit.
Keratinosit epidermal apoptotik, yang dikenal sebagai sel kulit terbakar
(SBC), pada awalnya digambarkan oleh penampilan khasnya, yaitu nuklei
pyknotic dan sitoplasma eosinofilik yang menyusut. Fitur ini membuat SBC
mudah dikenali di bagian bernoda hematoxylin eosin (H & E). SBC dapat
dideteksi sejak 8 jam setelah paparan UVR dengan angka maksimal 24-48
jam dan menghilang 60-72 jam. Secara in vitro, apoptosis akhirnya akan
menghasilkan permeabilisasi membran plasma, yang dikenal sebagai
nekrosis sekunder, yang dapat menyebabkan peradangan. Namun, diyakini
bahwa ini tidak akan terjadi dalam keadaan fisiologis secara in vivo karena
sel apoptotik yang cepat sembuh. Di kulit, hilangnya desmosom pada
keratinosit apoptosis akan menghasilkan migrasi yang lebih cepat ke
stratum korneum. Selanjutnya, penumpahan akan membersihkan sebagian
besar SBC dari kulit. Selain itu, infiltrasi makrofag, sel Langerhans dan
keratinosit menginternalisasi SBC sebelum mencapai stratum korneum.
 Cahaya UV (200-400 nm) dibagi menurut panjang gelombang sinar
UVA (315-400 nm), UVB (280-315nm) dan UVC (200-280 nm). UVC
diserap oleh lapisan ozon stratosfer, oleh karena itu sinar matahari biasanya
hanya mengandung UVA dan UVB. UVA menembus lapisan epidermis dan
kulit dermal, dan lemah diserap oleh molekul bio. Sebaliknya, UVB tidak
menembus jauh lebih jauh daripada lapisan epidermis dan sangat diserap
oleh DNA dan protein. Oleh karena itu UVB adalah inducer SBC yang
paling efektif di kulit (15; 16). Apoptosis akibat UVB telah dikenali sebagai
mekanisme kompleks dimana berbagai jalur sinyal dilibatkan; 1) apoptosis
yang disebabkan oleh kerusakan DNA langsung, 2) apoptosis yang
dimediasi oleh reseptor kematian, dan 3) apoptosis melalui pembentukan
spesies oksigen reaktif (ROS). Jalur ini akan dibahas di bawah ini (Gambar
9).
a. Apoptosis yang disebabkan oleh kerusakan DNA
Kerusakan DNA yang disebabkan UVB telah lama diusulkan
menjadi satu-satunya mediator kematian sel yang diinduksi UVB.
Penyerapan energi UVB oleh DNA menghasilkan dua jenis lesi utama yang
dikenal sebagai pigidin pirimidin dimer (CPD) dan <6-4> photoproducts.
CPD terdiri dari 70-80% dari semua produk photoprods UV. Sebagian besar
lesi DNA dikeluarkan dengan perbaikan eksisi nukleotida (NER), yang
menghasilkan single nucleotide DNA terdampar tunggal tunggal (24-32
basis) di sekitar tempat yang rusak dan kemudian menggantikan lesi DNA
yang dipotong. Peningkatan jumlah SBC ditemukan pada pasien yang
menderita xeroderma pigmentosum, suatu penyakit di mana cacat genetik
menonaktifkan proses perbaikan eksisi nukleotida. Peran penting kerusakan
DNA pada apoptosis akibat UVB telah dikonfirmasi oleh studi in vivo pada
manusia yang menunjukkan peningkatan perbaikan DNA dengan aplikasi
topikal enzim perbaikan mengurangi pembentukan SBC.
Sel dengan kerusakan DNA yang berkelanjutan menunjukkan
peningkatan dramatis pada tingkat gen supresor tumor p53 dalam beberapa
menit. Upregulasi ini terbukti sebanding dengan jumlah CPD yang
dimasukkan ke dalam DNA genom oleh UVB.

Gambar 9. Skema representasi dari tiga jalur sinyal yang terlibat dalam
apoptosis akibat UVB. 1) Kerusakan DNA langsung mengatur ekspresi dan
fungsi p53, yang mengaktifkan Bax / Bak yang menghasilkan pelepasan
sitokrom c dari mitokondria, yang kemudian mengarah pada aktivasi
aktivasi apoptosis protease (Apaf-1), aktivasi caspase-9 dan caspase-3 Dari
apoptosis P53 juga dapat bertindak sebagai faktor transkripsi yang mampu
menginduksi transkripsi dan ekspresi reseptor kematian. 2) Pengelompokan
reseptor kematian menyebabkan perekrutan dan aktivasi FADD yang
mengaktifkan caspase-8 yang pada gilirannya mengaktifkan caspase-3. 3)
Pembentukan langsung spesies oksigen reaktif (ROS) menghasilkan
peroksidasi lipid pada membran mitokondria dan pelepasan sitokrom c
selanjutnya yang mengarah pada aktivasi caspase-3. Bcl-2 dan Bcl-XL
dapat menghambat pelepasan cytochrome c sementara inhibitor apoptosis
(IAPs) dapat menghambat aktivasi caspases.

P53 bertindak sebagai faktor transkripsi, menginduksi transkripsi

sejumlah gen yang produknya memicu penangkapan sel-siklus selama fase
G1. Hal ini memungkinkan sel untuk memperbaiki DNA sebelum sintesis
DNA, mengurangi tingkat mutasi DNA. Pada tikus yang kekurangan
fungsional p53 jumlah SBC yang lebih rendah diinduksi. Bila kerusakan
DNA tidak diperbaiki, apoptosis cukup dimulai dengan menginduksi faktor
pro-apoptosis seperti Bax atau Bak yang mengakibatkan pelepasan sitokrom
c dari mitokondria. Apoptosom terbentuk dengan mengikat sitokrom c
menjadi faktor pengaktifase protease apoptosis 1 (Apaf-1) dan selanjutnya
procaspase. Peristiwa kritis ini menyebabkan inisiasi kaskade apoptosis
dengan aktivasi caspase-9 dan caspase-3 melalui pembelahan. Aktivasi
caspases executer ini pada gilirannya menyebabkan pembelahan substrat
seluler kritis dan fragmentasi DNA. Jalur mitokondria ini dapat diatur oleh
keluarga protein Bcl2 anti-apoptosis (Bcl-2, Bcl-XL) yang mencegah
pelepasan sitokrom c dari mitokondria dan penghambat apoptosis (IAPs)
yang mencegah pembelahan caspase. Paparan sinar UV menyebabkan
turunnya regulasi Bcl-2 pada kulit manusia, mempromosikan apoptosis
(24). Ekspresi berlebihan Bcl-XL dan Bcl-XS di epidermis tikus transgenik
berkontribusi terhadap kelangsungan hidup sel setelah penyinaran UV (25).
Kerusakan DNA yang disebabkan oleh sinar UV juga telah ditunjukkan
untuk meningkatkan aktivasi reseptor dan transkripsi transkrip dan aktivasi
transkripsi melalui jalur p53-dependent.
b. Reseptor kematian dimediasi apoptosis akibat UV
Reseptor kematian adalah anggota superfamili reseptor tumor
necrosis factor (TNF), termasuk reseptor TNF-1, reseptor penghambat
penginduksi apoptosis TNFα (TRAIL) dan Fas (CD95). Meskipun semua
reseptor ini telah dikaitkan dengan apoptosis akibat sinar UV, kematian sel
yang dimediasi Fas tampaknya memainkan peran paling menonjol.
Keratinosit kulit normal mengekspresikan Fas. Ekspresi diregulasi
dalam keratinosit yang terpapar sinar matahari secara kronis tetapi juga
setelah radiasi UVB dosis tunggal, menunjukkan keterlibatannya dalam
kerusakan akibat sinar matahari. CD95 memediasi apoptosis melalui
pengikatan ligannya, FasL (CD95L), yang mungkin ada dalam bentuk
terlarut atau diekspresikan pada membran sel. FasL juga secara konstitutif
diekspresikan oleh keratinosit, dan ekspresi diregulasi setelah paparan sinar
UV. Sehubungan dengan apoptosis yang disebabkan oleh UVB, Aragene
dkk menunjukkan aktivasi FAS langsung dan ligand independen, dengan
mengelompokkan Fas pada membran sel. Clustering of Fas, ligand
dependent atau independent, menyebabkan aktivasi domain kematian
intraseluler yang, pada gilirannya, dapat mengikat protein terkait Fas
(FADD) yang memicu keracunan protease, dimulai dengan caspase-8.
FADD baru-baru ini juga telah ditunjukkan untuk diregulasi dengan iradiasi
UV. Caspase-8 akan membelah executer caspase-3 yang mendorong
kejadian apoptosis seperti yang dijelaskan sebelumnya.

ENZIM PERBAIKAN DNA

Informasi genetik yang tersimpan dalam DNA digunakan oleh

semua organisme hidup untuk memastikan fungsi dan perkembangan
normal mereka. Berbeda dengan protein globular, molekul DNA sangat tipis
dan panjang, sehingga bahkan basisnya terpapar pelarut. DNA, oleh karena
itu, mudah dimodifikasi dan dirusak oleh berbagai agen kimia dan berbagai
jenis radiasi untuk menghasilkan lesi mutagenik. Mutagenesis DNA juga
menghasilkan formasi spontan pasangan basa yang tidak sesuai dalam
genom selama replikasi. Jika tidak diperbaiki, lesi DNA ini mengganggu
integritas genomik dan akibatnya bisa mematikan sel hidup. Semua
organisme, oleh karena itu, mengandung berbagai mekanisme perbaikan
yang menghilangkan nukleotida yang tidak tepat dari DNA dan
menggantinya dengan oncs yang benar.

Enzim perbaikan DNA mengenali dan mengeluarkan bagian DNA

yang rusak. Langkah besar ini dilakukan oleh berbagai macam enzim atau
kompleks multienzyme, yang dapat diklasifikasikan menurut berbagai lesi
dan mekanisme perbaikan. Dalam jalur perbaikan eksisi perbaikan (BER),
DNA glycosylase secara langsung mengeluarkan bagian-bagian yang
dimodifikasi dari DNA untuk menghasilkan situs apurinik-apyrimidinik
(AP), dan tulang punggung fosfat di situs abasic kemudian dibelah oleh
tindakan AP-endonuklease Enzim yang terlibat dalam jalur pembalikan
langsung (DR) mengkatalisis reaksi balik terhadap yang awalnya
menyebabkan modifikasi dasar; Dengan demikian, eksisi tidak diperlukan.
Perbaikan eksisi nukleotida (NER) adalah mekanisme perbaikan DNA yang
paling penting dan universal dalam organisme hidup, dan memungkinkan
eksisi hampir semua jenis lesi DNA yang sesuai dengan modifikasi kimia.
NER menghilangkan segmen untai DNA termasuk dasar yang rusak dan
beberapa nukleotida di kedua sisi lesi. Enzim yang terlibat dalam sistem
perbaikan ketidakcocokan (MMT) memiliki mekanisme tindakan serupa
terhadap sistem BER dan NER. Perbedaan utama MMR dari sistem
perbaikan lainnya adalah dapat mendiskriminasi basis yang tidak tepat
antara dua nukleotida normal yang membentuk pasangan basa yang tidak
serasi.

Sistem perbaikan DNA sangat dilestarikan di antara spesies yang

berbeda, mulai dari prokariota hingga eukariota. Mekanisme perbaikan
DNA fungsional seringkali menyebabkan kanker dan, pada umumnya,
mematikan organisme. Dengan demikian, studi struktural tentang perbaikan
DNA adalah salah satu bidang terpenting, membantu biologi sel dan ilmu
kedokteran. Penelitian kristalografi yang berhasil terhadap beberapa enzim
perbaikan DNA dalam dua tahun terakhir telah banyak berkontribusi pada
pemahaman tentang bagaimana DNA yang rusak dikenali dan dieksisi pada
tingkat molekuler. Tidak mungkin untuk menggambarkan semua aspek
perbaikan DNA yang tersedia dari studi struktural terkini; Oleh karena itu,
tinjauan ini berfokus pada mekanisme dimana enzim pengatur mengikat
secara khusus DNA yang rusak.