1.

Pendahuluan

Senyawa fenolik alami menerima banyak perhatian karena potensi manfaat kesehatannya.
Sebagai akibatnya, sejumlah besar penelitian sedang difokuskan pada penentuan senyawa
jenis ini. Meskipun, hubungan antara konsumsi mereka dan pengaruh potensial terhadap
kesehatan masih belum sepenuhnya dipahami, efek ini dapat diselidiki lebih mendalam, yaitu,
pada tingkat molekuler, melalui pendekatan foodomic baru-baru ini, yang diharapkan dapat
memberikan bukti yang lebih terdengar pada bioaktifitas polifenol.

Pembuatan profil senyawa fenolik dari sampel tertentu biasanya merupakan tugas yang sulit,
mengingat variabilitas besar struktur kimia yang termasuk dalam kelompok metabolit yang
luas ini. Meskipun LC terutama digunakan untuk profil senyawa fenolik dalam sampel terkait
makanan, tergantung pada kompleksitas relatif dari sampel yang dianalisis, teknik ini
mungkin tidak memiliki kekuatan pemisahan. Dalam hal ini, penggunaan teknik multidimensi
secara signifikan meningkatkan kemampuan pemisahan dibandingkan dengan rekan satu
dimensi mereka. Kromatografi cair dua dimensi komprehensif (LC × LC) mengambil
keuntungan dari kombinasi dua mekanisme pemisahan independen untuk secara efektif
meningkatkan daya penyelesaian yang tersedia serta menghasilkan peningkatan dramatis
pada kapasitas puncak. Untuk melakukan analisis semacam ini, dua proses pemisahan yang
berbeda harus digabungkan secara on-line, sehingga fraksi dari dimensi pertama (D1) eluat
dikumpulkan secara terus-menerus dan disuntikkan ke dimensi kedua (D2). Penggandengan
ini tidak mudah, dan berbagai strategi telah dikembangkan dan diterapkan untuk
meningkatkan tanda hubung. Idealnya, pendekatan yang paling menguntungkan disusun oleh
dua dimensi di mana mode pemisahan yang berbeda digabungkan, untuk meningkatkan
ortogonalitas sistem, memaksimalkan daya pemisahan. Karena karakteristiknya, LC × LC
memiliki potensi untuk menjadi alat yang kuat untuk mempelajari profil, di mana komposisi
lengkap pada kelas senyawa tertentu hadir pada sampel makanan dipelajari.

LC komprehensif telah digunakan untuk menganalisis berbagai sampel makanan, termasuk

studi tentang beberapa senyawa fenolik dari jus, anggur, dan bir. Namun demikian, pola
senyawa fenolik kompleks dari apel belum diteliti dengan menggunakan teknik ini.

Apel sangat kaya akan senyawa fenolik dari kelas kimia yang beragam dan, sampai sekarang,
belum mungkin untuk secara bersamaan menentukan fenolat utama yang ada pada apel milik
subkelas yang berbeda ini. Dalam hal ini, berbagai metode telah dipresentasikan berfokus
pada penentuan oligomer procyanidin pada sampel ini, dengan menggunakan kromatografi
arus balik berkecepatan tinggi (HSCCC), kromatografi eksklusi ukuran (SEC), LC fase
normal (NP-LC) atau bahkan off-line LC dua dimensi. Namun, karya-karya ini terutama
difokuskan pada procyanidins, dan tidak ada senyawa fenolik lainnya, juga penting dalam
apel, dianalisis dalam jangka waktu yang sama. Di sisi lain, untuk menganalisis senyawa
fenolik lain, pendekatan berbasis RP biasanya telah digunakan dan, meskipun menggunakan
metode-metode terakhir ini beberapa procyanidin juga terdeteksi, ini hanya terbatas pada
dimer, tidak mungkin analisis seluruh pola oligomer procyanidin. Akibatnya, pemisahan
lengkap semua senyawa sampel makanan kompleks seperti apel, tidak dapat dicapai dengan
menggunakan LC satu dimensi konvensional; untuk alasan ini, pendekatan multidimensi lain
telah dipelajari, khususnya berdasarkan hubungan antara kromatografi cair interaksi hidrofilik
(HILIC) dan pemisahan RP.

Dalam hal ini, kami baru-baru ini mengembangkan metode HILIC × RP baru untuk
mengkarakterisasi procyanidins biji anggur; berdasarkan karya itu, dalam naskah ini, metode
ini lebih dioptimalkan dan diperluas untuk mendeteksi beberapa kelas komponen fenolik,
selain procyanidins. Metode baru diterapkan pada profil senyawa fenolik dalam lima varietas
apel yang berbeda. Akibatnya, tujuan dari pekerjaan ini adalah pengembangan metode LC ×
LC yang mampu menganalisis seluruh profil senyawa fenolik yang terdapat dalam apel,
termasuk oligomer procyanidin serta flavonoid dan asam fenolik lainnya, dalam satu analitik
tunggal.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Sampel dan bahan kimia

Lima apel (Malus domestica) dari varietas yang berbeda (Red Starking, Kanzi, Royal Gala,
Reinette dan Granny Smith) dibeli di supermarket lokal di Madrid, Spanyol.

Asetonitril, metanol, dan 2-propanol adalah grade HPLC dan diperoleh dari Lab-Scan
(Dublin, Irlandia). Asam format, natrium karbonat, asam galat, kuersetin, phloridzin
dihydrate dan 4-dimethylamino cinnamaldehyde (DMAC) dipasok oleh Sigma Aldrich
(Madrid, Spanyol), sedangkan etanol dan asam asetat dibeli dari Scharlab (Barcelona,
Spanyol). Reagen fenol-Ciocalteu dan HCl diperoleh dari Merck (Darmstadt, Jerman). Air
yang digunakan adalah kelas Milli-Q yang diperoleh dari sistem Millipore (Billerica, MA).
(+) - catechin, (-) - epicatechin, procyanidin B1, quercetin-3-O-rutinoside dan quercetin-3-
Ogalactoside standar referensi diperoleh dari Extrasynthèse (Genay, Prancis).

2.2. Persiapan sampel

Senyawa fenolik apel diekstraksi sesuai dengan protokol yang diterbitkan sebelumnya yang
sedikit dimodifikasi [26]. Secara singkat, seluruh apel segar dipotong kecil-kecil sebelum
liofilisasi mereka dalam pengering beku (Labconco Corporation, MO). 19 g serbuk apel yang
diliofilisasi diekstraksi dengan 80 mL aseton / air (70:30, v / v) selama 20 menit
menggunakan pengadukan magnet dan dilindungi dari cahaya. Ekstrak yang dihasilkan
disentrifugasi selama 20 menit pada tahun 1900 × g, supernatan didekantasi dan endapan
diekstraksi kembali mengikuti prosedur yang sama. Kedua supernatan dikumpulkan dan 50
mL air ditambahkan sebelum aseton dihilangkan dalam Rotavapor R-210 (Buchi
Labortechnik AG, Flawil, Swiss). Selanjutnya, senyawa fenolik dipekatkan menggunakan
ekstraksi fase padat (SPE). Discovery DSC 18 6 mL kartrid SPE (Supelco, Bellefonte, PA,
USA) dikondisikan dengan 3 × 5 mL metanol dan dengan 3 × 5 mL air. Kemudian, 10 mL
sampel dimuat dalam kolom SPE, dibilas dengan 10 mL air, dan polifenol diekstraksi dengan
2 × 5 mL aseton / air (70:30, v / v). Akhirnya, aseton diuapkan lagi dengan penguapan
berputar, dan ekstrak berair yang tersisa diliofilisasi.
2.3. Penentuan kandungan total fenol (Folin-Ciocalteu metode)

Total kandungan fenol dari sampel apel yang berbeda diukur menggunakan uji Folin-
Ciocalteu dengan beberapa modifikasi. Volume total campuran reaksi miniatur menjadi 1
mL. 600 L air dan 10 L dari masing-masing sampel apel (1 mg mL − 1 ekstrak polifenol
dalam metanol) dicampur, yang kemudian ditambahkan 50 L reagen Folin-Ciocalteu yang
tidak dilarutkan. Setelah 1 menit, 150 L 20% (b / v) Na2CO3 ditambahkan dan volumenya
dibuat hingga 1,0 mL dengan air. Setelah 2 jam inkubasi pada 25 ◦C, 300 L campuran
dipindahkan ke dalam sumur dari lempengan mikro 96-sumur. Absorbansi diukur pada 760
nm dalam pembaca spektrofotometer lempeng mikro Powerwave XS (Bio Tek Instruments,
Winooski, VT) dan dibandingkan dengan kurva kalibrasi asam galat (0,032-2 mg mL − 1)
yang diuraikan dengan cara yang sama. Data disajikan sebagai rata-rata analisis rangkap tiga
yang dinyatakan sebagai mg gallic acid equiv. (GAE) g − 1 bahan kering.

2.4. Penentuan total procyanidins

Untuk memperkirakan kandungan total procyanidin dalam sampel apel, metode p-

dimethylaminocinnamaldehyde (DMAC) digunakan sesuai dengan pekerjaan oleh Prior et al.
dengan beberapa modifikasi. Singkatnya, larutan DMAC (pereaksi DMAC 0,1% (b / v) pada
campuran etanol / air / HCl 75: 12.5: 12.5, v / v / v) disiapkan segera sebelum digunakan. 70
L dari setiap sampel apel (0,075 mg mL-1 ekstrak polifenol dalam metanol) dicampur dengan
210 L larutan DMAC. Campuran itu vortex, dipindahkan ke dalam sumur dari lempengan
mikro 96-baik dan dibiarkan bereaksi pada suhu kamar selama 15 menit. Setelah waktu ini,
absorbansi dibaca pada 640 nm menggunakan pembaca piringan gelombang mikro
Powerwave XS (Bio Tek). Kosong dengan 70 L metanol bukan sampel dan sampel kontrol
tanpa larutan DMAC juga dimasukkan. Setiap sampel, kosong dan kontrol disiapkan dalam
rangkap tiga. Konsentrasi total procyanidin diperkirakan dari kurva kalibrasi menggunakan
epicatechin (0,001-0,02 mg mL − 1). Data disajikan sebagai rata-rata analisis duplikat yang
dinyatakan sebagai mg epicatechin equiv. (ECE) g − 1 bahan kering.

2.5. Kromatografi cair dua dimensi yang komprehensif (LC × LC) analisis senyawa fenolik
apel

2.5.1. Instrumen

Analisis LC × LC dilakukan pada Agilent 1200 series liquid chromatograph (Agilent

Technologies, Santa Clara, CA) yang dilengkapi dengan detektor dioda array dan
autosampler. Untuk memiliki laju aliran rendah dan gradien rendah yang kuat dan dapat
direproduksi dalam dimensi pertama, pemisah aliran Protecol (Ilmu Analitik SGE, Milton
Keynes, Inggris) ditempatkan di antara pompa dimensi pertama dan autosampler. Selain itu,
pompa LC tambahan (Agilent 1290 Infinity) digabungkan ke instrumen ini untuk melakukan
pemisahan dimensi kedua, ditulis dgn tanda penghubung melalui katup switching dua posisi
sepuluh-port dua-posisi yang dikontrol secara elektronik. Spektrometer massa Agilent 6320
Ion Trap yang dilengkapi dengan antarmuka electrospray digabungkan secara on-line dan
dioperasikan dalam mode ionisasi negatif menggunakan kondisi berikut: suhu kering, 350 ◦C;
rentang massa, m / z 90–2200 Da; laju aliran gas kering, 12 L mnt − 1; dan tekanan
nebulisasi, 40 psi. Data LC dijabarkan dan divisualisasikan dalam dua dan tiga dimensi
menggunakan perangkat lunak LC Image (versi 1.0, Zoex Corp, Houston, TX).

2.5.2. LC × kondisi pemisahan LC

Sampel disiapkan dengan mengencerkan 6 mg ekstrak polifenol dari setiap varietas apel
dalam 300 L metanol dan menambahkan 700 L asetonitril untuk mendapatkan 6 mg mL − 1
larutan, yang disaring melalui 0,45 m nilon jarum suntik filter (Symta , Madrid, Spanyol)
sebelum injeksi.

Pada dimensi pertama, kolom Lichrospher diol-5 (150 × 1.0 mm, 5 m d.p, HiChrom,
Reading, UK) digunakan dengan precolumn dengan fase diam yang sama. Laju aliran yang
dioptimalkan digunakan adalah 21 L min − 1, dari menit 0 hingga 24, dan 15 L min − 1 dari
menit 24 hingga akhir analisis. Fase gerak yang digunakan adalah (A) asetonitril / asam asetat
(98: 2, v / v) dan (B) metanol / air / asam asetat (95: 3: 2, v / v / v) dielusi sesuai dengan
gradien berikut : 0 mnt, 0% B; 2 mnt, 0% B; 5 mnt, 20% B; 30 mnt, 20% B; 40 mnt, 30% B;
50 mnt, 30% B. Volume injeksi adalah 20 L.

Dalam dimensi kedua, Ascentis Express C18 (50 × 4,6 mm, 2,7 m d.p., Supelco, Bellefonte,
CA) sebagian kolom berpori digunakan bersama-sama dengan precolumn C18. Selama
pemisahan LC × LC keseluruhan, gradien dimensi kedua berulang s-78 digunakan, juga
waktu modulasi 78 s diprogram dalam katup switching. Dua profil gradien yang berbeda
digunakan sepanjang analisis. Selama 25,4 menit pertama dari analisis dua dimensi, fase
gerak yang digunakan dalam D2 terdiri dari air (0,1% asam format, A) dan asetonitril (B)
dielusi menurut gradien berikut: 0 menit, 0% B; 0,1 menit, 15% B; 0,8 menit, 50% B; 1,0
menit, 70% B; 1,01 menit, 0% B. Dari menit 25,4 hingga akhir analisis, komposisi fase gerak
diubah menjadi air (0,1% asam format, A) dan asetonitril / metanol (50:50, v / v) (B)
menggunakan program berikut: 0 mnt, 0% B; 0,1 menit, 15% B; 0,3 menit, 25% B; 1,0 menit,
45% B; 1,01 menit, 0% B. Laju aliran adalah 3 mL min − 1.

Panjang gelombang yang digunakan untuk memantau pemisahan adalah 280 nm, meskipun
spektra UV-vis dikumpulkan dari 190 hingga 550 nm selama keseluruhan analisis
menggunakan laju sampling 20 Hz dalam detektor dioda array. MS dioperasikan dalam mode
ESI negatif. Aliran yang dielusi dari kolom dimensi kedua dibelah sebelum instrumen MS,
sehingga laju aliran yang memasuki detektor MS adalah sekitar 600 L min − 1.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Optimasi persiapan sampel untuk analisis senyawa fenolik dari apel

Bagian pertama dari penelitian ini terdiri dari pencarian kondisi ekstraksi yang optimal untuk
mendapatkan sampel yang mewakili senyawa fenolik apel. Apel sangat terkenal karena
memiliki jumlah procyanidin yang tinggi serta senyawa fenolik lainnya. Meskipun berbagai
teknik ekstraksi lanjutan telah digunakan untuk mendapatkan polifenol apel tertentu, seperti
ekstraksi cairan superkritis, ekstraksi berbantuan gelombang mikro atau ekstraksi cair
bertekanan, untuk tujuan penelitian ini, metode ekstraksi yang relatif cepat dan mudah
mampu menyediakan Campuran luas dari seluruh pola senyawa fenolik yang ada pada
sampel ini dicari. Untuk melakukan ini, metodologi ekstraksi yang berbeda pada awalnya
diuji, termasuk ekstraksi dengan ultrasonik serta pengadukan magnet menggunakan aseton:
air 70:30 (v / v) sebagai pelarut ekstraksi. Optimalisasi prosedur ekstraksi dipantau
menggunakan metode berbasis HILIC, yang merupakan dasar dari dimensi pertama metode
LC × LC sebelumnya yang melibatkan pemisahan polimer procyanidins pada biji anggur
tergantung pada tingkat polimerisasi (DP). Penggunaan magnetic stirring diikuti dengan
pembersihan SPE dan langkah konsentrasi memberikan hasil terbaik. Setelah memilih
metodologi awal untuk ekstraksi, penggunaan kartrid SPE yang berbeda dengan fase
stasioner yang beragam diuji untuk menemukan kondisi terbaik untuk membersihkan dan
meningkatkan pemulihan senyawa fenolik dalam ekstrak apel. Yakni, fase diam amino, HLB
dan C18 dipelajari. Menggunakan kartrid C18, ekstrak yang menghasilkan distribusi yang
lebih baik dalam pemisahan HILIC serta jumlah puncak yang lebih tinggi diperoleh, seperti
yang dapat diamati pada Gambar. 1A. Untuk memiliki pemisahan yang relatif baik dan
distribusi luas puncak dalam pemisahan pertama adalah penting untuk mencapai analisis dua
dimensi yang baik. Dengan demikian, fase diam ini akhirnya dipilih untuk melakukan
prosedur ekstraksi. Setelah semua langkah protokol ekstraksi dioptimalkan, ekstrak kaya
senyawa fenolik dari apel diperoleh dengan mengekstraksi 19 g apel liofilisasi dengan 80 mL
aseton: air 70:30 (v / v) dua kali, dan ekstrak yang dihasilkan lebih lanjut terkonsentrasi
menggunakan SPE seperti yang dijelaskan di atas.

3.2. Analisis HILIC × RP-DAD – ESI-MS dari senyawa fenolik dari apel

Langkah selanjutnya terdiri dari optimalisasi metode pemisahan. Meskipun, seperti yang
telah disebutkan, apel procyanidin sebelumnya telah dianalisis menggunakan NP-LC, SEC
dan HSCCC, semua metode ini memiliki beberapa kelemahan, terutama yang melibatkan
waktu analisis yang panjang dan ketidakmungkinan untuk memisahkan procyanidin yang
berbeda yang memiliki DP yang sama. Karena tujuan kami adalah untuk memisahkan
procyanidins apel bersama-sama dengan senyawa fenolik lainnya dengan menggunakan
pendekatan LC × LC, set-up yang terdiri dari pemisahan HILIC di dimensi pertama (D1)
digabungkan ke pemisahan RP-LC cepat di dimensi kedua (D2 ), yang sebelumnya
dikembangkan untuk pemisahan proanthocyanidins biji anggur, awalnya diuji. Namun,
karena perbedaan yang jelas diharapkan antara komposisi sampel ini, terutama mengingat
bahwa pola procyanidins dalam apel lebih sederhana daripada dalam biji anggur sedangkan
apel mengandung jumlah flavonoid dan asam fenolik yang lebih banyak daripada biji anggur,
tidak ada pemisahan lengkap yang dapat dicapai dengan metode asli dan optimasi lebih lanjut
dari metode HILIC × RP diperlukan untuk mendapatkan profil yang jelas dari seluruh
komposisi senyawa fenolik dari apel. Karena optimalisasi pemisahan dua dimensi bukanlah
tugas yang mudah, setiap dimensi dipelajari secara terpisah, meskipun analisis LC × LC
selama optimasi juga diperlukan, tidak hanya untuk mengkonfirmasi kemanjuran dari
perubahan yang dilakukan tetapi juga untuk menyarankan modifikasi lebih lanjut untuk
penyesuaian kondisi kerja yang baik.

Pertama, pemisahan HILIC dioptimalkan memodifikasi gradien yang digunakan untuk

mendapatkan distribusi sampel yang lebih baik melalui ruang pemisahan yang tersedia.
Dalam hal ini, penting untuk diingat bahwa kondisi kromatografi yang digunakan dalam D1
akan secara signifikan mempengaruhi D2. Selain itu, bahkan jika pelarut yang digunakan
dalam dua dimensi dapat larut atau bahkan sama, penggunaan mekanisme pemisahan yang
berbeda dalam dua dimensi menyiratkan bahwa pelarut yang lebih lemah dalam D1 adalah
pelarut yang lebih kuat dalam D2 dan sebaliknya, yang mungkin secara signifikan
mengganggu pencapaian kopling yang sukses. Untuk alasan ini, volume injeksi maksimum
dalam D2 30 L dipertimbangkan, dibatasi oleh kapasitas maksimum loop injeksi. Namun
demikian, seperti yang kami tunjukkan sebelumnya, transfer volume yang lebih kecil ke loop
injeksi yang dipasang di katup switching digunakan sebagai antarmuka antar injeksi (<20 L),
memungkinkan pengenceran D1 memanjang dengan fase gerak awal D2, menghasilkan
bentuk puncak yang lebih baik dan distorsi puncak secara signifikan lebih sedikit dalam
pemisahan yang terakhir ini. Akibatnya, 15 L min − 1 dipilih sebagai laju aliran, yang berarti
bahwa transfer 19,5 L ke loop injeksi akan berlangsung selama 78 detik, yang akan menjadi
waktu modulasi serta waktu yang tersedia untuk melaksanakan setiap pemisahan D2 tunggal .
Laju aliran yang lambat seperti itu menyiratkan penggunaan kolom microbore sehingga
kinerja analitik yang dibutuhkan dapat tercapai. Setelah beberapa modifikasi dalam
komposisi dan karakteristik fase gerak dan gradien yang digunakan, diputuskan untuk
mempertahankan fase gerak awal yang sama menggunakan gradien yang kurang curam.
Gambar. 1B menunjukkan kromatogram yang diperoleh di bawah kondisi pemisahan D1
yang optimal. Kondisi gradien final dirinci dalam Bagian 2.5.2. Seperti dapat diamati
dibandingkan dengan Gambar. 1A, puncak lebih merata selama analisis.

Untuk optimisasi kondisi D2, 78 detik ditetapkan sebagai waktu analisis target. Analisis LC ×
LC pendahuluan menggunakan gradien dari metode asli menunjukkan dengan jelas bahwa
pada bagian terakhir (sumbu x) puncak plot 2D dipisahkan dengan jelas dan cukup. Namun,
beberapa puncak tidak sepenuhnya diselesaikan pada bagian awal analisis 2D. Untuk
mengatasi masalah ini, gradien dinamis digunakan dalam analisis D2 mempertahankan laju
aliran 3 mL min − 1. Analisis LC × LC dibagi menjadi dua zona yang terdiferensiasi dengan
baik: dari 0 hingga 25,4 menit dan dari 25,4 hingga akhir analisis. Kondisi asli yang
melibatkan penggunaan air ditambah 0,1% asam format (A) dan asetonitril / metanol 50:50 (v
/ v) (B) sebagai fase gerak dipertahankan pada paruh kedua analisis 2D, sedangkan kondisi
pemisahan bagian awal (hingga 25,4 menit) sepenuhnya dioptimalkan. Fase dan gradien
seluler yang berbeda digunakan, akhirnya mencapai kondisi optimum penggunaan air
ditambah asam format 0,1% (A) dan asetonitril (B) mencapai proporsi yang lebih tinggi dari
pengubah organik selama pemisahan. Kondisi pemisahan akhir yang terlibat dalam D2
ditentukan dalam Bagian 2.5.2. Pada Gambar. 2A dan B, perbandingan antara pemisahan
yang diperoleh dalam 26 menit pertama dari analisis dua dimensi sebelum dan sesudah
optimasi, masing-masing, ditunjukkan. Seperti dapat dihargai, puncak coeluting sekitar 60-65
s (Gbr. 2A) lebih jelas diselesaikan (34-43 s) setelah optimasi (Gbr. 2B). Dimungkinkan juga
untuk mengamati pemisahan yang diperoleh pada bagian terakhir (25,4 menit analisis akhir)
dari analisis dalam kondisi optimum. Selain itu, karena kompleksitas relatif dalam 26 menit
pertama dalam hal jumlah senyawa yang berbeda lebih rendah, diputuskan untuk
meningkatkan laju aliran D1 untuk mempercepat analisis dalam batas tertentu, mengambil
keuntungan dari volume loop injeksi dipasang di katup switching. Dengan demikian, laju
aliran D1 untuk bagian pertama dari analisis (Gbr. 2B) didirikan pada 21 L min, 1, sedangkan
di bagian kedua (Gbr. 2C), laju aliran D1 dipertahankan pada 15 L min− 1 untuk mengambil
keuntungan dari efek pengenceran yang dihasilkan oleh penggunaan sebagian dari volume
loop injeksi yang tersedia, seperti yang disebutkan sebelumnya.

3.3. Profil senyawa fenolik dalam varietas apel yang berbeda

Setelah metode analitis dioptimalkan, prosedur LC dua dimensi digabungkan ke MS,

termasuk penggunaan mode ionisasi negatif ESI untuk membantu dalam karakterisasi sampel
apel. Lima varietas apel, yaitu Red Starking, Kanzi, Royal Gala, Reinette dan Granny Smith,
dipelajari untuk lebih lanjut menunjukkan penerapan prosedur yang dikembangkan. Tabel 1
merangkum senyawa fenolik utama yang terdeteksi dan diidentifikasi dalam lima varietas
apel yang dipelajari menggunakan metodologi HILIC × RP-DAD-MS / MS yang
dioptimalkan. Selain itu, pada Gambar. 3 perbandingan antara profil khas yang diperoleh
untuk semua sampel ditampilkan. Seperti dapat diamati, komposisi fenolik dari semua sampel
didominasi oleh kehadiran sejumlah besar flavan-3-ols, terutama katekin dan epikatekin
(masing-masing puncak 1 dan 2) serta oligomer procyanidin hingga DP = 8. Selain itu, juga
dimungkinkan untuk menemukan beberapa dihydrochalcones (phloretin-glucoside, phloretin-
xilosyl-glucoside dan hydroxyphloretin-diglycoside, puncak 4, 6, 7, 11, 16, 18, 32), flavonol
(senyawa yang berhubungan dengan quercetin, puncak 3, 15, 17, 22-24) dan asam
hidroksisinamatik (asam dicaffeoylquinic, puncak 5). Identifikasi senyawa yang ada pada
sampel dilakukan berkat informasi yang diberikan oleh dua detektor yang digabungkan
secara seri, DAD dan MS, serta informasi yang dikumpulkan dari percobaan MS / MS dan
penggunaan standar komersial jika tersedia. Gambar. 4 menunjukkan beberapa contoh
bagaimana identifikasi dilakukan. Di antara flavan-3-ols, katekin dan epicatechin
diidentifikasi dengan benar karena deteksi ion karakteristik pada m / z 289,7 dan 289,5
(masing-masing [M − H] -). Senyawa ini dibedakan dengan membandingkan waktu retensi
yang sesuai dengan standar komersial yang tersedia. Dalam kasus dimer, trimers, dan
tetramer procyanidin, ion molekuler tipenya terdeteksi sebagai [M − H] - masing-masing
pada m / z 577, 865 dan 1153. Dalam setiap kasus, ion fragmen yang berbeda diproduksi
dalam percobaan MS / MS, yang mengkonfirmasi tugas; misalnya, dimer procyanidin
menyajikan fragmen pada m / z 425, sesuai dengan mekanisme retro-Diels-Alder ([M − H −
152] -) [33], serta ion dari monomer (m / z 289). Trimyan Procyanidin menyajikan ion
fragmen yang terkait dengan hilangnya unit phloroglucinol (m / z 739) serta hilangnya satu
atau dua (epi) molekul katekin, masing-masing, m / z 577 dan 289. Di sisi lain, tetramer
procyanidin terutama dicirikan oleh adanya ion yang berkaitan dengan oligomer yang lebih
pendek yang akan dibentuk setelah disosiasi tabrakan, seperti m / z 865 dan 577. Oligomer
procyanidin yang lebih lama tidak dapat dideteksi sebagai ion yang bermuatan tunggal.
Memang, pentamers procyanidin, hexamers dan heptamers terdeteksi sebagai ion bermuatan
ganda, seperti yang dapat diamati pada Tabel 1. Pentian procyanidin terdeteksi sebagai m / z
720 ([M − 2H] 2−) yang fragmenasinya memunculkan ion yang terkait dengan kehilangan
unit phloroglucinol, dan satu, dua atau tiga (epi) gugus katekin (m / z 1315, 1151, 863, 577,
masing-masing), seperti dapat diamati pada Gambar. 4A. Pola fragmentasi yang serupa
memungkinkan identifikasi ion pada m / z 864 dan 1008 ([M − 2H] 2−) masing-masing
sebagai heksametri dan heptam procyanidin. Terakhir dalam kelompok ini, dua oktan
procyanidin terdeteksi dalam beberapa sampel sebagai ([M − 3H] 3−) dengan m / z 768.

Mengenai sisa senyawa yang teridentifikasi, dua fosforososida secara tentatif diidentifikasi
(puncak 4 dan 6) sesuai dengan ion molekul utama yang terdeteksi pada m / z 435,6 ([M − H]
-) bersama-sama dengan adanya fragmen yang sesuai dengan kehilangan. dari heksosida ([M
− H − 162] -) yang sesuai dengan aglon phloretin (m / z 273). Fragmen lain di m / z 167 yang
berasal dari phloretin juga telah terdeteksi sebelumnya. Selain itu, spektra UV-vis puncak ini
mengkonfirmasi identifikasi yang menunjukkan maksimum absorbansi phloretin (285 nm)
serta perbandingan dengan standar komersial yang sesuai. Dihydrochalcones lain yang
diidentifikasi pada sampel adalah phloretin-xylosyl-glucoside (puncak 7, 11, 16 dan 18) dan
hydroxyphloretin-xylosyl-glucoside (puncak 32). Identifikasi senyawa-senyawa ini dilakukan
dengan cara yang sama seperti untuk phloretin-glukosida, berkat deteksi ion molekuler dan
fragmen yang sesuai serta dari spektra UV-vis yang diperoleh (lihat Gambar 4B). Di sisi lain,
enam flavonol terkait quercetin yang berbeda juga diidentifikasi sementara. Tiga dari mereka
berhubungan dengan glikosida kuersetin, yaitu puncak 15, 22 dan 23, meskipun puncak 15
secara tentatif ditugaskan ke kuersetin-galaktosida, sesuai dengan urutan elusi mereka. Ketiga
senyawa ini menunjukkan ion molekuler yang serupa pada m / z 463 ([M] H] -) dan
menghasilkan fragmen setelah MS / MS yang sesuai dengan kuersetin (m / z 301) serta
maksimum serapan UV-vis yang serupa pada 354 nm. Selain itu, dimungkinkan juga untuk
menetapkan puncak 3 untuk dihydroquercetin-rhamnoside berkat deteksi ion pada m / z 549
yang menghasilkan fragmen pada m / z 303. Demikian juga, quercetin-rhamnoside (puncak
17) dan quercertin rutinoside ( puncak 24) juga diidentifikasi. Semua senyawa ini telah
ditemukan dalam beberapa bahan yang berasal dari apel. Contoh pola fragmentasi ini
diilustrasikan dalam informasi pendukung (Gambar S1).

Bahan pelengkap yang berkaitan dengan artikel ini ditemukan, di

versi online, di http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2013.06.015.

Profil fenolik dasar dari lima varietas apel sangat mirip (lihat Gambar. 3), dibentuk oleh
kelompok-kelompok puncak yang termasuk dalam kelas kimia yang disebutkan di atas.
Namun demikian, hubungan di antara mereka tidak sama; yang menarik, apel Reinette
mengandung kelimpahan relatif lebih tinggi dari dihydrochalcone (puncak 4, 6, 7, 11, 16, 18
dan 32) daripada procyanidins. Di sisi lain, apel Granny Smith menyajikan sejumlah besar
puncak procyanidin yang berbeda dengan intensitas yang jauh lebih tinggi daripada flavonoid
lainnya. Selain itu, beberapa puncak karakteristik hanya dari satu varietas juga dapat
dideteksi. Pada Gambar. 5, plot 2D direkonstruksi disajikan di mana dimungkinkan untuk
mengamati senyawa yang hadir dalam semua sampel yang diteliti, serta yang penanda hanya
untuk satu sampel. Misalnya, dihydroquercitin-rhamnoside (puncak 3) dan quercetin-
rhamnoside (puncak 17) hanya ada di apel Kanzi. Apel Royal Gala memiliki dua puncak
procyanidin diferensial, tetramer (puncak 40) dan heptamer (puncak 62), sedangkan Red
Starking menyajikan procyanidin tetramer (puncak 33), pentamer (puncak 41), dua hexamers
(puncak 49 dan 55) serta quercetinrutinoside (puncak 24). Nenek Smith, memiliki tiga
oligomer prosianidin (puncak 52, 59 dan 60) yang tidak ada dalam sampel lain mana pun.
Dengan demikian, satu-satunya varietas apel yang tidak hadir setidaknya senyawa fenolik
diferensial adalah Reinette.

Untuk menilai perbedaan ini secara kuantitatif pada profil fenolik, dua tes in vitro dilakukan.
Pertama, jumlah total fenol yang ada pada sampel yang berbeda ditentukan mengikuti metode
Folin-Ciocalteu. Hasil yang diperoleh dirangkum dalam Tabel 2. Seperti yang dapat diamati,
varietas apel dengan kandungan fenol yang lebih tinggi adalah Reinette (6,46 mg GAE g − 1
dm) diikuti oleh Granny Smith dan Red Starking, sedangkan Kanzi disajikan sejauh jumlah
terendah total fenol (1,21 mg GAE g − 1 dm). Uji in vitro kedua, berdasarkan reaksi dengan
p-dimethylaminocinnamaldehyde (DMAC), digunakan untuk menentukan kandungan total
procyanidin dari sampel yang diteliti. DMAC telah terbukti bereaksi secara khusus dengan
flavanol, meningkatkan sensitivitas dan akurasi untuk penentuan procyanidin dibandingkan
dengan prosedur lain. Seperti dapat dilihat pada Tabel 2, Granny Smith adalah varietas apel
terkaya pada kelas senyawa ini, mencapai 0,73 mg ECE g − 1 d.m, diikuti oleh Reinette (0,56
mg ECE g − 1 d.m.). Sekali lagi, Kanzi adalah sampel dengan jumlah flavan-3-ons terendah.
Menariknya, seperti yang telah ditunjukkan sebelumnya dari analisis yang ditunjukkan pada
Gambar. 3, hubungan antara procyanidin dan senyawa fenolik lainnya tidak sama di antara
sampel. Faktanya, varietas apel Gambar 5. Plot 2D yang direkonstruksi dari senyawa fenolik
yang diidentifikasi dalam varietas apel yang diteliti menunjukkan senyawa yang ada di semua
sampel (bercak merah muda), di beberapa apel (bercak abu-abu) dan yang berbeda ditemukan
hanya dalam satu sampel. Kanzi, bintik-bintik kuning; Royal Gala, bintik-bintik hijau; Red
Starking, bintik-bintik merah; Nenek Smith, bintik oranye. Lingkaran mewakili pemisahan
procyanidins sesuai dengan tingkat polimerisasi (DP) mereka di dimensi pertama. (Untuk
interpretasi referensi warna pada legenda gambar ini, pembaca dirujuk ke versi web artikel.)
Dengan konten terkaya pada procyanidins adalah Royal Gala, dengan lebih dari 19% total
fenol yang sesuai dengan procyanidins; Granny Smith juga mengandung jumlah besar
procyanidins (13%) sedangkan Reinette adalah sampel dengan kelimpahan relatif terendah
dari procyanidins (8,7%), sesuai dengan analisis LC × LC yang sesuai. Hasil ini menguatkan
penerapan metodologi yang dikembangkan berdasarkan HILIC × RP-DAD-MS / MS, untuk
mengkarakterisasi sampel kompleks yang melibatkan sejumlah besar senyawa milik kelas
kimia yang berbeda. Perlu juga disebutkan bahwa waktu analisis total yang diperlukan untuk
mendapatkan profil senyawa fenolik lengkap dari setiap sampel adalah kurang dari 50 menit,
yang merupakan analisis yang agak cepat untuk metode dua dimensi yang komprehensif.
Faktanya, waktu analisis ini secara langsung sebanding dengan metode satu dimensi lainnya
yang bertujuan untuk pemisahan senyawa fenolik yang berbeda dalam apel yang memberikan
daya dan informasi pemisahan yang jauh lebih sedikit. Selain itu, metodologi HILIC × RP
yang dioptimalkan memungkinkan pemisahan oligomer procyanidin dalam dimensi pertama
menurut DP mereka, dan diferensiasi selanjutnya menggunakan dimensi kedua, seperti yang
dapat dilihat dengan jelas pada Gambar 5.

4. Kesimpulan

Dalam karya ini, profil fenolik varietas apel yang berbeda menggunakan LC dua dimensi
yang komprehensif ditunjukkan untuk pertama kalinya. Metode yang dikembangkan,
berdasarkan kopling HILIC × RP-DAD-MS / MS mampu memberikan plot 2D dari setiap
sampel dalam waktu kurang dari 50 menit, memungkinkan identifikasi tentatif ca. 65
senyawa pada setiap sampel yang diteliti, termasuk oligomer flavan-3-ol hingga DP = 8,
dihydrochalcone, flavonol dan asam fenolik. Dengan mendapatkan profil 2D ini,
perbandingan visual yang cepat memungkinkan untuk membedakan antara kelas senyawa
fenolik yang berbeda dalam satu kali, tergantung pada zona elusi dari bidang 2D di mana
mereka muncul. Di antara sampel yang diteliti, Reinette dan Granny Smith adalah kultivar
terkaya dalam hal total senyawa fenolik dan procyanidin. Dengan demikian, penerapan 2D
LC untuk profiling sampel makanan kompleks telah dibuktikan, membuka kemungkinan baru
untuk penerapan prosedur berdasarkan teknik ini untuk studi terkait target lainnya dan studi
terkait metabolomik non-target.

Ucapan Terima Kasih

M.H. ingin mengucapkan terima kasih kepada MICINN untuk kontrak penelitian "Ramón y
Cajal" nya. Para penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Proyek AGL2011-29857-
C03-01 dan LAPORAN INGENIO 2010 CSD2007-00063 FUN-C-FOOD (Ministerio de
Educación y Ciencia) atas dukungan keuangan.