BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Skrining dan Prediksi Fisikokimia Senyawa

Skrining dapat disebut sebagai uji pendahuluan dalam molecular docking

secara in silico. Tujuannya yaitu untuk memprediksi senyawa yang memiliki aktivitas

farmakologi, sehingga dapat diketahui struktur senyawa yang paling baik untuk dapat

berikatan dengan reseptor (Adnyani et al., 2019). Pada penelitian ini sampel yang

digunakan yaitu 35 senyawa hasil dari metabolite profilling UPLC-QToF-MS/MS

ekstrak etanol 96% daun C.cinerariifolium. Senyawa-senyawa yang terkandung pada

ekstrak daun tersebut telah dilaporkan memiliki aktivitas anti kanker secara in vitro

(Listiyana et al., 2019). Program atau aplikasi yang digunakan untuk skrining

senyawa pada penelitian ini yaitu SwissADME.

Pemilihan SwissADME sebagai physicochemical descriptor berkaitan dengan

kemampuannya mempresentasikan hasil prediksi dari banyak senyawa tersebut

kemudian memberikan rangkuman analisis sehingga lebih mudah dalam tahapan

analisis maupun pemilihan senyawa inklusi. Selain itu, aplikasi ini juga menampilkan

mode Boiled-Egg dimana tampilan tersebut memberikan gambaran sederhana

prediksi kemampuan senyawa dalam terabsorpsi hingga dapat menembus sawar darah

otak (Blood Brain Barrier). Selain itu, tampilan tersebut juga secara mudah untuk

mengetahui sifat P-glikoprotein (P-gp) dari senyawa tersebut (Daina et al., 2016).
 Parameter yang digunakan untuk skrining senyawa pada penelitian ini yaitu

tidak menembus sawar otak, P-gp non-substrat, dan memenuhi Hukum Lima

Lipinski. Sebelum dilakukan skrining secara in silico, setiap senyawa hasil dari

metabolite profilling UPLC-QToF-MS/MS ekstrak etanol 96% daun

C.cinerariifolium digambar terlebih dahulu menggunakan program ChemBioDraw

Ultra 12.0. Setelah itu, masing-masing Code SMILES senyawa tersebut disalin (copy)

pada program SwissADME. Code SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry

System) sendiri merupakan konversi senyawa kimia dalam bentuk notasi baris

sehingga dapat memberikan kemudahan pada proses komputerisasi pada klasifikasi

senyawa kimia (Witanto et al., 2019). Hasil skrining senyawa melalui Boiled-Egg

dapat dilihat pada gambar 5.1.

(A) (B)
Gambar 5.1 Hasil skrining senyawa dengan SwissADME (A) dan hasil senyawa yang lulus skrining
dengan SwissADME (B)

Keterangan:
Putih : probabilitas tinggi pada penyerapan saluran pencernaan
Kuning : probabilitas tinggi pada penetrasi otak
Coding biru (P-gp +) : P-gp substrat
Cding merah (P-gp -) : P-gp non-substrat
 Berdasarkan gambar 5.1 menunjukkan bahwa dari 35 senyawa yang lulus

skrining dengan parameter tidak menembus sawar darah otak, P-gp non-substrat, dan

memenuhi Hukum Lima Lipinski sebanyak 10 senyawa. Parameter kemampuan

senyawa dalam penembusan sawar otak penting untuk dipertimbangkan guna

membantu mengurangi efek samping dan toksisitas atau untuk meningkatkan khasiat

obat yang aktivitas farmakologisnya ada di dalam otak (Pires et al., 2015). Pada

penelitian ini diharapkan senyawa memiliki aktivitas farmakologis pada payudara

untuk menghambat ERα sehingga dipilihlah senyawa yang tidak dapat menembus

sawar darah otak. Parameter ini pada program SwissADME ditunjukkan dengan hasil

“No” pada BBB Permeant, sedangkan pada Bolied Egg (gambar 5.1) ditunjukkan

dengan letak senyawanya di luar bundaran kuning telur (Daina et al., 2016).

Parameter yang dapat diprediksi terkait distribusi obat selain penetrasi pada

sawar darah otak yaitu P-glikoprotein (P-gp). P-gp sendiri merupakan anggota dari

superfamili transporter ATP binding cassette (ABC), yang menentukan berbagai

penyerapan dan penembusan obat (Jeong and Chiou, 2006; Finch A, 2014). Dalam

sistem organ, P-gp berpengaruh terhadap absorbsi, distribusi, dan eliminasi obat

(Matheny, et al., 2001). Aktivitas P-gp sangat bergantung oleh ATP melalui

pembentukkan kompleks P-gp-ATP. Penghambatan aktivasi dan ekspresi P-gp

memegang peranan penting dalam keberhasilan terapi kanker (Zhou, et al., 2006).

Penghambatan aktivitas P-gp dapat melalui beberapa mekanisme, antara lain

penghambatan substrat P-gp secara langsung dengan berikatan pada Pgp-binding

domain dan penghambatan hidrolisis ATP oleh ATP-ase melalui ikatan substrat
dengan ATP (Kitagawa, 2006). Substrat dari P-gp sendiri dapat menyebabkan MDR

(Multidrug Resistant) pada kanker (Cui et al., 2019). Substrat pada transportasi P-gp

menunjukkan bahwa akumulasi sel-sel yang mengekspresikan protein akan

berkurang, sementara pada obat-obatan antikanker dapat mengakibatkan gangguan

penghambatan proliferasi (Muthiah et al., 2018). Sedangkan untuk pengembangan P-

gp inhibitor sendiri juga gagal untuk disetujui oleh FDA karena efek yang sangat

merugikan (Cui et al., 2019). Oleh karena itu, skrining pada penelitian menggunakan

parameter P-gp non substrat (Muhammad dan Malik, 2018). Pada program

SwissADME parameter ini ditunjukkan dengan hasil “No” pada P-gp substrate,

sedangkan pada Boiled Egg (gambar 5.1) ditunjukkan coding berwarna merah

(PGP−) (Daina et al., 2016).

Sedangkan obat pembanding pada penelitian ini yaitu tamoxifen dengan nama

IUPAC 2-{4-[(1Z)-1,2-diphenylbut-1-en-1-yl]phenoxy}ethyl)dimethylamine. Obat

tersebut sering digunakan sebagai inhibitor ERα pada kanker payudara. Tamoxifen

sendiri merupakan senyawa yang dikenal sebagai modulator reseptor estrogen selektif

yang bertindak sebagai agonis reseptor estrogen di beberapa jaringan dan sebagai

antagonis di jaringan lain. Tamoxifen bertindak sebagai antagonis dalam jaringan

payudara. Obat ini digunakan secara klinis sebagai agen pilihan untuk mengobati dan

mencegah kanker payudara (Seong et al., 2010). Hasil tamoxifen pada SwissADME

melalui Boiled-Egg ditunjukkan pada gambar 5.2.

 Gambar 5.2 Tamoxifen pada SwissADME

Berdasarkan gambar 5.2 menunjukkan bahwa tamoxifen memiliki absorbsi

yang rendah terhadap gastrointestinal dan bersifat P-gp substrat. Hal ini dikarenakan

tamoxifen yang diberikan secara oral mengalami metabolisme hati yang luas dan

kemudian mengalami ekskresi bilier. Pada manusia, jalur utama dalam

biotransformasi tamoxifen berlangsung melalui N-demethylation yang dikatalis

sebagian besar oleh enzim sitokrom P450 (CYP450), khususnya enzim 3A4 (Seong

et al., 2010). Biotransformasi yang dimediasi oleh CYP3A4 dan eflux aktif obat

terserap oleh P-gp merupakan penentu utama bioavaibilitas obat oral. Hal ini karena

CYP3A4 dan P-glikoprotein bekerja secara sinergis untuk membatasi bioavaibilitas

terhadap obat yang diberikan secara oral (Vishal R. Tandon et al., 2006). Penyebab

utama bioavaibilitas yang rendah pada tamoxifen oral, diantaranya first-pass

metabolism di usus atau di hati dan efluks yang dimediasi P-gp di usus (Seong et al.

2010). Nama dan code SMILES senyawa yang lulus skrining serta senyawa

pembandingnya dapat dilihat pada tabel 5.1.

Tabel 5.1 Profil code SMILES dan molekul 10 senyawa yang lulus skrining beserta
senyawa pembanding
Molekul Nama Senyawa Code SMILES

H
N

Molekul 1
C12=C(NCC2)C=CC=C1

Indoline
(2,3-dihydro-1H-indole)
NH3+ O

H
N
O-
Molekul 2 CCC(C)C([NH3+])C(NC(C)C([O-])=O)=O
O

Isoleucine-Alanine dipeptide
(2-[(2-amino-3-methylpentanoyl)amino]propanoic acid)
O O

NH2
Molekul 3 N N
H O=C(C1CN(C(C)=O)CCC1)NN

1-Acetyl-3-piperidinecarbohydrazide
OH

HO O
OC1=C(C2=CC=C(O)C=C2)OC3=C(C(O)=
Molekul 4 CC
OH
(O)=C3)C1=O
OH O

Kaempferol
(3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one) 
OH

OH O

OC1=C(C2=CC(OC)=C(O)C=C2)OC3=CC
O

Molekul 5
OH (O)=CC(O)=C3C1=O
OH O

Isorhamnetin
(3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)chromen-4-one  ) 

HO O

O=C1C(C2=CC=C(O)C=C2)=COC3=C1C
Molekul 6
OH O
(O)=CC(O)=C3
OH

Genistein
(5,7-dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one)

S N
N
N CC(N(CC1=C(Cl)SN=N1)C)C2=C(C)N=C
Molekul 7
N S (C(C)C)S2
Cl

N-[(5-Chloro-1,2,3-thiadiazol-4-yl)methyl]-1-(2-isopropyl-4-
methyl-1,3-thiazol-5-yl)-Nmethylethanamine

O O

O O
N
CC1N(C(C2=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C2)=
Molekul 8 O
N
O
O)CCN
O O (C(C3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3)=O)C1
(2-Methyl-1,4-piperazinediyl)bis[(3,4,5-
trimethoxyphenyl)methanone]
 O

O O

O O
CO/C=C(C(OC)=O)\C1=CC=CC=C1OC2=
NC=NC
Molekul 9 N N
(OC3=CC=CC=C3C#N)=C2
N

Azoxystrobin
(methyl (E)-2-[2-[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4-yl]oxyphenyl]-
3-methoxyprop-2-enoate) 
NH2

O
Molekul 10 HS S O=C[C@@H](N)CSSS
S
(2R)-2-Amino-3-Trisulfanylpropanal

Obat
CC\C(=C(/C1=CC=CC=C1)C1=CC=C(OC
Pemban-
N CN(C)C)C=C1)C1=CC=CC=C1
ding O

Tamoxifen
(2-{4-[(1Z)-1,2-diphenylbut-1-en-1-yl]phenoxy}-
ethyl)dimethylamine)

Parameter lain yang penting dalam pengembangan obat yaitu prediksi

fisikokimia dari suatu senyawa, dimana prediksi tersebut berdasarkan Hukum Lima

Lipinski (Hardjono, 2013). Hukum ini memprediksi kemiripan obat dari senyawa

kimia dengan aktivitas biologis tertentu yang dirancang untuk pemberian dengan rute

oral (Daina et al., 2016). Menurut hukum ini, senyawa obat harus memiliki berat

molekul kurang dari 500 g/mol, nilai log P kurang dari 5, nilai Hydrogen Bond

Donors (HBD) tidak lebih dari 5, dan nilai Hydrogen Bond Acceptors (HBA) tidak

lebih dari 10. Penelitian lebih lanjut telah menambahkan dua kriteria lagi untuk

membuat biovaibilitas oral suatu obat menjadi lebih baik. Kriteria tersebut antara

lain: Topological Polar Surface Area (TPSA) dengan nilai ≤140 Å dan ikatan

hidrogen yang berotasi (Torsion) dengan nilai ≤10 (Manto et al., 2018). Pada

program SwissADME senyawa yang memenuhi hukum ini ditunjukkan dengan hasil
“Yes; 0 violation” pada Lipinski (Daina et al., 2016). Hasil prediksi sifat fisikokimia

ditunjukkan pada tabel 5.2.

Tabel 5.2 Hasil penentuan sifat fisikokimia berdasarkan Hukum Lima Lipinski
terhadap senyawa yang lulus skrining dan tamoxifen dengan aplikasi SwissADME
Penerapan
Hukum
Parameter Hukum Lima Lipinski
Lima
Senyawa Lipinski
BM TPSA
Log P HBA HBD Torsion
(g/mol) (Å)

Indoline
119.16 1.73 0 1 12.03 0 Ya
(2,3-dihydro-1H-indole)
Isoleucine-Alanine dipeptide
(2-[(2-amino-3-methyl-
202.25 -1.53 3 2 96.87 6 Ya
pentanoyl)amino]propanoic
acid)
1-Acetyl-3-
185.22 -0.47 3 2 75.43 3 Ya
piperidinecarbohydrazide
Kaempferol
111.1
(3,5,7-trihydroxy-2-(4- 286.24 1.58 6 4
3
1 Ya
hydroxyphenyl)chromen-4-one)
Isorhamnetin
(3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxy- 120.3
316.26 1.65 7 4 2 Ya
3-methoxyphenyl)-chromen-4- 6
one )
Genistein
(5,7-dihydroxy-3-(4- 270.24 2.04 5 3 90.90 1 Ya
hydroxyphenyl)chromen-4-one)
N-[(5-Chloro-1,2,3-thiadiazol-4-
yl)methyl]-1-(2-isopropyl-4-
330.90 3.59 4 0 98.39 5 Ya
methyl-1,3-thiazol-5-yl)-
Nmethylethanamine
(2-Methyl-1,4-
piperazinediyl)bis[(3,4,5- 488.53 2.41 8 0 96.00 10 Ya
trimethoxyphenyl)methanone]
Azoxystrobin
(methyl (E)-2-[2-[6-(2-
103.5
cyanophenoxy)pyrimidin-4- 403.39 2.97 8 0
6
8 Ya
yl]oxyphenyl]-3-methoxyprop-2-
enoate)
(2R)-2-Amino-3- 132.4
169.29 0.34 2 1 4 Ya
Trisulfanylpropanal 9
Tamoxifen
(2-{4-[(1Z)-1,2-diphenylbut-1-
371.51 5.77 2 0 12.47 8 Tidak
en-1-yl]phenoxy}ethyl)-
dimethylamine)
Keterangan:
BM : Berat Molekul <500
Log P : Koefisien Partisi <5
Torsion : Ikatan H yang dapat berotasi ≤10
: tidak masuk parameter
Σ HBD : Jumlah atom OH dan NH <5
Σ HBA : Jumlah atom O dan N <10
TPSA : Topological Polar Surface Area ≤140Å

Hasil yang dipaparkan pada tabel 5.2 diatas, senyawa yang lulus skrining

memiliki berat molekul ≤500, log P ≤5, jumlah ikatan-H donor ≤5, ikatan-H aseptor

≤10, nilai torsion ≤10 dan nilai TPSA ≤140Å. Sehingga senyawa-senyawa tersebut

memenuhi Hukum Lima Lipinski dan dapat diprediksi bahwa senyawa tersebut

mudah untuk diabsorbsi, memiliki permeabilitas yang baik, dan mempunyai

bioavaibilitas oral yang baik.

Nilai berat molekul berkaitan dengan proses distribusi obat. Proses distribusi

obat terjadi dengan cara menembus membran biologis. Obat atau senyawa yang

memiliki bobot molekul kecil akan memudahkan untuk menembus membran

biologis, dan begitu juga sebaliknya (Narko et al., 2017). Dari 10 senyawa tersebut

yang nilai berat molekulnya paling tinggi yaitu (2-Methyl-1,4-

piperazinediyl)bis[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone], sedangkan senyawa yang

nilai berat molekulnya yang paling kecil yaitu Indoline. Hasil tersebut menunjukkan

bahwa berat molekul suatu senyawa tergantung pada jumlah atom yang

menyusunnya. Semakin banyak atom yang menyusunnya maka berat molekulnya

juga semakin besar, dan begitu juga sebaliknya (David, 2002).

Nilai Log P berkaitan dengan lipofilitas atau hidrofobisitas. Dalam

pengembangan bahan obat menjadi bentuk obat, koefisien partisi harus

dipertimbangkan terlebih dahulu, karena dalam konteks farmakokinetika, untuk obat

yang diabsorbsi melalui oral, secara normal harus melewati lipid bilayer (Narko et

al., 2017). Nilai Log P yang lebih besar dari 5 akan menyebabkan senyawa obat akan

cenderung memiliki tingkat toksisitas yang tinggi karena akan tertahan lebih lama

pada lipid bilayer dan terdistribusi lebih luas di dalam tubuh sehingga selektifitas

ikatan terhadap enzim target menjadi berkurang. Nilai Log P yang terlalu negatif juga

tidak baik karena molekul tersebut tidak dapat melewati membran lipid bilayer (La

Kilo et al., 2019). Dari 10 senyawa tersebut nilai Log P-nya kurang dari 5, namun

terdapat dua senyawa yang nilai Log P-nya negatif yaitu Isoleucine-Alanine

dipeptide dan 1-Acetyl-3-piperidine-carbohydrazide.

Nilai donor dan akseptor ikatan hidrogen berhubungan dengan aktivitas

biologis dari suatu molekul obat. Ikatan hidrogen dapat mempengaruhi sifat-sifat

kimia-fisika senyawa, seperti titik didih, titik lebur, dan kelarutan dalam air.

Perubahan sifat-sifat tersebut dapat berpengaruh terhadap aktivitas biologis senyawa

(Narko et al., 2017). Jumlah donor dan akseptor ikatan hidrogen mendeskripsikan

semakin tinggi kapasitas ikatan hidrogen, maka semakin tinggi energi yang

dibutuhkan agar proses absorpsi dapat terjadi (La Kilo et al., 2019). Jumlah donor

hidrogen dan akseptor ligan menentukan fleksibilitas dan kemampuan beradaptasi

ligan untuk mengikat dengan enzim target atau protein (Jamuna et al., 2018).

TPSA adalah area permukaan kutub molekuler dan mencirikan sifat

transportasi obat. Sehingga TPSA merupakan parameter penting yang menentukan

penyerapan obat, bioavailabilitas, permeabilitas, dan penetrasi. Parameter ini dihitung

dari luas permukaan ikatan hidrogen antara atom O dan N (Jamuna et al., 2018).
Sedangkan jumlah ikatan yang dapat diputar (torsion) juga penting untuk

dipertimbangkan dalam suatu senyawa. Molekul yang memiliki jumlah ikatan

rotatable lebih banyak menjadi lebih fleksibel dan memiliki ikatan yang baik dengan

daerah pengikat (Shekhar et al., 2018).

Dilakukan juga prediksi sifat fisikokimia terhadap tamoxifen, didapatkan

senyawa tersebut tidak memenuhi Hukum Lima Lipinski, karena Log P pada senyawa

tersebut lebih dari 5. Nilai Log P ini berhubungan dengan hidrofobisitas molekul

obat, semakin besar nilai log P maka semakin hidrofobik senyawa tersebut. Molekul

obat yang terlalu hidrofobik cenderung memiliki toksisitas yang lebih besar karena

akan tertahan lebih lama di lipid bilayer dan terdistribusi lebih luas di dalam tubuh

sehingga selektifitas ikatan terhadap enzim target menjadi berkurang (Harganingtyas,

2011). Namun, sebagian besar obat kanker tidak memenuhi standar Hukum Lima

Lipinski karena obat-obat tersebut dikembangkan sebelum Hukum Lima Lipinski

diterbitkan (Manto et al., 2018). Menurut Chander et al. (2017) menyatakan bahwa

95% obat yang telah disetujui secara klinis mempunyai nilai rata-rata sifat fisikokimia

sebagai berikut: Berat Molekul (130–725), HBD (0–6), HBA (2–20), Log P (-2

sampai 6.5), dan jumlah Torsion (0–15). Nilai Log P pada tamoxifen sebesar 5.77

sehingga obat tersebut dapat digunakan sebagai terapi antikanker payudara sampai

saat ini.

5.2 Hasil Docking dan Analisis Asam Amino

 Langkah selanjutnya adalah docking molecular dimana tujuannya untuk

mengetahui interaksi senyawa yang lulus skrining dengan protein reseptor. Interaksi

ligan (senyawa) dengan reseptor dapat divisualisasikan dengan metode komputasi dan

dapat digunakan untuk mengetahui farmakofor dari suatu senyawa (Ekins et al.,

2007).

Reseptor yang digunakan adalah reseptor 5W9C, dimana reseptor tersebut

dapat mempengaruhi pertumbuhan sel kanker melalui penghambatan reseptor

estrogen alfa. Simulai Docking dilakukan dengan menggunakan program Molegro

Virtual Docker (MVD) versi 6.0. Sebelum dilakukan simulasi Docking, terlebih

dahulu dilakukan preparasi protein target.

5.2.1 Preparasi Sampel In Silico

Preparasi terhadap sampel in silico menjadi langkah penting yang dilakukan

untuk memperoleh hasil analisis yang optimal (Muchtaridi et al., 2018). Proses

preparasi yang dilakukan dalam metode in silico adalah dengan melakukan preparasi

terhadap ligan maupun protein target yang akan digunakan dalam metode in silico

(Sliwoski et al., 2014). Sampel yang dipreparasi dalam penelitian ini adalah senyawa

yang lulus skrining dengan parameter-parameter tertentu serta protein ERα (5W9C)

dengan organisme Human dan ligan internal 4-Hydroxytamoxifen.

5.2.1.1 Pembuatan Struktur 3 Dimensi (3D) dan Penentuan Energi Minimal

Pembuatan struktur tiga dimensi dan penentuan energi minimalisasi dalam

penelitian ini menggunakan program Avogadro. Pada langkah ini, dilakukan juga

optimasi geometri tujuannya untuk memperbaiki struktur ligan dan posisi atom
 hidrogen. Minimasi energi ligan dilakukan dengan menggunakan medan gaya Merck

Molecular Forcefield 94 (MMFF94) dengan tujuan untuk mencari satu konformasi

senyawa terbaik atau yang paling stabil untuk dilakukan docking dengan reseptor

target (Adelina, 2014). Hasil struktur tiga dimensi (3D) dan minimalisasi energi

ditunjukkan pada tabel 5.3.

Tabel 5.3 Struktur 3D dan energi minimal senyawa lulus skrining dengan MMFF94
pada aplikasi Avogadro
Rerata (Kkal/mol)
Energi Minimal (Kkal/mol)
± SD
Senyawa Struktur 3D
Replikasi Replikasi Replikasi
I II III

H
N

22.4409 22.4409 22.4409 22.4409 ± 0.0000

Indoline
(2,3-dihydro-1H-indole)

NH3+ O

H
N
O-

Isoleucine-Alanine -9.6965 -9.6728 -9.6740 -9.6811 ± 0,0134

dipeptide
(2-[(2-amino-3-
methylpentanoyl)amino]pr
opanoic acid)

O O

NH2
N N
H
30.3958 30.3958 30.3936 30.3951 ± 0,0013
1-Acetyl-3-
piperidinecarbohydrazide

OH

HO O

OH

OH O 46.3660 46.3660 46.3660 46.3660 ± 0.0000

Kaempferol
(3,5,7-trihydroxy-2-(4-
hydroxyphenyl)chromen-4-
one) 
 OH

OH O
O

OH

OH O
68.8827 68.8827 68.8827 68.8827 ± 0.0000
Isorhamnetin
(3,5,7-trihydroxy-2-(4-
hydroxy-3-
methoxyphenyl)chromen-
4-one ) 
HO O

OH O

35.7237 35.7237 35.7237 35.7237 ± 0.0000

OH

Genistein
(5,7-dihydroxy-3-(4-
hydroxyphenyl)chromen-4-
one)

S N
N
N

N S
Cl

N-[(5-Chloro-1,2,3- 22.9374 22.9371 22.9373 22.9373 ± 0,0002

thiadiazol-4-yl)methyl]-1-
(2-isopropyl-4-methyl-1,3-
thiazol-5-yl)-
Nmethylethanamine

O O

O O
N

N
O O

O O

146.7422 146.5196 146.5662 146.6093 ± 0,1174

(2-Methyl-1,4-
piperazinediyl)bis[(3,4,5-
trimethoxyphenyl)methano
ne]

O O

O O

N N

Azoxystrobin 47.7714 47.7706 47.7702 47.7707 ± 0,0006

(methyl (E)-2-[2-[6-(2-
cyanophenoxy)pyrimidin-
4-yl]oxyphenyl]-3-
methoxyprop-2-enoate) 

NH2

HS S O
S 26.1367 26.1362 26.1362 26.1364 ± 0,0003
(2R)-2-Amino-3-
Trisulfanylpropanal
 N
O

Tamoxifen 103.0222 103.0222 103.0222 103.0222 ± 0.0000

(2-{4-[(1Z)-1,2-
diphenylbut-1-en-1-
yl]phenoxy}-
ethyl)dimethylamine)

Keterangan :
SD : standar devisiasi

Minimalisasi energi akan memberikan pengaturan posisi atom terbaik dalam

ruang untuk senyawa sehingga gaya inter-atom dan energi sterik setiap atom

mendekati nol dan posisi pada permukaan energi potensial adalah titik stasioner.

Konfirmasi struktur akan mempengaruhi sifat fisikokimia yang nyata dari suatu

senyawa. Selain itu, juga mempengaruhi skor docking yang menunjukkan afinitas

reseptor ligan (Yanuar, 2012).

5.2.1.2 Hasil Preparasi Protein 5W9C

Preparasi protein diunduh dari data file PDB (Protein Data Bank) melalui

(www.rcsb.org). Protein yang diunduh adalah protein ERα dengan kode 5W9C

dimana native ligand inhibitornya yaitu 4-Hydroxytamoxifen. Protein tersebut ditinjau

menggunakan program Molegro Virtual Docker (MVD) versi 6.0 (Gambar 5.3).

Gambar 5.3 Reseptor 5W9C

5.2.2 Hasil Penentuan Lubang (Cavity) dan Validasi Reseptor Estrogen alfa

(5W9C)

Hasil penentuan lubang (cavity) digunakan untuk mendeteksi tempat

berinteraksi antara ligan dan reseptor pada reseptor 5W9C. Cavity yang terdapat pada

reseptor ditunjukkan dengan warna hijau. Hasil penentuan cavity ditunjukkan pada

gambar 5.4.

1 7 7
6
6
3

2
4 8

5 8
9 5

(A) (B)
Gambar 5.4 Hasil deteksi lubang (cavity) pada reseptor 5W9C (A) dan Cavity dan ligand
native (B)

Keterangan:
Cavity 1 Vol= 592.384 Surface 1896.96
Cavity 2 Vol= 557.568 Surface 1939.20
Cavity 3 Vol= 152.576 Surface 527.36
Cavity 4 Vol= 146.432 Surface 550.40
Cavity 5 Vol= 145.920 Surface 371.20 (ligand native D)
Cavity 6 Vol= 143.872 Surface 334.08 (ligand native C)
Cavity 7 Vol= 128.000 Surface 280.32 (ligand native A)
Cavity 8 Vol= 123.904 Surface 279.04 (ligand native B)
Cavity 9 Vol= 117.248 Surface 436.48

Selanjutnya dilakukan validasi reseptor dengan menggunakan aplikasi

Molegro Virtual Docker versi 6.0. Caranya dengan melakukan docking ulang native

ligand pada lubang reseptor. Hasil validasi ditunjukkan dengan nilai Root Mean
Square Deviation (RMSD). Nilai RMSD sendiri merupakan pengukuran dua pose

dengan membandingkan posisi atom antara struktur eksperimental dengan struktur

yang didockingkan pada protein (Susanti et al., 2018). Reseptor dinyatakan valid dan

dapat dilakukan simulasi docking selanjutnya jika memiliki nilai RMSD ≤ 2 (Hevener

et al., 2009). Hasil validasi reseptor ditunjukkan pada tabel 5.4.

Tabel 5.4 Hasil validasi dan nilai RMSD

Rerata (Kkal/mol)
Cavity dan Parameter Docking Score
± SD
Ligand Native Score
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
RMSD 1.1121 1.0269 0.9673 1.0354 ± 0.0728
Cavity 7 dan
Rerank Score -117.9020 -107.8450 -109.7080 -111.8183 ± 5.3503
ligand A
Moldock Score -152.5310 -140.4840 -142.2780 -145.0977 ± 6.4996
RMSD 0.9557 0.9613 0.8874 0.9348 ± 0.0411
Cavity 8 dan
Rerank Score -125.4330 -105.8440 -106.7490 -112.6753 ± 11.0577
ligand B
Moldock Score -156.4940 -141.0630 -140.9080 -146.1550 ± 8.9542
RMSD 0.8021 0.7993 0.7492 0.7835 ± 0.0298
Cavity 6 dan
Rerank Score -112.6900 -112.6410 -110.2130 -111.8480 ± 1.4162
ligand C
Moldock Score -144.2720 -144.2040 -140.0480 -142.8413 ± 2.4193
RMSD 1.0834 1.0282 0.9557 1.0224 ± 0.0640
Cavity 5 dan
Rerank Score -120.8910 -117.2470 -116.2790 -118.1390 ± 2.4320
ligand D
Moldock Score -156.1920 -151.9590 -149.9130 -152.6880 ± 3.2023

Berdasarkan tabel 5.4 Reseptor 5W9C memiliki 4 protein yang berbeda

diantaranya yaitu 5W9C(A), 5W9C(B), 5W9C(C), dan 5W9C(D). Protein 5W9C(C)

merupakan protein yang digunakan untuk proses docking karena memiliki nilai rata-

rata RMSD paling rendah yaitu 0.7835 ± 0.0298. Semakin kecil nilai RMSD yang

diperoleh menunjukkan bahwa pose ligand yang diprediksi semakin baik karena

semakin mendekati konformasi native ligand (Susanti et al., 2018). Sehingga lubang

(cavity) yang digunakan yaitu cavity 6 dengan volume 143.872 dan luas permukaan

334.08. Lubang tersebut digunakan karena mempunyai native ligand yang berikatan
 dengan reseptor dan mempunya nilai RMSD paling kecil diantara lainnya, sehingga

mempunyai potensi sebagai lubang aktif reseptor.

5.2.3 Hasil Perolehan Docking Score

Hasil simulasi docking dapat dilihat dari rerata nilai scoring yang didapatkan.

Digunakan tiga paramater yaitu MolDock Score, Rerank Score, dan Ikatan

Hidrogennya. Nilai dari ketiga parameter tersebut merupakan skor yang dapat

mengukur kekuatan ikatan obat-reseptor (CLCbio, 2013). Energi ikatan juga dapat

digunakan sebagai prediksi aktivitas senyawa. Energi ikatan antara ligan dan reseptor

dapat dilihat melalui Rerank Score (Nugroho, 2014). Hasil docking score yang

diperoleh pada penelitian ini ditunjukkan pada tabel 5.5.

Tabel 5.5 Hasil Docking score senyawa yang lulus skrining dan Tamoxifen terhadap
reseptor 5W9C
Docking Score
Parameter Rerata
Reseptor Senyawa
Score Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 (Kkal/mol) ± SD
(Kkal/mol) (Kkal/mol) (Kkal/mol)
MolDock
-55.0174 -55.0441 -55.0324 -55.0313 ± 0.0134
Indoline Score
(2,3-dihydro-1H-indole) Rerank Score -47.0328 -46.9624 -46.9532 -46.9828 ± 0.0435
H-Bond 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
Isoleucine-Alanine dipeptide MolDock
-95.4765 -95.3436 -92.0734 -94.29783 ± 1.9276
(2-[(2-amino-3-methyl- Score
pentanoyl)amino]propanoic Rerank Score -72.2991 -71.8585 -71.9138 -72.0238 ± 0.2400
acid) H-Bond -0.0821 -0.1376 -1.3387 -0.51945 ± 0.7100
MolDock
-69.9966 -69.9670 -69.9632 -69.9756 ± 0.0183
1-Acetyl-3- Score
5W9C piperidinecarbohydrazide Rerank Score -59.9596 -59.5168 -59.4989 -59.6584 ± 0.2610
(C) H-Bond 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
Kaempferol MolDock
-98.7382 -98.8634 -98.9896 -98.8640 ± 0.1257
(3,5,7-trihydroxy-2-(4- Score
hydroxyphenyl)chromen-4- Rerank Score -77.2111 -77.4862 -77.3265 -77.3413 ± 0.1381
one) H-Bond -6.4419 -6.5636 -6.5742 -6.5265 ± 0.0735
Isorhamnetin MolDock
-116.2240 -116.3650 -116.2970 -116.2953 ± 0.0705
(3,5,7-trihydroxy-2-(4- Score
hydroxy-3-methoxyphenyl)- Rerank Score -88.5642 -88.7046 -88.6143 -88.6277 ± 0.0712
chromen-4-one ) H-Bond -6.5401 -6.6227 -6.5799 -6.5809 ± 0.0413
Genistein MolDock -90.2977 -90.3762 -90.2730 -90.3156 ± 0.0539
(5,7-dihydroxy-3-(4- Score
 hydroxyphenyl)chromen-4- Rerank Score -74.2174 -74.1646 -74.1180 -74.1667 ± 0.0497
one) H-Bond -10.3815 -10.4388 -10.4153 -10.4119 ± 0.0288
N-[(5-Chloro-1,2,3- MolDock
-116.0640 -116.9280 -116.9090 -116.6337 ± 0.4934
thiadiazol-4-yl)methyl]-1-(2- Score
isopropyl-4-methyl-1,3- Rerank Score -90.7658 -92.3319 -92.4695 -91.8557 ± 0.9464
thiazol-5-yl)-
Nmethylethanamine H-Bond 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
(2-Methyl-1,4- MolDock
-130.6140 -137.9930 -129.5570 -132.7213 ± 4.5959
piperazinediyl)bis[(3,4,5- Score
trimethoxyphenyl)methanone Rerank Score -107.2360 -105.6720 -109.5410 -107.4830 ± 1.9463
] H-Bond 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
Azoxystrobin MolDock
-143.2550 -140.9110 -139.0820 -141.0827 ± 2.0918
(methyl (E)-2-[2-[6-(2- Score
cyanophenoxy)pyrimidin-4- Rerank Score -99.1936 -97.6804 -93.6864 -96.8537 ± 2.8452
yl]oxyphenyl]-3-
methoxyprop-2-enoate) H-Bond -1.4902 -0.5150 -0.7170 -0.9074 ± 0.5147
MolDock
-61.5633 -61.5541 -61.5379 -61.5518 ± 0.0129
(2R)-2-Amino-3- Score
Trisulfanylpropanal Rerank Score -50.0094 -50.0439 -50.1939 -50.0824 ± 0.0981
H-Bond -6.9982 -6.9571 -7.0070 -6.98741 ± 0.0266
Tamoxifen MolDock
-138.0060 -137.5150 -137.8670 -137.7960 ± 0.2531
(2-{4-[(1Z)-1,2-diphenylbut- Score
1-en-1-yl]phenoxy}- Rerank Score -94.8686 -93.1508 -94.5917 -94.2037 ± 0.9223
ethyl)dimethylamine) H-Bond 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
MolDock
-144.2720 -144.2040 -140.0480 -142.8413 ± 2.4193
Ligand Native Score
(4-Hydroxytamoxifen) Rerank Score -112.6900 -112.6410 -110.2130 -111.8480 ± 1.4162
H-Bond -3.9340 -3.7668 -3.3895 -3.6968 ± 0,2789
Keterangan:
: Moldock Score (Kkal/mol)

: Rerank Score (Kkal/mol)

: H-Bond (Kkal/mol)

Fungsi skor docking dari Moldock yaitu perluasan dari Piecewise Linier

Potensial (PLP) termasuk mempertimbangkan arah ikatan hidrogen dan interaksi

elektrostatik. MolDock Scoring hanya mengevaluasi geometri sudut ikatan hidrogen

dimana posisi hidrogennya tetap (tidak dapat diputar). Untuk lebih meningkatkan

akurasi docking, fungsi re-rank scoring diperkenalkan, dimana dapat

mengidentifikasi penyelesaian docking yang paling diharapkan dari penyelesaian

yang diperoleh pada algoritma docking (Thomsen dan Christensen, 2006). Rerank
Score atau energi ikatan sendiri merupakan perhitungan total dari semua ikatan yang

ada. Energi ikatan menyatakan jumlah energi yang diperlukan untuk mengadakan

interaksi antara ligan-reseptor (Nugroho, 2014). Nilai Rerank Score yang diperoleh

dapat digunakan untuk mengevaluasi kualitas docking, mencari konformasi ligan

yang relevan dengan melihat nilai terendah, dan dapat juga memprediksikan

afinitasnya (Guedes et al., 2014).

Berdasarkan hasil Rerank Score sepuluh senyawa yang terdapat pada tabel

5.5, senyawa yang memiliki nilai rerank score yang paling kecil yaitu (2-Methyl-1,4-

piperazinediyl)bis[(3,4,5-trimethoxyphenyl)-methanone]. Hal ini berarti senyawa

tersebut mempunyai afinitas lebih tinggi dibandingkan senyawa yang lain. Menurut

Hardjono (2016) Rerank Score merupakan energi ikatan yang ditunjukkan melalui

adanya jumlah energi yang dibutuhkan untuk membentuk ikatan antara ligan dan

reseptor. Semakin kecil nilai energi ikatan yang didapatkan maka ikatan tersebut

semakin stabil, dan jika semakin stabil ikatan ligan dengan reseptor maka bisa

dikatakan bahwa aktivitas senyawa tersebut semakin besar. Sedangkan H-bond

merupakan energi ikatan hidrogen antara protein dan ligan (dihitung dengan PLP).

Optimasi H-Bonds dapat mengoptimalkan posisi hidrogen untuk mendonorkan

atomnya (baik di ligan maupun protein). Ikatan dianggap sebagai ikatan hidrogen jika

salah satu atom dapat menyumbangkan atom hidrogen dan atom lainnya dapat

menerimanya (Thomsen dan Christensen, 2006).

5.2.4 Hasil Interaksi Ligan dengan Asam Amino

 Terdapat interaksi ligan dengan beberapa asam amino yang aktif dari reseptor

5W9C. Salah satu sifat dari reseptor yaitu terdiri dari asam amino yang akan

berinteraksi dengan ligan sehingga dapat menentukan interaksi yang terjadi pada

ikatan ligan dengan asam amino (Yahalom et al., 2011; Khazanov dan karlson, 2013).

Hasil docking native ligand 4-Hydroxytamoxifen, ligan uji senyawa yang lulus

skrining dan ikatan dengan asam amino ditunjukkan pada gambar 5.5 dan gambar 5.6

serta pada tabel 5.6.

(A) (B)
Gambar 5.5 Hasil docking senyawa (2-Methyl-1,4-piperazinediyl)bis[(3,4,5-trimethoxyphenyl)-
methanone] (putih), Azoxyatrobin (biru), Kaempferol (hijau tua), Genestein (kuning kecoklatan), 1-
Acetyl-3-piperidinecarbohydrazide (biru muda), (2R)-2-Amino-3-Trisulfanylpropanal (merah muda),
Isoleucine-Alanine dipeptide (hijau), Indoline (putih), N-[(5-Chloro-1,2,3-thiadiazol-4-yl)methyl]-1-
(2-isopropyl-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)-N-methylethanamine (ungu), Isorhamnetin (coklat kemerahan),
Tamoxifen (merah), dan native ligand (biru nyala) terhadap reseptor 5W9C(C) (A). Hasil docking 10
senyawa yang lulus skrining, Tamoxifen dan native ligand terhadap reseptor 5W9C(C) dengan residu
asam amino ditunjukkan stick style dan ligan dengan Wireframe style with colour by chain (B)

(A) (B) (C)

 (D) (E) (F)

(G) (H) (I)

(J) (K) (L)

Gambar 5.6 Bentuk 2 Dimensi senyawa ligand native (A), Tamoxifen (B), (2-Methyl-1,4-
piperazinediyl)bis[(3,4,5-trimethoxyphenyl)-methanone] (C), Azoxyatrobin (D), Kaempferol (E),
Genestein (F), 1-Acetyl-3-piperidinecarbo-hydrazide (G), (2R)-2-Amino-3-Trisulfanylpropanal (H),
Isoleucine-Alanine dipeptide (I), Indoline (J), N-[(5-Chloro-1,2,3-thiadiazol-4-yl)methyl]-1-(2-
isopropyl-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)-N-methylethanamine (K), Isorhamnetin (L) dengan reseptor
5W9C(C) dimana garis biru sebagai ikatan hidrogen, garis merah sebagai ikatan sterik, dan garis hijau
sebagai ikatan elektrostatik

Tabel 5.6 Profil asam amino dan gugus fungsi yang terlibat dalam ikatan hidrogen
dan interaksi sterik pada reseptor 5W9C (C)
Interaksi Hidrogen Interaksi Sterik Interaksi Elektrostatik
Senyawa
Asam Jarak Gugus Asam Jarak Gugus Asam Jarak Gugus
Amino (Å) Ligan Amino (Å) Ligan Amino (Å) Ligan
Indoline Leu Atom N
- - - - - -
(2,3-dihydro-1H-indole) 387(C) Nomor 0
Isoleucine-Alanine Glu 2.67 Atom N Ala Atom C Glu 2.67 & Atom N
3.18
dipeptide 353(C) Nomor 7 350(C) Nomor 11 353(C) 4.32 Nomor 7
(2-[(2-amino-3-methyl- Leu Atom O
3.16
pentanoyl)amino]propanoi 349(C) Nomor 12
c acid) Glu - Atom N
 353(C) Nomor 7
Leu Atom O
-
346(C) Nomor 13
Val Atom C
3.09
533(C) Nomor 5
Asp Atom C
3.15
1-Acetyl-3- 351(C) Nomor 5
piperidinecarbohydrazide - - - Trp Atom C - - -
3.17
383(C) Nomor 12
Atom N
Leu
- Nomor 9
346(C)
Leu Atom O
3.12
Glu Atom O 391(C) Nomor 7
2.60
353(C) Nomor 10 Leu Atom O
2.98
384(C) Nomor 2
Thr Atom C
3.08
Kaempferol Arg Atom O 347(C) Nomor 19
2.62
(3,5,7-trihydroxy-2-(4- 394(C) Nomor 10 Ala Atom O
3.03 - - -
hydroxyphenyl)chromen-4- 350(C) Nomor 13
one) Arg Atom O
-
394(C) Nomor 10
Thr Atom O Glu Atom O
3.03 -
347(C) Nomor 18 353(C) Nomor 10
Leu Atom O
-
387(C) Nomor 7
Thr Atom C
Thr 3.07
2.97 Atom O 347(C) Nomor 14
347(C)
Nomor 19 Leu Atom O
3.11
384(C) Nomor 16
Leu Atom O
Isorhamnetin 3.01
Glu Atom O 391(C) Nomor 17
(3,5,7-trihydroxy-2-(4- 2.60
353(C) Nomor 18 Ala Atom O
hydroxy-3- 3.14 - - -
350(C) Nomor 9
methoxyphenyl)-chromen-
Leu Atom O
4-one  ) -
387(C) Nomor 17
Arg Atom O Glu Atom O
2.61 -
394(C) Nomor 18 353(C) Nomor 18
Arg Atom O
-
394(C) Nomor 18
Glu Atom O Leu Atom C
3.10 2.98
353(C) Nomor 9 387(C) Nomor 10
Arg Atom O
-
Arg Atom O 394(C) Nomor 9
2.58
394(C) Nomor 9 Glu Atom O
-
Genistein 353(C) Nomor 9
(5,7-dihydroxy-3-(4- Ala Atom O
- - - -
hydroxyphenyl)chromen-4- Gly Atom O 350(C) Nomor 6
3.10
one) 521(C) Nomor 17 Leu Atom O
-
346(C) Nomor 6
Gly Atom O
-
His Atom O 521(C) Nomor 17
3.10
524(C) Nomor 17 His Atom O
-
524(C) Nomor 17
Leu Atom S
N-[(5-Chloro-1,2,3- 3.08
349(C) Nomor 14
thiadiazol-4-yl)methyl]-1-
Thr Atom N Leu Atom N
(2-isopropyl-4-methyl-1,3- 3.32 3.19 - - -
347(C) Nomor 4 346(C) Nomor 15
thiazol-5-yl)-
Thr Atom N
Nmethylethanamine -
347(C) Nomor 4
(2-Methyl-1,4- Thr 3.35 Atom O Asp 3.04 & Atom C - - -
piperazinediyl)bis[(3,4,5- 347(C) Nomor 22 351(C) 3.15 Nomor 28
 Atom C
3.00
Nomor 27
Atom O
3.00
Leu Nomor 31
354(C) Atom C
3.06
Nomor 32
Atom C
2.99
Nomor 23
Val Atom C
3.02
533(C) Nomor 27
Atom C
2.67
Nomor 28
Trp Atom O
2.90
383(C) Nomor 33
trimethoxyphenyl)methano Atom O
3.12
ne] Ala Nomor 33
350(C) Atom C
2.98
Nomor 2
Atom C
2.81
Thr Nomor 4
347(C) Atom O
3.01
Nomor 22
Leu Atom C
3.18
525(C) Nomor 5
Asn Atom O
2.69
532(C) Nomor 29
Leu Atom C
3.16
346(C) Nomor 10
Leu Atom C
2.94
387(C) Nomor 18
Ile Atom O
2.94
424(C) Nomor 24
Phe 2.67 & Atom N
404(C) 3.19 Nomor 16
Azoxystrobin
Leu Atom O
(methyl (E)-2-[2-[6-(2- 3.11
Arg Atom O 346(C) Nomor 14
cyanophenoxy)pyrimidin- 3.11 - - -
394(C) Nomor 11 Met Atom O
4-yl]oxyphenyl]-3- 3.18
388(C) Nomor 9
methoxyprop-2-enoate)
Arg Atom O
-
394(C) Nomor 13
His Atom N
-
524(C) Nomor 29
Leu Atom S Leu Atom S
3.10 -
346(C) Nomor 4 346(C) Nomor 4
(2R)-2-Amino-3- Arg Atom O Glu Atom N
2.62 - - - -
Trisulfanylpropanal 394(C) Nomor 3 353(C) Nomor 7
Glu Atom N Arg Atom O
2.60 -
353(C) Nomor 7 394(C) Nomor 3
Tamoxifen
(2-{4-[(1Z)-1,2-
Asp Atom N Asp Atom N
diphenylbut-1-en-1- - - - 2.88 2.88
351(C) Nomor 0 351(C) Nomor 0
yl]phenoxy}-
ethyl)dimethylamine)
4-Hydroxytamoxifen Atom C Asp 2.55 & Atom N
3.07
(Ligand Native) Glu Atom O Asp Nomor 26 351(C) 3.70 Nomor
3.10
353(C) Nomor 14 351(C) Atom N 24
2.55
Nomor 24
Arg 2.59 Atom O Val Atom C
2.75
394(C) Nomor 14 533(C) Nomor 26
Glu Atom O
-
353(C) Nomor 14
Arg - Atom O
 394(C) Nomor 14
Keterangan:
: Asam amino yang sama dengan ligand native reseptor estrogen alfa 5W9C (C)

Asam amino merupakan nutrisi dalam semua sel hidup dan penting untuk

proliferasi serta pemeliharaan sel tumor. Sel-sel tumor memiliki permintaan asam

amino yang lebih besar dari pada sel-sel normal karena mereka berkembang biak

lebih cepat (Jin et al., 2018). Pada docking ini diperoleh tiga interaksi antara lain

interaksi hidrogen, interaksi sterik, dan interaksi elektrostatik. Ikatan hidrogen sendiri

merupakan salah satu ikatan nonkovalen yang banyak terdapat dalam sistem biologis,

misalnya protein dan asam nukleat. Ikatan ini penting untuk dipertimbangkan karena

pada umumnya interaksi molekuler yang terjadi di dalam tubuh berupa interaksi

nonkovalen, yaitu interaksi antar atom yang tidak terikat secara kovalen satu sama

lain. Dengan adanya ikatan hidrogen dapat mempengaruhi aktivitas sifat kimia fisika

seperti titik didih, titik lebur, kelarutan dalam air, dan kemampuan pembentukan

khelat (Siswandono, 2000).

Ikatan hidrogen memiliki peran yang penting dalam menentukan besar

kecilnya nilai binding affinity yang dihasilkan dari proses docking karena memiliki

energi yang tinggi dari pada ikatan sterik dan ikatan elektrostatik (Fitriah, 2013).

Ikatan hidrogen terjadi antara atom H yang melekat pada atom elektronegatif dengan

atom elektronegatif dengan jarak ikatan 1,72 - 2,85 Å (Mustarichie et al., 2014).

Menurut Shiau dkk (1998) dan Anita dkk (2012) menyebutkan bahwa ikatan

hidrogen berperan penting dalam menentukan kekuatan interaksi ligan dengan ERα
apabila berikatan pada residu asam amino Glu 353, Arg 394, Thr 347, dan Asp 351.

Diduga ke-empat residu tersebut merupakan residu kunci agar interaksi ligan dan

reseptor estrogen menjadi lebih stabil. Berdasarkan hasil visualisasi, pada native

ligand 4-Hydroxytamoxifen mengikat dua residu kunci, yaitu Glu 353(C) dan Arg

394(C). Senyawa yang mengikat asam amino sama seperti native ligand pada

interaksi hidrogen antara lain: (2R)-2-Amino-3-Trisulfanylpropanal, Azoxystrobin,

Genestein, Isorhamnetin, Kaempferol, dan Isoleucine-Alanine dipeptide. Sedangkan

untuk obat pembanding (Tamoxifen) tidak mengikat asam amino Glu 353(C) dan Arg

394(C) pada interaksi hidrogen.

Glutamin adalah asam amino non-esensial untuk sel normal. Namun, sel

kanker yang berproliferasi menggunakan glutamin sebagai substrat penting untuk

sumber energi, serta untuk pembentukan nukleotida, lipid, dan protein. Glutamin

mendukung proliferasi dan perkembangan sel kanker (Jin et al., 2018). Sedangkan

interkasi molekul pada Arg394 diasumsikan sebagai ikatan yang bertanggung jawab

terhadap aktivitas antagonis secara kimia komputasi dimana memiliki potensi

aktivitas farmakologi sebagai inhibitor kanker payudara ERα+ (Zein et al., 2016).

Ikatan sterik disebut juga sebagai ikatan Van der Waals. Asam amino pada

ikatan sterik lebih dapat menstabilkan suatu ikatan, karena ikatan sterik (Van der

Waals) ketika terdapat dua atom yang saling berdekatan akan membentuk gaya tarik

yang lemah dan non spesifik. Interaksi ini kekuatanya akan berkurang derastis ketika

jarak molekul meningkat. Ikatan sterik dapat memberikan tempat bagi interaksi

hidrogen dengan asam amino yang aktif. Suatu ikatan sterik sangat mempengaruhi
ikatan hidrogen yang terjadi (Muchtaridi et al, 2018). Ikatan sterik yang terdapat pada

native ligand yaitu Asp 351(C), Val 533(C), Glu 353(C) dan Arg 394(C). Senyawa

yang mengikat asam amino sama seperti native ligand pada interaksi sterik antara

lain: (2R)-2-Amino-3-Trisulfanylpropanal, Azoxystrobin, (2-Methyl-1,4-

piperazinediyl)bis[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone], Genestein, Isorhamnetin,

Kaempferol, 1-Acetyl-3-piperidinecarbohydrazide, dan Isoleucine-Alanine dipeptide.

Untuk interaksi sterik pada tamoxifen hanya mengikat asam amino Asp 351(C).

Pengikatan asam amino Asp351 menggambarkan modulasi aksi SERM melalui

spektrum kompleks estrogenik dan antiestrogenik (Craig et al., 2015).

Interaksi elestrostatik merupakan interaksi antara atom yang disebabkan

perbedaan kepolarannya. Interaksi ini termasuk interaksi yang lemah dan bersifat non

kovalen sehingga mudah lepas, tetapi karena jumlahnya yang banyak, interaksi

elektrostatik memiliki kontribusi yang besar dalam pembentukan konformasi protein

yang stabil (Arwansyah dan Hasrianti, 2014). Asam amino yang diikat oleh native

ligand dan obat pembanding hanyalah Asp 351(C) sedangkan pada ligan yang diuji

tidak ada satupun yang mengikat asam amino Asp 351(C).

Adanya kesamaan asam amino pada ligan uji, obat pembanding dan native

ligand didapatkan bahwa asam amino tersebut merupakan sisi aktif pada reseptor

5W9C(C), sehingga dapat diprediksi senyawa tersebut memiliki aktivitas yang sama

dengan native ligand maupun obat pembanding. Native ligand (4-hydroxytamoxifen)

disebut sebagai penghambat ER-α kuat yang dapat memperlambat tingkat proliferasi

sel-sel kanker pada kanker payudara ER-α-positif (Rizki dan Sutomo, 2018).
Sehingga senyawa uji yang mengikat asam amino yang sama dengan ligand native

termasuk penghambat ERα yang kuat.

Selain itu, gugus fungsi ligan dan jarak ikatan dari ligan-reseptor juga

berperan penting dalam pengikatan terhadap residu reseptor ERα sehingga dapat

menentukan stabilitas ligan berinteraksi dengan reseptor (Arwansyah dan Hasrianti,

2014). Jarak ikatan ligan dengan asam amino reseptor akan mempengaruhi afinitas

ikatan antara ligan dengan reseptor (Mumpuni et al., 2015). Semakin besar jarak

ikatan tersebut, maka ikatan akan semakin mudah terputus, sebaliknya jika jarak

ikatan semakin kecil, maka ikatan tersebut akan semakin kuat dan semakin besar

afinitas ikatannya (Arcinthya et al., 2015).

5.3 Prediksi Toksisitas secara In Silico

Langkah selanjutnya adalah untuk memprediksi toksisitas senyawa yang lulus

skrining. Berdasarkan Globally Harmonized System (GHS) kelas toksisitas dapat

dibagi menjadi kelas tosisitas 1 hingga 6. Ke-enam kelas toksisitas tersebut

menggunakan ambang batas LD50 dari 5, 50, 300, 2000 dan 5000 mg/kg berat badan

(Drwal et al, 2014). Prediksi toksisitas menggunakan parameter LD50, uji mutagenik

AMES, hepatotoxicity, skin sensitization dan kelas toksisitas dengan aplikasi Protox

II online tool dan pkCSM online tool hasil ditunjukkan pada tabel 5.7.

Tabel 5.7 Prediksi toksisitas menggunakan Protox II online dan pkCSM online tool
Senyawa Toksisitas
LD50 Kelas Uji Toksik Sensitivitas
(mg/kg)* Toksisitas* Mutagenik terhada Kulit**
AMES** p
 Hepar**
Indoline
1250 4 Tidak Tidak Iya
(2,3-dihydro-1H-indole)
Isoleucine-Alanine dipeptide
(2-[(2-amino-3-methyl- 3750 5 Tidak Tidak Tidak
pentanoyl)amino]propanoic acid)
1-Acetyl-3-
650 4 Iya Iya Tidak
piperidinecarbohydrazide
Kaempferol
(3,5,7-trihydroxy-2-(4-
3919 5 Tidak Tidak Tidak
hydroxyphenyl)chromen-4-one)

Isorhamnetin
(3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxy-3- 5000 5 Tidak Tidak Tidak
methoxyphenyl)-chromen-4-one )
Genistein
(5,7-dihydroxy-3-(4- 2500 5 Tidak Tidak Tidak
hydroxyphenyl)chromen-4-one)
N-[(5-Chloro-1,2,3-thiadiazol-4-
yl)methyl]-1-(2-isopropyl-4-
200 3 Tidak Iya Tidak
methyl-1,3-thiazol-5-yl)-
Nmethylethanamine
(2-Methyl-1,4-
piperazinediyl)bis[(3,4,5- 1000 4 Tidak Tidak Tidak
trimethoxyphenyl)methanone]
Azoxystrobin
(methyl (E)-2-[2-[6-(2-
cyanophenoxy)pyrimidin-4- 500 4 Tidak Iya Tidak
yl]oxyphenyl]-3-methoxyprop-2-
enoate)
(2R)-2-Amino-3-
156 3 Tidak Tidak Iya
Trisulfanylpropanal
Tamoxifen (2-{4-[(1Z)-1,2-
diphenylbut-1-en-1-yl]phenoxy}- 1190 4 Iya Tidak Tidak
ethyl)dimethylamine)
Keterangan :
* Menggunakan Protox II Online Tool
** Menggunakan pkCSM Online Tool

LD50 merupakan jumlah senyawa yang diberikan dimana dapat menyebabkan

kematian 50% kelompok hewan coba. Untuk menentukan toksisitas senyawa dapat

dilakukan dengan uji Ames Toxicity, metode yang digunakan secara luas untuk

menilai potensi mutagenik senyawa dengan menggunakan bakteri. Hasil uji positif
menunjukkan bahwa senyawa tersebut bersifat mutagenik dan oleh karena itu dapat

bertindak sebagai karsinogen (Kesuma et al., 2018). Untuk mengetahui obat tersebut

tidak merusak hati menggunakan uji hepatotoxicity. Sedangkan untuk mengetahui

senyawa dapat mengiritasi kulit dapat menggunakn uji skin sensitization.

Berdasarkan tabel 5.7, senyawa yang tergolong kelas toksisitas 5 (2000 < LD50

≤ 5000) dimana menururt klasifikasi GHS tergolong obat yang toksisitasnya rendah,

tidak toksik terhadap hepar, tidak menimbulkan toksisitas pada bakteri, dan tidak

mengakibatkan sensitivitas terhadap kulit yaitu Isoleucine-Alanine dipeptide,

Kaempferol, Isoharmnetin, dan Genestein. Dalam klasifikasi tingkatan toksik dalam

GHS (the globally harmonized system of classification and labelling of chemicals)

disebutkan bahwa di atas dosis 2.000 mg/kgBB termasuk dalam kategori toksisitas

yang rendah dan sudah tidak terdapat simbol atau tanda peringatan keamanan dalam

pelabelan yang perlu dicantumkan (Makiyah dan Tresnayanti, 2017).

Sedangkan nilai LD50 dari obat pembanding (tamoxifen) pada penelitian ini

sebesar 1190 mg/kg hal ini dapat dikategorika kelas 4 pada toksisitas. Menurut Hodge

dan Sterner (1949) pada dosis tersebut termasuk kelas toksisitas 4 pada GHS, yang

berarti toksisitasnya relatif rendah. Sedangkan menurut Seong et al. (2010),

tamoxifen memiliki toksisitas yang relatif rendah dan kurang berbahaya dari pada

kemoterapi lainnya. Selain itu, uji Ames Toxicity pada tamoxifen positif yang berarti

senyawa tersebut bersifat mutagenik dan dapat juga bersifat karsinogenik. Hal ini

sesuai dengan efek samping utama dari tamoxifen pada manusia, diantaranya
kemungkinan ada peningkatan risiko kanker endometrium dan penyakit

tromboemboli (Seong et al., 2010).

Senyawa yang tergolong kelas toksisitas 4 (300 < LD50 ≤ 2000) yaitu (2-

Methyl-1,4-piperazinediyl)bis[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone], 1-Acetyl-3-

piperidinecarbo-hydrazide, dan Azoxystrobin. Senyawa (2-Methyl-1,4-

piperazinediyl)bis[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone] memiliki nilai LD50 sebesar

1000 mg/kg, tidak toksik terhadap hepar, tidak mutagenik, dan tidak mengakibatkan

sensitivitas terhadap kulit. Senyawa Indoline memiliki nilai LD50 sebesar 1250 mg/kg

namun senyawa tersebut mengakibatkan sensitivitas terhadap kulit. Senyawa 1-

Acetyl-3-piperidinecarbo-hydrazide memiliki nilai LD50 pada hewan coba (rodent)

sebesar 650 mg/kg, senyawa tersebut tidak menimbulkan sensitivitas pada kulit tapi

bersifat mutagenik dan toksik pada hepar. Senyawa Azoxystrobin memiliki nilai LD50

pada hewan coba (rodent) sebesar 500 mg/kg, senyawa tersebut menimbulkan

toksisitas pada hepar namun tidak menimbulkan sensitivitas pada kulit dan tidak

mutagenik.

Senyawa yang tergolong kelas 3 dimana resiko toksisitasnya lebih tinggi dari

pada kelas 4 dan 5 yaitu N-[(5-Chloro-1,2,3-thiadiazol-4-yl)methyl]-1-(2-isopropyl-

4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)-N-methylethanamine dan (2R)-2-Amino-3-Trisulfany-

lpropanal. Senyawa N-[(5-Chloro-1,2,3-thiadiazol-4-yl)methyl]-1-(2-isopropyl-4-

methyl-1,3-thiazol-5-yl)-N-methylethanamine memiliki nilai LD50 pada hewan coba

(rodent) sebesar 200 mg/kg, senyawa tersebut tidak menimbulkan sensitivitas pada

kulit dan tidak mutagenic, namun toksik pada hepar. Senyawa (2R)-2-Amino-3-
 Trisulfanylpropanal memiliki nilai LD50 sebesar 156 mg/kg, senyawa tersebut

mengakibatkan sensitivitas terhadap kulit serta tidak mutagenik dan tidak toksik pada

hepar.

5.4 Analisis Data Statistik

Hasil Rerank Score dianalisis secara statistik dengan menggunakan program

SPSS 22,0 for windows. Untuk menentukan suatu senyawa aktif atau inaktif dapat

dilakukan dengan cara uji banding antar dan inter kelompok menggunakan uji

statistik ANOVA. Dengan menggunakan nilai Rerank Score yang telah dilakukan

replikasi tiga kali sehingga dapat dilakuan uji statistika ANOVA. Uji ini digunakan

untuk mengetahui ligan uji yang lebih baik dibandingkan dengan native ligand. Hasil

analisis data statistik ditunjukkan pada tabel 5.8.

Tabel 5.8 Analisis uji banding menggunakan uji statistik ANOVA

(I) Mean Sig. 95% Confidence Interval

Senyawa (J) Senyawa Uji Difference Std. Error ( p- Lower Upper
Uji (I-J) value) Bound Bound
Tamoxifen Indoline -47.2209000* .5330770 .001 -52.750711 -41.691089
Isoleucine-Alanine dipeptide -
-22.1799000* .5502194 .002 -17.201614
27.158186
1-Acetyl-3piperidinecar- -
-34.5452667* .5533906 .001 -29.646798
bohydrazide 39.443735
Kaempferol -
-16.8624333* .5384239 .005 -11.529286
22.195581
Isorhamnetin -
-5.5760000* .5340661 .049 -.084503
11.067497
Genistein -
-20.0370333* .5332574 .004 -14.514279
25.559788
N-[(5-Chloro-1,2,3thiadiazol- -2.3479667 .7629584 .322 -6.777967 2.082034
4-yl)methyl]-1-(2isopropyl-4-
 methyl-1,3thiazol-5-yl)N-
methylethanamine
(2-Methyl-1,4piperazinediyl)-
bis[(3,4,5-trimethoxyphenyl)- 13.2793000* 1.2434715 .018 4.183046 22.375554
methanone]
Azoxystrobin -
2.6497667 1.726827 0.858 17.318210
12.018676
(2R)-2-Amino- -
-44.1213000* .5354870 .001 -38.683265
3Trisulfanylpropanal 49.559335
native ligand 17.6443000* .9757281 .002 11.423881 23.864719
Native Indoline -
-64.8652000* .8180088 .001 -56.353602
Ligand 73.376798
Isoleucine-Alanine dipeptide -
-39.8242000* .8292820 .002 -31.721044
47.927356
1-Acetyl-3piperidine- -
-52.1895667* .8313894 .001 -44.155134
carbohydrazide 60.223999
Kaempferol -
-34.5067333* .8215032 .003 -26.129527
42.883940
Isorhamnetin -
-23.2203000* .8186537 .007 -14.734065
31.706535
Genistein -
-37.6813333* .8181264 .003 -29.174379
46.188288
N-[(5-Chloro-1,2,3thiadiazol-
4-yl)methyl]-1-(2isopropyl-4- -
-19.9922667* .9833986 .001 -13.784617
methyl-1,3thiazol-5-yl)N- 26.199917
methylethanamine
(2-Methyl-1,4piperazinediyl)-
-
bis[(3,4,5-trimethoxyphenyl)- -4.36500001 .3896721 .320 4.150518
12.880518
methanone]
Azoxystrobin -
-14.9945333* 1.8349111 .035 -1.861732
28.127335
(2R)-2-Amino-3Trisulfanyl- -
-61.7656000* .8195813 .001 -53.315396
propanal 70.215804
Tamoxifen -
-17.6443000* .9757281 .002 -11.423881
23.864719
Sumber : Lampiran 1 dan lampiran 2

Berdasarkan table 5.8 menunjukkan hasil analisis uji beda dengan masing-

masing ligan uji terhadap obat pembanding (tamoxifen) dan native ligand. Hasil

pengolahan data statistik ANOVA yang didapat nilai p-value pada reseptor 5W9C (C)

pada masing-masing ligan uji terhadap tamoxifen menunjukkan nilai signifikan

kurang dari 0.05 namun ada dua senyawa yang nilai p-value nya lebih dari 0.05, yaitu
N-[(5-Chloro-1,2,3thiadiazol-4-yl)methyl]-1-(2isopropyl-4-methyl-1,3thiazol-5-yl)N-

methylethanamine dan Azoxystrobin.

Sedangkan hasil pengolahan data statistik pada masing-masing ligan uji

terhadap native ligand menunjukkan nilai signifikan kurang dari 0,05 namun terdapat

satu senyawa yang nilai p-value nya lebih dari 0.05, yaitu (2-Methyl-

1,4piperazinediyl)-bis[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone]. Dengan nilai p-value

kurang dari 0,05 yang berarti ligan uji pada masing masing reseptor berbeda

aktivitasnya dengan native ligand maupun obat pembanding (tamoxifen) atau dapat

dinyatakan tidak memiliki efek yang sama dengan native ligand maupun tamoxifen.

Sedangkan apabila didapatkan p-value lebih dari 0,05 maka dapat dinyatakan skor

ligan uji tidak berbeda dengan native ligand maupun tamoxifen, atau dapat

dinyatakan memilki efek yang sama (Fawwaz, 2019).