TERAPI GEN

Peneliti-peneliti sekarang ini tertarik untuk mengobati penyakit genetik yang parah
dan melemahkan, oleh sebab itu peneliti sangat ingin menggunakan sistem terapi gen.
Terapi gen merupakan penggunaan asam nukleat sebagai agen untuk mengobati penyakit.
Terapi gen biasanya menargetkan satu atau lebih gen yang termutasi tanpa memengaruhi
gen normal di sekitar lokasi penyakit. Dibandingkan dengan obat-obatan molekul kecil,
terapi gen tidak akan menyebabkan resistensi obat bahkan setelah perawatan berulang
karena target pengobatan gen bukanlah reseptor tertentu tetapi gen yang mengkode
penyakit tersebut. Dalam bab ini, kita akan membahas kondisi terapi gen saat ini dan
pendekatan umum untuk transfer gen, biologi dan kegunaan sistem transfer gen, kemajuan
terbaru dalam sistem pengiriman gen berbasis sel, penyakit yang saat ini menjadi sasaran
terapi gen, dan regulasi produk gen akan dibahas dan ditinjau.

VEKTOR UNTUK TRANSFER GEN

■ Komponen Dasar Plasmid

Plasmid sendiri adalah molekul DNA sirkuler, untai ganda yang mengandung DNA
komlementer (cDNA) pengkodean urutan untuk gen terapeutik dan beberapa elemen
genetik lainnya termasuk elemen bakteri, transcription regulatory elements (TRE), multiple
cloning sites (MCS), daerah yang tidak diterjemahkan (UTR), intron, urutan polyadenylation
(polyA), dan tag fusion, yang semuanya memiliki dampak besar pada fungsi produk genetik
akhir.

Elemen Bakteri

Plasmid dalam elemen bakteri memiliki dua fitur yang penting bagi mereka
perbanyakan pada bakteri. Salah satunya adalah asal bakteri replikasi (Ori), yang
merupakan urutan DNA spesifik itu mengikat faktor-faktor yang mengatur replikasi plasmid
dan pada gilirannya mengendalikan jumlah salinan plasmid per bakteri. Elemen yang
diperlukan kedua adalah yang dapat dipilih penanda, biasanya gen yang memberikan
resistensi terhadap antibiotika.

Elemen Pengaturan Transkripsi (TRE)

Plasmid pengekspres gen mengandung elemen pengatur transkripsi (TRE) untuk

mengontrol transkripsi. Berbagai TRE (promotor, enhancer, operator, peredam suara,
isolator, dll.) Berinteraksi dengan mesin molekuler (faktor transkripsi umum, aktivator, co-
aktivator, dan penekan) untuk mengontrol pola gen ekspresi.
 Promotor adalah urutan DNA yang memungkinkan gen yang akan ditranskripsi.
Promotor diakui oleh RNA polimerase dan faktor transkripsi. Penambah adalah urutan DNA
pendek yang bisa ikat faktor transkripsi atau aktivator untuk ditingkatkan tingkat transkripsi
gen dalam kluster gen. Interaksi penambah-promotor memainkan peran utama untuk
mendorong ekspresi gen. Enhancer tidak langsung bertindak pada wilayah promotor, tetapi
dapatkan efeknya setelah mereka diikat oleh aktivis atau faktor transkripsi lainnya. TRE lain
termasuk isolator, operator, dan peredam suara. Insulator terutama merupakan elemen
batas genetik untuk memblokir interaksi penambah-promotor atau lebih jarang hambatan
terhadap kromatin kental protein.

Multiple Cloning Site (MCS)

Beberapa situs kloning (MCS), juga dikenal sebagai polylinker, adalah segmen DNA
pendek yang berisi banyak situs restriksi endonuclease pembatasan. Umumnya, pilihan
situs pembatasan untuk kloning cDNA miliki tidak berdampak pada ekspresi transgen
utama. Namun, pilihan situs kloning kadang-kadang dapat menyebabkan perubahan struktur
sekunder mRNA dan penghambatan terjemahan selanjutnya.

Wilayah yang Tidak Diterjemahkan (UTR)

Untuk mengekspresikan protein terapeutik, mRNA harus dihasilkan dari templat

cDNA yang dimasukkan dalam MCS dan diangkut ke sitoplasma menjadi diterjemahkan.
Dalam genetika molekuler, daerah yang tidak diterjemahkan (UTR) merujuk pada dua
bagian di setiap sisi pengkodean urutan pada untai mRNA. 5 ′ UTR adalah wilayah
transkripsi mRNA yang terletak di antara capsite dan kodon inisiasi. 5 ′ UTR berisi elemen
pengatur yang mengendalikan ekspresi gen. 3 ′ UTR adalah wilayah transkrip mRNA
mengikuti kodon terminasi. 3 ′ Memainkan UTR peran penting dalam stabilitas mRNA. Ini
berisi situs pengikatan untuk protein yang dapat mempengaruhi stabilitas atau lokasi mRNA
dalam sel; ekor polyadenylation yang penting untuk ekspor nuklir, terjemahan, dan stabilitas
mRNA; dan situs yang mengikat untuk miRNA yang merupakan bagian dari pembungkaman
gen endogen mesin.

Intron

Wilayah pengkode protein dalam gen eukariotik adalah sering terganggu oleh
bentangan DNA yang tidak dikode disebut intron. Intron adalah sering dimasukkan ke
dalam 5 ′ UTR transkrip unit.

Urutan Polyadenylation (polyA)

 Urutan polyadenylation (polyA) penting untuk ekspor nuklir, terjemahan, dan
stabilitas mRNA. Di akhir transkripsi, segmen 3 of yang baru membuat RNA pertama kali
dipisahkan oleh satu set protein. Ini protein kemudian mensintesis ekor polyA di RNA's 3 ′
akhir. Sinyal polyA adalah situs pengenalan yang terdiri dari Hexamer AAUAAA diposisikan
10-30 nukleotida hulu dari ujung 5 ′ dan elemen kaya GU atau U terletak maksimal 30
nukleotida di hilir 3′end (Mahato et al. 1999). Fungsi terpenting dari urutan poliA adalah
untuk mencegah mRNA degradasi enzimatik.

Tag Fusion

Tag fusi adalah protein atau peptida yang terletak di C- atau N-terminal protein target
untuk mengerahkan satu atau beberapa fungsi seperti meningkatkan ekspresi, kelayakan,
deteksi, pemurnian, atau pelokalan. Tag protein fluoresen, seperti protein fluoresensi hijau
(GFP), memberikan informasi tentang lokasi intraseluler dari ekspresi transgen. Tag fusi lain
seperti beberapa urutan peptida protein c-myc manusia digunakan untuk meningkatkan
translokasi nuklir dari protein target untuk mengerahkan fungsi fisiologis.

VEKTOR VIRAL

Semua virus memiliki keunggulan bawaan untuk diikat tempat asal mereka dan
memperkenalkan bahan genetik mereka ke dalam sel inang dengan efisiensi tinggi. Untuk
membangun vektor virus, gen yang bertanggung jawab untuk replikasi virus dan
patogenisitas pertama kali dihilangkan dan diganti dengan kaset transgen. Vektor virus
biasanya memiliki efisiensi tinggi dalam transduksi dan tidak memerlukan operator
tambahan untuk pengiriman gen yang efektif. Sampai saat ini, kira-kira 70% dari semua uji
klinis terapi gen menggunakan virus vektor. Retrovirus, lentivirus, adenovirus, dan virus
terkait adeno (AAV) adalah yang paling luas dipelajari dan digunakan sebagai vektor virus
untuk gen manusia terapi.

■ Retrovirus

Biologi

Retrovirus adalah virus RNA yang diselimutidua salinan genom RNA untai tunggal.
Retrovirus berdiameter 80-100 nm dan memiliki virusgenom sekitar 7-10 kb, terdiri dari
kelompok spesifik ckode gen antigen (gag) untuk protein inti dan strukturalvirus; kode gen
polimerase (pol) untukreverse transcriptase, protease, dan integrase; dankode gen amplop
(env) untuk protein mantel retroviral.Pengulangan panjang terminal (LTR)
mengontrolekspresi gen virus, karena bertindak sebagai penambah promotor. Konstruk
terintegrasi, provirus, kemudian akan menjalani transkripsi dan terjemahan sebagai gen
seluler untuk menghasilkan RNA dan mRNA genom viruspengkodean protein virus. Partikel
virus kemudian berkumpuldalam sitoplasma dan kuncup dari sel inang untuk
menginfeksisel-sel lain.

Kesesuaian Retrovirus sebagai Vektor untuk Transfer Gen

Untuk menghasilkan vektor retroviral yang kekurangan replikasi, urutan pengkodean

protein virion (gag, pol, dan env) bertanggung jawab atas replikasi virus dan patogenisitas
digantikan oleh transgen. Vektor retroviral memiliki beberapa fitur untuk aplikasi gen
transfer. Keterbatasan utama gen berbasis terapi retrovirus adalah retrovirus secara acak
memasukkan materi genetik ke dalam genom inang.

Kelemahan signifikan terhadap penggunaan adenovirus rekombinan adalah

kemampuan virus untuk memperoleh respons imun yang kuat termasuk limfosit T yang
dimediasi “imunitas seluler” dan “imunitas humoral” penghasil antibodi. Respons seluler
menghasilkan pembunuhan sel-sel adenovirus yang ditransfeksi oleh limfosit T, sedangkan
respons humoral menghasilkan produksi antibodi terhadap adenovirus, yang kemudian
menghilangkan vektor-vektor adenoviral dari aliran darah. Selain itu, kekebalan serotipe 5
adenovirus yang sudah ada sebelumnya telah terbukti secara signifikan mengurangi efikasi
vektor dalam uji praklinis dan klinis.

Penggunaan Klinis Retrovirus

Sekitar 20% dari penggunaan klinis saat ini menguji coba menggunakan vektor
retroviral untuk transfer gen. Virus leukemia murine Moloney (MoMLV), salah satu yang
paling teliti dicirikan retrovirus, adalah vektor virus pertama yang digunakan klinik untuk
mengobati kekurangan ADA yang disebabkan oleh SCID, penyakit bawaan di mana
penumpukan deoxyadenosine yang disebabkan oleh defisiensi ADA melarang ekspansi
limfosit.

■ Lentivirus

Biologi

Lentivirus adalah retrovirus unik yang dapat ditiru di kedua sel membelah dan tidak
membelah. Biologi lentivirus sangat mirip dengan retrovirus. Terlepas dari gen gag, pol, dan
env, lentivirus miliki enam gen aksesori seperti tat, rev, vpr, vpu, nef, dan vif, yang mengatur
sintesis dan pemrosesan viral RNA dan fungsi replikasi lainnya. Human Immunnodeficency
Virus (HIV) adalah lentivirus terbaik yang dikenal. Virus HIV ini secara genetik telah
dimanipulasi untuk menghasilkan vektor virus untuk gen yang efisien ditransfer ke sel T
manusia dan makrofag.

Kesesuaian Lentivirus sebagai Vektor untuk Transfer Gen

Signifikan vektor lentiviral terletak pada kenyataan bahwa mereka secara efisien
dapat mentransduksi sel-sel yang tidak membelah atau secara terminal sel-sel yang
berdiferensiasi seperti neuron, makrofag, sel punca hematopoietik, otot, dan hati sel serta
jenis sel lainnya yang tradisional.

Lentivirus hanya memiliki potensi pengintegrasian yang terbatas dan akibatnya

mengurangi risiko insersi mutagenesis. Namun, generasi dari Replication Competent
Lentiviruses (RCL) selama fase produksi atau setelah dimasukkan ke dalam sel target masih
merupakan yang utama terhadap penggunaan klinis lentivirus.

Penggunaan Klinis Vektor Lentiviral

Karena risiko yang dirasakan terkait dengan penggunaan lentivirus, uji klinis dengan
vektor-vektor ini tidak dimulai sampai tahun 2001, sebagian besar untuk mengobati infeksi
HIV.

■Adenovirus

Biologi

Adenovirus adalah virus tanpa lipid bilayer luar , icosahedral, virus DNA litik yang
terdiri dari nukleokapsid dan genom beruntai ganda linier. Adenovirus mampu menginfeksi
sel yang membelah dan yang tidak membelah. Saat ini 57% sereotypes dari adenovirus
telah diidentifikasi. Kemudian dikelompokkan menjadi 7 subkelompok (A-G) berdasarkan
ukuran genom, komposisi, sifat hemaglutinasi, dan onkogenisitas. Serotype 2 dan 5
adenovirus adalah yang paling banyak dipelajari dan yang pertama digunakan sebagai
vektor untuk terapi gen.

Kesesuaian Adenovirus sebagai Vektor untuk Transfer Gen

Untuk membangun vektor adenoviral sebagai terapi gen, daerah E1 dan E3 dari
genom virus sering dihapus untuk mencegah replikasi virus serta mengakomodasi kaset-
kaset transgen.Adenovirus memiliki genom besar yang mampu menampung kaset transgen
besar. Karakteristik lain yang menguntungkan dari adenovirus yaitu biologi virus mudah
dipahami dengan baik, virus rekombinan dapat dihasilkan dengan titer dan kemurnian tinggi,
ekspresi transgen dari adenovirus cepat dan kuat, dan adenovirus dapat menginfeksi
berbagai pemisahan dan tidak membagi sel.Adenovirus tidak berintegrasi ke dalam genom
inang.

■Adeno-Associated Virus (AAV)

Biologi

Genom AAV adalah molekul DNA 4,1 kb linier, beruntai tunggal yang terdiri dari dua
frame pembacaan terbuka (ORF), rep, cap, dan dua pengulangan terminal terbalik (ITR)
yang menentukan awal dan akhir dari genom virus dan urutan pengemasan. Gen rep
mengkode protein yang bertanggung jawab untuk replikasi virus, sedangkan gen topi
mengkode protein kapsid struktural. ITR diperlukan untuk replikasi, pengemasan, dan
integrasi genom.

Vektor AAV rekombinan tidak mengandung viral open reading frames (ORFs),
mereka hanya menginduksi respon imun yang terbatas pada manusia.Meskipun imunitas
bawaan terbatas ditimbulkan oleh vektor AAV, imunitas humoral yang ditimbulkan oleh AAV
masih umum terjadi. Parkinson.

Kesesuaian AAV sebagai Vektor untuk Transfer Gen

Genom AAV sederhana, sehingga mudah dimanipulasi. Virus ini tahan terhadap
tantangan fisik dan kimia selama pemurnian dan penyimpanan jangka panjang. Kemampuan
virus untuk berintegrasi dalam kromosom manusia adalah persoalan awal, tetapi akhirnya
ternyata AAV hanya berintegrasi ke lokasi kromosom manusia yang tetap dan frekuensi
integrasi AAV rekombinan cukup rendah.

Penggunaan Klinis Vektor AAV

Penggunaan klinis pertama AAV rekombinan adalah untuk mentransfer cDNA cDNA
fibrosis transmembran konduktansi regulator (CFTR) ke epitel pernapasan untuk mengobati
fibrosis cystic.

VEKTOR NON VIRAL

Masalah yang melekat dengan virus rekombinan seperti imunogenisitas, antara lain
tercermin dalam generasi antibodi penetral, dan mutagenesis insersional telah menunjukkan
desain vektor nonviral yang efisien untuk terapi gen manusia.

■ Metode Pengiriman untuk Transfer Gen Nonviral

Metode Fisik untuk Transfer Gen

 Metode fisik melibatkan transfer plasmid telanjang dengan gangguan langsung
(target) membran sel. Metode kimia meningkatkan penyerapan plasmid oleh sel-sel yang
ditargetkan menggunakan pembawa berbasis lipid, peptida, atau polimer. Mikroinjeksi,
injeksi langsung DNA atau RNA ke dalam sitoplasma atau inti sel tunggal, adalah metode
paling sederhana dan paling efektif untuk pengiriman fisik bahan genetik ke sel. Ini
mentransfeksi 100% sel yang dirawat dan meminimalkan pemborosan DNA plasmid.
Transfer gen termediasi elektroporasi juga menunjukkan keamanan dan kemanjuran dalam
uji klinis untuk mengobati melanoma, kanker prostat, dan infeksi HIV.

Lipid kationik

Sejak penemuan lipofectamine pada tahun 1987, banyak lipid kationik telah
disintesis dan diuji untuk pengiriman gen. Lipoplexes diambil oleh sel melalui rute endosom.
Untuk pelepasan dan transportasi endosom ke dan melalui membran inti, elemen fungsional
tambahan dapat dilampirkan: untuk pelepasan endosom (peptida fusiogenik yang peka
terhadap pH), untuk transportasi dalam sitoplasma, dan bagian membran inti (inti peptida
translokasi).

Peptida

Sama seperti lipid kationik, peptida kationik memadatkan DNA dengan cara yang
serupa dan dapat digunakan sebagai pembawa pengiriman gen. Poly (L -lysine) (PLL),
suatu polidisperse, pengulangan sintetis dari asam amino lisin, adalah salah satu peptida
kationik pertama yang menghasilkan gen. Sistem pengiriman gen berbasis peptida memiliki
potensi untuk mengatasi barrier pengiriman gen ekstraseluler dan intraseluler menggunakan
urutan peptida tunggal. Tantangan unik lain untuk sistem pengiriman gen berbasis peptida
adalah proteasom sitosol, yang mendegradasi protein yang tidak dibutuhkan atau rusak oleh
proteolisis. Proteasom mengganggu kestabilan dan menurunkan kondensat DNA / peptida
dan mencegah transfer gen yang efektif.

Polimer

Polimer kationik sintetik dan alami merupakan kategori lain dari pembawa gen.
Polyethyleneimine (PEI) telah menjadi polimer kationik yang paling banyak digunakan untuk
pengiriman gen dalam dua dekade terakhir.

■ Penggunaan Klinis Vektor Nonviral

Tidak mungkin, dengan teknologi nonviral saat ini, untuk mencocokkan efisiensi
transduksi yang tinggi dan tingkat ekspresi yang tinggi yang dilaporkan dengan metode virus
tertentu in vivo. Kemungkinan efek plasebo yang kuat tidak dapat diabaikan dalam uji coba
ini. Hasil kemanjuran dari studi ini harus ditafsirkan dengan hati-hati dan hanya dapat dinilai
dengan melakukan uji coba fase II / III lebih lanjut.

TERAPI GEN BERBASIS SEL PUNCA

Terapi gen berbasis sel punca muncul dari kemajuan baru-baru ini dalam terapi sel
dan terapi gen. Terapi sel menggambarkan proses memasukkan sel-sel baru ke dalam
jaringan untuk mengobati suatu penyakit.

TERAPI SEL PUNCA

Sel punca ada di semua organisme multiseluler dan terbagi dua sifat karakteristik.
Mereka memiliki kapasitas pembaruan diri yang berkepanjangan atau tidak terbatas dan
potensi untuk berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel khusus. Sel punca paling awal
dalam kehidupan manusia adalah embryonic stem cells (ESC), yang berasal dari massa sel
dalam blastokista dan mampu berdiferensiasi menjadi semua turunan dari tiga lapisan benih
utama: ektoderm, endoderm, dan mesoderm. Selain ESC, yang hanya dapat diisolasi dari
embrio awal, ada jenis sel punca lain di jaringan dewasa semua mamalia tua yang disebut
sel punca dewasa. Di antara semua jenis sel induk, MSC telah menarik perhatian khusus
karena penerapannya yang luas dalam kedokteran regeneratif. Injeksi langsung dari ESC
yang sangat berpotensi majemuk ke dalam organ ektopik sering menimbulkan teratoma,
tumor jinak yang mengandung turunan dari ketiga lapisan benih. MSC kurang potensial
untuk menginduksi teratoma atau transformasi ganas lainnya karena mereka hanya memiliki
potensi diferensiasi terbatas. Dibandingkan dengan sel punca dewasa lainnya seperti HSC,
sel punca mammae, atau sel punca saraf, MSC memiliki efek trofik dan sifat
imunomodulator yang dikarakterisasi dengan baik, menjadikannya kandidat yang baik dalam
mengobati penyakit degeneratif.

Ada dua arah utama terapi gen berbasis sel punca: (1) sel punca digunakan sebagai
sarana pengiriman gen untuk mengekspresikan gen terapeutik di lokasi target dan (2) sel
punca diprogram ulang atau ditransdifferensiasikan dengan modifikasi genetik untuk mengisi
kembali sel atau jaringan cacat (obat regeneratif).

SEL PUNCA SEBAGAI KENDARAAN PENGIRIMAN GEN

Kemajuan dalam terapi gen dalam dua dekade terakhir memiliki dampak besar pada
bagaimana sel punca dapat digunakan untuk mengobati penyakit tertentu. Karena kasus
terapi gen pertama yang berhasil di mana gen ADA dimasukkan ke dalam limfosit T
autologus untuk mengobati ADA yang mengalami defisiensi SCID, beberapa kelompok
memiliki tujuan ambisius untuk memperbaiki kekurangan ADA secara permanen dengan
memasukkan gen ADA ke dalam sel-sel progenitor hematopoietik dari sumsum tulang dan
darah tali pusat. Meskipun hasil keseluruhan mengecewakan, ekspresi transgen dalam sel
progenitor hematopoietik memang memberikan kelangsungan hidup selektif, pertumbuhan,
dan keunggulan diferensiasi untuk keturunan limfosit. Terapi gen tradisional (seperti yang
dibahas sebelumnya) berfokus pada pengenalan materi genetik dalam sel dewasa untuk
mengobati penyakit genetik bawaan, sedangkan terapi gen berbasis sel punca dapat
mewakili pengobatan permanen untuk penyakit genetik ini. Studi praklinis baru-baru ini juga
menunjukkan masa depan yang menjanjikan untuk menggunakan sel punca yang
dimodifikasi secara genetik sebagai agen terapi. Sebagai contoh, MSC secara luas
dilaporkan sebagai mediator trofik yang kompeten untuk transplantasi pulau. Namun, MSC
saja tidak cukup untuk mendukung revaskularisasi cangkok pulau yang cepat dan
fungsional. MSC yang dimodifikasi secara genetik tidak hanya membalikkan
ketidakmampuan MSC primer tetapi juga memberikan fungsi baru kepada MSC untuk
menargetkan berbagai penyakit.

SEL PUNCA SEBAGAI OBAT REGENERATIF

Sel punca dapat diprogram ulang atau ditransdiferensiasikan dengan modifikasi

genetik untuk mengisi sel atau jaringan yang rusak. Fitur-fitur ini membuat sel punca yang
dimodifikasi secara genetik menjadi alat yang ampuh dalam kedokteran regeneratif. Vektor
virus secara efisien mentransduksi sel punca dan mengarahkan diferensiasinya. Peng dan
rekan kerja pertama kali menunjukkan bahwa sel-sel punca yang diturunkan dari otot
direkayasa secara genetik dengan retrovirus untuk mengekspresikan bone morphogenetic
protein-4 (BMP4) dan VEGF mempromosikan pembentukan tulang dan penyembuhan
tulang dalam model tikus. Studi praklinis lainnya menunjukkan bahwa sel punca dapat
dengan mudah melakukan transdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel melalui modifikasi
genetik menggunakan vektor virus atau nonviral.

Vektor virus adalah alat yang paling populer untuk mengarahkan diferensiasi sel
punca dalam pengobatan regeneratif. Namun, karena risiko mutagenesis insersi dan
generasi replikasi virus yang kompeten, vektor nonviral juga dipelajari dalam terapi gen
berbasis sel. Sumber untuk sel punca adalah masalah lain untuk terapi gen berbasis sel
punca. iPSC yang diinduksi dari sel somatik menawarkan alternatif potensial untuk ESC dan
sel punca dewasa lainnya yang pasokannya terbatas saat ini. Namun, pembentukan
teratoma dan imunogenisitas tetap menjadi masalah yang belum terpecahkan menghambat
aplikasi iPSC yang luas.
 Perlu dicatat bahwa sebagian besar terapi gen berbasis sel punca, terutama yang
menggunakan retrovirus atau lentivirus sebagai vektor pengiriman gen, tidak menyediakan
mekanisme untuk mematikan ekspresi gen terapeutik ketika ekspresi lebih lanjut tidak
diperlukan atau untuk membersihkan sel-sel punca proliferatif ketika jaringan yang rusak
sepenuhnya sembuh. Sistem yang dapat diinduksi dapat ditambahkan ke struktur vektor
untuk mencapai kontrol temporal dan spasial dari ekspresi transgen.

SASARAN PENYAKIT BAGI TERAPI GEN

Saat ini ada 1786 uji klinis terapi gen aktif di seluruh dunia. Sekitar 65% dari
percobaan ini adalah untuk perawatan kanker. Pengobatan penyakit monogenetik, penyakit
kardiovaskular, dan penyakit menular masing-masing mengambil ~ 10% dari jumlah uji klinis
aktif. Pengobatan penyakit neurologis, yang telah berkembang sangat cepat dalam 5 tahun
terakhir adalah tujuan dari 2% uji klinis aktif.

TERAPI GEN KANKER

Mayoritas uji klinis terapi gen saat ini dikhususkan untuk mengobati kanker. Ada dua
manfaat potensial menggunakan terapi gen untuk mengobati kanker: (a) perawatan berbasis
gen dapat menyerang kanker yang ada pada tingkat molekuler, menghilangkan kebutuhan
akan obat-obatan, radiasi, atau operasi dan (b) mengidentifikasi gen kerentanan kanker
pada individu atau keluarga mungkin memiliki dampak signifikan dalam mencegah penyakit
sebelum terjadi.

■ Koreksi Mutasi Genetik

Dalam pendekatan ini, terapi gen digunakan untuk memperbaiki mutasi genetik yang
berkontribusi pada fenotip ganas dengan mengganti gen yang hilang atau menghilangkan
gen cacat. Memahami kanker pada tingkat molekuler adalah dasar untuk koreksi gen dalam
terapi kanker. Inaktivasi atau aktivasi gen tertentu dapat berkontribusi pada pertumbuhan
tumor. Meskipun proses kompleks perkembangan dan pertumbuhan tumor membatasi
kegunaan strategi ini, sekitar 12% uji klinis terapi gen kanker melibatkan ekspresi berlebih
dari gen penekan tumor seperti p53, MDA-7, dan ARF. Mutasi pada gen p53 paling sering
terlihat pada spektrum tumor yang luas. Pengiriman dan ekspresi gen penekan tumor p53
tipe liar mencegah pertumbuhan sel kanker manusia dalam kultur, menyebabkan regresi
tumor manusia pada tikus, atau sensitisasi tumor yang ada pada efek terapi kemoterapi
konvensional dan radioterapi. Hasil dari uji klinis menunjukkan bahwa efek terapi gendicine,
produk terapi gen pertama, menjanjikan pada pasien dengan kanker skuamosa kepala dan
leher. Namun, hasilnya hanya divalidasi di Cina.
■ Imunoterapi

Dalam pendekatan ini, terapi gen digunakan untuk merangsang kemampuan alami
tubuh untuk menyerang sel kanker. Dalam satu penelitian, limfosit darah perifer autologis
yang direkayasa secara genetika dengan vektor retroviral yang mengkodekan reseptor sel T
spesifik (TCR) melanoma diberikan kepada pasien dengan melanoma metastasis. Limfosit T
yang direkayasa secara genetika kemudian mengenali antigen pada permukaan sel tumor
melalui TCR dan membunuh sel tumor.

■ Sensitisasi Tumor

Dalam pendekatan ini, gen dimasukkan ke dalam sel kanker untuk membuatnya
lebih sensitif terhadap kemoterapi konvensional dan radioterapi atau perawatan lain. Kami
sebelumnya menyebutkan bahwa ekspresi transgen dari p53 menyebabkan tumor peka
terhadap efek terapi kemoterapi dan radioterapi konvensional. Pembungkaman gen MDR1
siRNA atau vektor yang dimediasi secara sintetik secara luas dilaporkan berhasil
mengurangi kemoresistensi jenis kanker tertentu.

■ Terapi Enzim-Prodrug yang diarahkan Gen

Dalam pendekatan ini, terapi gen bertujuan untuk memaksimalkan efek toksik obat
dan meminimalkan efek sistemiknya dengan menghasilkan obat in situ di dalam tumor. Pada
langkah pertama prosedur ini, gen untuk enzim eksogen dikirim dan diekspresikan dalam sel
tumor. Selanjutnya, prodrug diberikan dan dikonversi menjadi obat aktif (metabolit toksik)
oleh enzim asing yang diekspresikan di dalam atau di permukaan sel tumor. Suicide genes
biasanya berasal dari virus atau prokariotik tanpa homolog manusia. Namun, ini bukan
persyaratan mutlak asalkan prodrug tidak diaktifkan pada tingkat signifikan oleh enzim
seluler asli.

■ Virus Onkolitik (Viroterapi)

Dalam pendekatan ini, virus oncolytic secara langsung dimasukkan ke dalam tumor
untuk menginduksi kematian sel melalui replikasi virus, ekspresi protein sitotoksik, dan lisis
sel. Virus vaksin, herpes simpleks tipe-I (HSV), virus, virus penyakit Newcastle, virus polio,
dan virus sering dipilih untuk aplikasi ini karena mereka secara alami menargetkan kanker
dan mengandung genom yang dapat dengan mudah dimanipulasi.

■ Terapi Gen Nonviral

Dalam dua dekade terakhir, terapi gen telah banyak dilakukan digunakan dalam uji
klinis untuk perawatan kanker dan hasilnya cukup menggembirakan. Sebagian besar
percobaan klinis menggunakan terapi gen berbasis vektor virus, mungkin dikarenakan
efisiensi transfeksi yang tinggi pada strategi ini. Padahal terapi gen berbasis nonviral relatif
lebih aman dan lebih sedikit tumorigenik, pekerjaan yang luas masih diperlukan untuk lebih
mengoptimalkan strategi ini (meningkatkan ekspresi transgen, mengurangi pengikatan
protein plasma, pelepasan dari sistem retikuloendotelial (RES) dan endosome, dll) untuk
membuatnya dapat diterima secara klinis.

PENYAKIT MONOGENETIK

Keberhasilan terbesar terapi gen sampai saat ini telah dicapai dalam mengobati
penyakit monogenetik, yang merupakan kelompok penyakit terbesar kedua yang diobati
oleh terapi gen, terdiri 8,5% dari semua terapi gen aktif uji klinis. Tujuan utama terapi gen
untuk gangguan monogenetik adalah mengganti gen yang cacat dengan salinan yang baik
untuk mengembalikan fungsi normal dan membalikkan proses penyakit secara permanen.

PENYAKIT KARDIOVASKULAR

Penyakit kardiovaskular adalah kelompok penyakit terbesar ketiga yang secara aktif
diobati dengan terapi gen uji klinis. Pemahaman mekanisme molekuler penyakit
kardiovaskular telah menemukan sejumlah besar gen yang bisa berfungsi sebagai target
potensial untuk terapi molekuler.

PENYAKIT INFEKSI

Sebanyak 142 uji klinis untuk pengobatanpenyakit infeksi telah dimulai, terdiri 8%
dari jumlah total uji klinis terapi gen (Wiley 2012). Transfer gen untuk AIDS adalah aplikasi
utama dikategori ini. Banyak uji coba terapi gen untuk AIDS melibatkan pemindahan materi
genetik secara ex vivo ke sel T otonom menggunakan inaktivasi sendiri atau replikasi vektor
virus untuk meningkatkan sistem kekebalan tubuh pasien. Pencapaian paling penting dalam
studi terapi gen untuk mengobati penyakit infeksi adalah pengembangan vaksinasi DNA,
suatu teknik untuk melindungi host dari penyakit dengan memproduksi respon imunologis
melalui suntikan virus hasil rekayasa genetika DNA.

PENYAKIT NEUROLOGIS

Kemajuan yang signifikan telah dibuat dalam terapi gen untuk penyakit neurologis
dalam 5 tahun terakhir. Dua penyakit saraf yang paling umum ditargetkan oleh terapi gen
adalah penyakit Alzheimer dan penyakit Parkinson. Singkatnya, autologous fibroblasts
diperoleh dari biopsi kulit kecil pada setiap individu yang secara genetik telah dimodifikasi
untuk memproduksi dan mengeluarkan NGF menggunakan vektor retroviral dan ditanam
kembali pada otak depanHasil penelitian menunjukkan perbaikan dalam tingkat penurunan
kognitif, meningkatkan konsentrasi 18-fluorodeoxyglucose (PET imaging) di kortikal, dan
respon kuat pada pertumbuhan saraf ke NGF.

ISU REGULASI PRODUK TERAPI GEN

Setiap penelitian yang melibatkan manusia harus ditinjau dengan hati-hati. Terapi
gen menyajikan isu-isu keamanan dan pengendalian infeksi yang unik, yang membuat para
ilmuwan untuk mengambil tindakan pencegahan khusus dengan terapi gen. Di Amerika
Serikat dua organisasi dalam United States Department of Health and Human Services
(DHHS), Office for Human Research Protections (OHRP) dan Food and Drug Administration
(FDA), memiliki kewenangan khusus yang dijelaskan dalam Code of Federal Regulations
(CFR ).

Bidang terapi gen memiliki banyak vektor dikembangkan untuk transfer gen kini telah
diuji di klinik. Tiga produk (Gendicine dan Oncorine di Cina, Cerepro di Eropa) telah
memberikan persetujuan pemasaran dan beberapa orang lain berada dalam fase akhir dari
pengujian. Meskipun vektor biologi transfer gen dipahami dengan baik, beberapa hambatan
harus diatasi untuk mengubah gen menjadi terapi. Respon imun dan mutagenesis
insersional vektor virus dan kurangnya efisiensi transgen dari vektor nonviral adalah
hambatan tidak bisa paling signifi terapi gen.

Target pengiriman sistem ekspresi gen dan kontrol spasial dan temporal ekspresi
transgen pada jaringan target berdasarkan pada tingkat keparahan dan proses penyakit
juga penting untuk keberhasilan banyak aplikasi terapi gen. Meskipun uji klinis telah
menunjukkan keamanan dan kemanjuran jangka pendek, pengawasan jangka panjang
selama beberapa dekade kurang, dan keamanan dan efi keampuhan obat genetik sejauh ini
hanya divalidasi pada populasi pasien yang terbatas. Faktor-faktor lain seperti penggunaan
obat bersamaan dan kondisi medis bersamaan, penilaian obyektif perbaikan dan titik akhir,
dan penilaian efek plasebo perlu distandarisasi untuk mendapatkan hasil yang dapat
diandalkan dan direproduksi antara kelompok-kelompok penelitian yang berbeda. Sebagai
tambahan, efektivitas biaya analisis telah dianggap sebagai produksi vektor terapi gen itu
sendiri adalah mahal dan membutuhkan peralatan khusus dan personil. Di masa depan,
pengembangan lebih lanjut dari obat-obatan genetik yang dapat secara luas digunakan
berat akan bergantung pada kolaborasi antara lembaga akademik dan mitra komersial dari
industri farmasi dan bioteknologi.