TUGAS UJIAN AKHIR SEMESTER

TEKHNIK WESTERN BLOTTING

NAMA : RIRIN SAFITRI

NIM : 16/403118/PKU/15936

PROGRAM STUDI S2 ILMU KEDOKTERAN DASAR DAN BIOMEDIS

UNIVERSITAS GADJAH MADA

2016
 TEKHNIK WESTERN BLOTTING

A. Pengertian
Western blotting (protein blotting atau immunoblotting) adalah prosedur yang kuat
dan penting bagi Imunodeteksi protein pasca-elektroforesis, khususnya protein yang
kelimpahan rendah. Sejak awal dari protokol untuk transfer protein dari gel
dielektroforesis untuk membran pada tahun 1979, blotting protein telah berkembang
sangat. Komunitas ilmiah kini dihadapkan dengan berbagai cara dan sarana untuk
melaksanakan transfer. antibodi buatan diciptakan yang bereaksi dengan spesifik
menargetkan protein. Sampel yang akan diuji adalah siap dan disatukan dengan antibodi
ini pada membran – jika protein spesifik dicari untuk hadir, setelah elektroforesis gel
langkah ini akan menghasilkan sebuah sesuai bernoda di Band Western blotting.

B. Aplikasi
Tes HIV menggunakan western blotting untuk mendeteksi antibodi anti-HIV dalam
sampel serum manusia. Protein dari sel yang terinfeksi HIV dikenal dipisahkan dan
dihapuskan pada membran seperti di atas. Kemudian, serum yang akan diuji diterapkan
dalam antibodi primer inkubasi langkah; antibodi gratis hanyut, dan antibodi anti-manusia
sekunder terkait dengan sinyal enzim ditambahkan. band yang bernoda kemudian
menunjukkan protein yang serum pasien mengandung antibodi. Blot western juga
digunakan sebagai tes definitif untuk bovine spongiform encephalopathy (BSE, umumnya
disebut sebagai 'penyakit sapi gila'). Beberapa bentuk Lyme pengujian penyakit
mempekerjakan Barat blotting. blot western juga dapat digunakan sebagai konfirmasi tes
infeksi Hepatitis B dan HSV-2 infeksi.

C. Prosedur
Untuk membuat blot western sebuah elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan
protein asli oleh struktur 3-D atau denaturasi protein dengan panjang polipeptida. Itu
protein kemudian ditransfer ke membran (biasanya nitroselulosa atau PVDF), di mana
mereka diwarnai dengan antibodi spesifik terhadap protein target. Gel elektroforesis
Langkah ini termasuk dalam analisis western blot untuk menyelesaikan isu reaktivitas
silang antibodi.
1. Persiapan Jaringan
Sampel dapat diambil dari seluruh jaringan atau dari sel budaya. jaringan padat
pertama dipecah secara mekanis menggunakan blender (untuk volume sampel yang
lebih besar), menggunakan homogenizer (volume yang lebih kecil), atau dengan
sonikasi. Sel juga dapat rusak terbuka dengan salah satu mekanik di atas metode.
Namun, virus atau lingkungan sampel dapat menjadi sumber protein dan blotting
sehingga western tidak dibatasi untuk studi seluler saja. deterjen berbagai macam,
garam, dan buffer dapat digunakan untuk mendorong lisis sel dan melarutkan protein.
Protease dan fosfatase inhibitor sering ditambahkan ke mencegah pencernaan sampel
oleh enzim sendiri. persiapan jaringan sering dilakukan pada suhu dingin untuk
menghindari denaturasi protein dan degradasi.

2. Gel elektroforesis
Protein dari sampel dipisahkan menggunakan elektroforesis gel. Pemisahan
protein mungkin oleh isoelektrik Titik (pI), berat molekul, muatan listrik, atau
kombinasi faktor ini. Sifat pemisahan tergantung pada pengobatan sampel dan sifat
gel. Ini adalah cara yang sangat berguna untuk mengidentifikasi protein. Sejauh jenis
yang paling umum dari elektroforesis gel mempekerjakan gel poliakrilamida dan
buffer sarat dengan natrium sulfat dodesil (SDS). SDS-PAGE (SDS poliakrilamida
gel elektroforesis) mempertahankan polipeptida dalam didenaturasi negara setelah
mereka telah diperlakukan dengan mengurangi kuat agen untuk menghapus struktur
sekunder dan tersier (Mis ikatan disulfida [S-S] untuk kelompok sulfhidril [SH dan
SH]) dan dengan demikian memungkinkan pemisahan protein dengan mereka berat
molekul. protein sampel menjadi tertutup SDS bermuatan negatif dan pindah ke
positif elektroda bermuatan melalui jala akrilamida dari gel. protein yang lebih kecil
bermigrasi lebih cepat melalui jala ini, dan protein dengan demikian dipisahkan
menurut ukuran (biasanya diukur dalam kilodaltons, kDa). Konsentrasi akrilamida
menentukan resolusi gel – yang besar konsentrasi akrilamida, semakin baik resolusi
protein berat molekul rendah. Semakin rendah konsentrasi akrilamida, semakin baik
resolusi protein berat molekul yang lebih tinggi. Protein perjalanan hanya di satu
dimensi sepanjang gel untuk sebagian besar bercak.

Sampel dimuat ke sumur pada gel. Satu jalur adalah biasanya disediakan untuk
penanda atau tangga, komersial sebuah Campuran yang tersedia dari protein setelah
ditetapkan molekul bobot, biasanya diwarnai sehingga membentuk terlihat, berwarna
 band. Ketika tegangan diterapkan di sepanjang gel, protein bermigrasi melalui itu
pada kecepatan yang berbeda tergantung pada mereka ukuran. Ini tingkat yang
berbeda dari kemajuan (berbeda Mobilitas elektroforesis) terpisah menjadi band
dalam setiap jalur. Hal ini juga memungkinkan untuk menggunakan dua dimensi (2-
D) gel yang menyebar protein dari sampel tunggal di dua dimensi. Protein dipisahkan
menurut isoelektrik Titik (pH di mana mereka memiliki muatan bersih netral) di
dimensi pertama, dan menurut molekul mereka Berat di dimensi kedua.

3. Transfer
Untuk membuat protein diakses deteksi antibodi, mereka pindah dari dalam gel ke
membran terbuat dari nitroselulosa atau poliviniliden difluorida (PVDF). Metode
utama untuk mentransfer protein disebut electroblotting dan menggunakan arus listrik
untuk menarik protein dari gel ke dalam PVDF atau nitroselulosa selaput. Protein
bergerak dari dalam gel ke membran tetap menjaga organisasi mereka memiliki dalam
gel. Sebuah metode yang lebih tua transfer melibatkan menempatkan membran di atas
gel, dan setumpuk kertas filter di atas itu. Seluruh tumpukan ditempatkan dalam
larutan penyangga yang bergerak naik kertas dengan aksi kapiler, membawa protein
dengan itu. Dalam praktek metode ini tidak digunakan karena membutuhkan terlalu
banyak waktu; electroblotting lebih disukai. Sebagai hasil dari baik "blotting" proses,
protein yang terkena pada permukaan tipis lapisan untuk deteksi.

Kedua varietas membran dipilih karena adanya protein non-spesifik mengikat sifat
(yaitu mengikat semua protein sama baiknya). Protein mengikat didasarkan pada
interaksi hidrofobik, serta interaksi dikenakan antara membran dan protein. membran
nitroselulosa lebih murah daripada PVDF, tetapi jauh lebih rapuh dan tidak berdiri
dengan baik untuk diulang probings. Keseragaman dan efektivitas keseluruhan
transfer protein dari gel ke membran dapat diperiksa oleh pewarnaan membran
dengan Coomassie Brilliant Blue atau Ponceau S pewarna. Ponceau S adalah lebih
umum dari dua, karena yang lebih tinggi sensitivitas dan air kelarutan, yang terakhir
membuatnya lebih mudah untuk selanjutnya destain dan penyelidikan membran,
seperti yang dijelaskan di bawah ini.

4. Pemblokiran
Sejak membran telah dipilih karena kemampuannya untuk protein mengikat dan
sebagai antibodi dan target adalah protein, langkah-langkah harus diambil untuk
 mencegah interaksi antara membran dan antibodi yang digunakan untuk deteksi dari
protein target. Pemblokiran mengikat non-spesifik dicapai dengan menempatkan
membran dalam larutan encer protein - biasanya 3-5% Bovine serum albumin (BSA)
atau susu kering non-lemak (baik yang murah) di Tris-Buffered Saline (TBS) atau I-
Blok, dengan persentase menit (0,1%) deterjen seperti Tween 20 atau Triton X-100.
Protein dalam larutan encer menempel pada membran di semua tempat di mana
protein target yang belum terpasang. Demikian, ketika antibodi ditambahkan, tidak
ada ruang pada membran untuk itu untuk melampirkan selain di situs pengikatan
protein target tertentu. Hal ini mengurangi latar belakang di final produk dari blot
Barat, mengarah ke hasil yang lebih jelas, dan menghilangkan positif palsu

5. Inkubasi
Selama proses deteksi membran "diselidiki" untuk protein yang menarik dengan
antibodi dimodifikasi yang terkait dengan enzim reporter; bila terkena yang sesuai
substrat, enzim ini mendorong reaksi kolorimetri dan menghasilkan warna. Untuk
berbagai alasan, ini tradisional berlangsung dalam proses dua-langkah, meskipun
sekarang ada metode deteksi satu langkah yang tersedia untuk aplikasi tertentu.

a. Dua langkah
 antibodi primer
Antibodi primer yang dihasilkan ketika spesies inang atau kultur sel kekebalan
terkena protein bunga (Atau bagian daripadanya). Biasanya, ini adalah bagian dari
kekebalan respon, sedangkan di sini mereka dipanen dan digunakan sebagai alat
deteksi sensitif dan spesifik yang mengikat protein langsung.

Setelah memblokir, larutan encer antibodi primer (Umumnya antara 0,5 dan 5
mikrogram / mL) diinkubasi dengan membran di bawah agitasi lembut. Khas,
solusi terdiri dari larutan garam buffer dengan persentase kecil dari deterjen, dan
kadang-kadang dengan susu bubuk atau BSA. Solusi antibodi dan membran dapat
disegel dan diinkubasi bersama-sama untuk di mana saja dari 30 menit untuk
semalam. Hal ini juga dapat diinkubasi pada temperatur yang berbeda, dengan
suhu yang lebih rendah dikaitkan dengan lebih mengikat, baik yang spesifik
(untuk Target protein, "sinyal") dan non-spesifik ( "noise").
 antibodi sekunder
Setelah membilas membran untuk menghapus primer terikat antibodi,
membran terkena antibodi lain, diarahkan pada bagian spesies-spesifik dari
antibodi primer. Antibodi berasal dari sumber hewani (atau hewan budaya
hibridoma bersumber); anti-tikus sekunder akan mengikat ke hampir semua utama
tikus-bersumber antibodi, yang memungkinkan beberapa penghematan biaya
dengan memungkinkan Seluruh lab untuk berbagi satu sumber antibodi diproduksi
secara massal, dan memberikan hasil yang jauh lebih konsisten. Ini adalah dikenal
sebagai antibodi sekunder, dan karena penargetan yang sifat, cenderung disebut
sebagai "anti-mouse," "antigoat," dll antibodi sekunder biasanya terkait dengan
biotin atau enzim reporter seperti fosfatase alkali atau peroksidase lobak. Ini
berarti bahwa beberapa sekunder antibodi akan mengikat satu antibodi primer dan
meningkatkan sinyal.

Paling umum, sebuah horseradish peroxidase-linked sekunder digunakan

untuk membelah agen chemiluminescent, dan produk reaksi menghasilkan
pendaran dalam proporsi dengan jumlah protein. Selembar sensitif dari fotografi
Film ditempatkan terhadap membran, dan paparan dengan cahaya dari reaksi
menciptakan citra antibodi terikat blot. Sebuah lebih murah tapi kurang sensitif
Pendekatan memanfaatkan noda 4-chloronaphthol dengan 1% hidrogen peroksida;
reaksi radikal peroksida dengan 4-chloronaphthol menghasilkan noda berwarna
ungu gelap yang bisa difoto tanpa menggunakan fotografi khusus film. Seperti
dengan prosedur ELISPOT dan ELISA, enzim dapat diberikan dengan molekul
substrat yang akan dikonversi oleh enzim untuk produk reaksi berwarna yang
akan terlihat pada membran (lihat gambar di bawah ini dengan band-band biru).

Metode lain deteksi antibodi sekunder memanfaatkan dekat-inframerah (NIR)

fluorophore-linked antibodi. Itu cahaya yang dihasilkan dari eksitasi dari pewarna
fluorescent statis, membuat deteksi fluorescent yang lebih tepat dan ukuran yang
akurat dari perbedaan sinyal yang dihasilkan oleh antibodi berlabel terikat dengan
protein pada blot barat. Protein dapat secara akurat diukur karena sinyal dihasilkan
oleh jumlah yang berbeda dari protein pada membran diukur dalam keadaan statis,
dibandingkan dengan chemiluminescence, di mana cahaya diukur dalam dinamis
negara. Alternatif ketiga adalah dengan menggunakan label radioaktif daripada
enzim digabungkan ke antibodi sekunder, seperti label protein antibodi mengikat
 seperti Staphylococcus Protein A atau Streptavidin dengan isotop radioaktif dari
yodium. Sejak metode lain yang lebih aman, lebih cepat, dan lebih murah, metode
ini sekarang jarang digunakan; Namun, sebuah Keuntungan dari pendekatan ini
adalah sensitivitas autoradiography-pencitraan berbasis, yang memungkinkan
sangat akurat protein kuantifikasi bila dikombinasikan dengan optik software
(misalnya Optiquant).

b. Satu langkah
Secara historis, proses probing dilakukan dalam dua langkah karena relatif
mudah memproduksi primer dan antibodi sekunder dalam proses terpisah. Ini
memberikan peneliti dan perusahaan keuntungan besar dalam hal fleksibilitas, dan
menambahkan langkah amplifikasi ke proses deteksi. Mengingat munculnya
tinggi-throughput analisis protein dan batas bawah deteksi, namun, telah ada
minat mengembangkan satu langkah menyelidik sistem yang akan memungkinkan
proses terjadi lebih cepat dan dengan sedikit habis. Hal ini memerlukan antibodi
penyelidikan yang keduanya mengakui protein bunga dan berisi label terdeteksi,
probe yang sering tersedia untuk tag protein yang dikenal. Probe utama diinkubasi
dengan membran dengan cara yang sama dengan yang untuk antibodi primer
dalam proses dua langkah, dan kemudian siap untuk deteksi langsung setelah
serangkaian langkah mencuci.

6. Deteksi / Visualisasi

Setelah probe terikat yang hanyut, barat blot siap deteksi probe yang berlabel dan
terikat pada protein yang menarik. dalam praktis hal, tidak semua koboi
mengungkapkan protein hanya pada satu band dalam membran. Ukuran pendekatan
yang diambil dengan membandingkan band bernoda dengan yang penanda atau
tangga dimuat selama elektroforesis. Proses ini diulang-ulang untuk protein struktural,
seperti aktin atau tubulin, yang seharusnya tidak berubah antara sampel. Itu jumlah
protein target dinormalkan ke struktural protein untuk mengontrol antar kelompok.
Sebuah strategi yang unggul adalah normalisasi terhadap total protein divisualisasikan
dengan trichloroethanol atau epicocconone. praktek ini memastikan koreksi untuk
jumlah total protein pada membran dalam kasus kesalahan atau transfer tidak lengkap.
a. deteksi Colorimetric
Metode deteksi kolorimetri tergantung pada inkubasi dari blot barat dengan
substrat yang bereaksi dengan enzim reporter (seperti peroksidase) yang terikat ke
antibodi sekunder. Ini mengubah zat warna larut menjadi bentuk larut dari warna
yang berbeda yang mengendap sebelah enzim dan dengan demikian noda
membran. Pengembangan blot ini kemudian dihentikan oleh membasuh pewarna
larut. tingkat protein dievaluasi melalui densitometri (bagaimana intens noda) atau
spektrofotometri.

b. deteksi chemiluminescent
Metode deteksi chemiluminescent tergantung pada inkubasi dari blot barat
dengan substrat yang akan luminescebila terkena wartawan pada sekunder
antibodi. cahaya ini kemudian dideteksi oleh kamera CCD yang menangkap
gambar digital dari blot barat atau fotografi film. Penggunaan film untuk deteksi
western blot perlahan-lahan menghilang karena non linearitas gambar Gambar
dianalisis oleh densitometri, yang mengevaluasi jumlah relatif pewarnaan protein
dan mengkuantifikasi hasil dalam hal optik massa jenis. software yang lebih baru
memungkinkan analisis data lebih lanjut seperti analisis berat molekul jika standar
yang sesuai digunakan. Perusahaan utama yang menawarkan Chemiluminescence
pencitraan sistem yang Analytik Jena, Syngene, UVP, Azure Biosystems,
UVITEC, GE, Biorad dan Vilber Lourmat.

c. Deteksi Radioaktif
Label radioaktif tidak memerlukan substrat enzim, tetapi lebih,
memungkinkan penempatan medis Film X-ray langsung terhadap blot Barat, yang
mengembangkan karena terkena untuk label dan menciptakan daerah gelap yang
sesuai dengan pita protein bunga (lihat gambar di sebelah kanan). Pentingnya
metode deteksi radioaktif menurun karena radiasi yang berbahaya, karena sangat
mahal, kesehatan dan keselamatan risiko tinggi, dan ECL (ditingkatkan
chemiluminescence) memberikan alternatif yang bermanfaat.
d. deteksi Fluorescent
Lrobe fluorescently berlabel gembira dengan cahaya dan emisi eksitasi
kemudian dideteksi oleh photosensor sebuah seperti kamera CCD dilengkapi
dengan tepat filter emisi yang menangkap gambar digital dari Blot dan barat
memungkinkan analisis data lebih lanjut seperti analisis berat molekul dan blot
 western kuantitatif analisis. Fluoresensi dianggap salah satu metode terbaik
untuk kuantifikasi tetapi kurang sensitif dibandingkan chemiluminescence.
7. Sekunder menyelidik
Salah satu perbedaan utama antara nitroselulosa dan PVDF membran berkaitan
dengan kemampuan masing-masing untuk mendukung "Stripping" antibodi off dan
menggunakan kembali membran untuk probe antibodi berikutnya. Sementara ada
wellestablished protokol yang tersedia untuk pengupasan nitroselulosa membran,
yang PVDF lebih kuat memungkinkan untuk pengupasan lebih mudah, dan lebih
digunakan kembali sebelum batas kebisingan latar belakang eksperimen. Perbedaan
lain adalah bahwa, tidak seperti nitroselulosa, PVDF harus direndam dalam 95%
etanol, isopropanol atau metanol sebelum digunakan. membran PVDF juga cenderung
lebih tebal dan lebih tahan terhadap kerusakan selama menggunakan.

D. 2-D elektroforesis gel

2-dimensi SDS-PAGE menggunakan prinsip-prinsip dan teknik diuraikan di atas. 2-D
SDS-PAGE, seperti namanya, melibatkan migrasi dari polipeptida dalam 2 dimensi.
Misalnya, dalam dimensi pertama, polipeptida dipisahkan menurut titik isoelektrik,
sementara di Dimensi kedua, polipeptida dipisahkan menurut berat molekul mereka.
Titik isoelektrik dari yang diberikan protein ditentukan oleh jumlah relatif positif (Mis
lisin, arginin) dan negatif (mis glutamat, aspartat) dibebankan asam amino, dengan
bermuatan negatif asam amino memberikan kontribusi ke titik isoelektrik yang rendah
dan bermuatan positif asam amino kontribusi untuk isoelektrik tinggi titik. Sampel juga
bisa dipisahkan pertama di bawah kondisi nonreducing menggunakan SDS-PAGE, dan
di bawah mengurangi kondisi di dimensi kedua, yang memecah ikatan disulfida terpisah
yang memegang subunit bersama-sama. SDSPAGE mungkin juga dibarengi dengan
urea-PAGE untuk 2- gel dimensi.

Pada prinsipnya, metode ini memungkinkan untuk pemisahan semua protein seluler
pada gel tunggal yang besar. Sebuah keuntungan besar dari metode ini adalah bahwa hal
itu sering membedakan antara isoform yang berbeda dari protein tertentu misalnya
protein yang telah terfosforilasi. Protein yang telah dipisahkan dapat dipotong dari gel
dan kemudian dianalisis dengan spektrometri massa, yang mengidentifikasi protein.