Jumat, 11 Oktober 2019

Laporan Praktikum Biokimia

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

NURLIA S
H411 16 016

LABORATORIUM BIOKIMIA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2019
 Jumat, 11 Oktober 2019
BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi pada beberapa bidang

ilmu mengalami perkembangan begitupula dengan penelitian Demikian pula

dalam ilmu pengetahuan alam, salah satu terobosan yang telah dilakukan dan

mempunyai peranan penting dalam kehidupan adalah metode identifikasi dan

pemisahan komponen-komponen penyusun dari suatu senyawa dengan

menggunakan teknik kromatografi. Teknik kromatografi adalah suatu teknik

pemisahan yang pada umumnya telah dilakukan bertahun-tahun yang lalu dan

telah mengalami perkembangan yang luar biasa dan merupakan salah satu cara

yang paling banyak dipakai, karena kemampuan dan akurasinya yang tinggi.

Pemisahan asam amino dengan metode kromatografi didasari oleh

kemampuan suatu jenis asam amino yang terlarut dalam suatu campuran pelarut

tertentu pada fasa stasioner atau lazim disebut sebagai fasa diam, dimana bila

suatu zat terlarut yang terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang sama

dan tidak saling bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut di

dalam kedua pelarut seimbang (Rizalina dkk, 2018).

Pada kromatografi lapis tipis, yang digunakan sebagai fasa stasioner adalah

suatu lembaran tipis silika gel. Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang

baik, dapat digunakan dua fase pelarut, dimana setiap jenis asam amino

mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu.

Perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan permukaan fasa gerak

merupakan dasar untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan.

 Jumat, 11 Oktober 2019
Oleh karena itu melalui percobaan ini akan dilakukan analisis asam amino dengan

menggunakan metode kromatografi lapis tipis.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

1.2.1 Maksud Percobaan

Maksud dari percobaan ini adalah mengetahui dan memahami cara

pemisahan dan identifikasi asam amino dalam suatu sampel melalui metode

kromatografi lapis tipis.

1.2.2 Tujuan Percobaan

Tujuan dari percobaan ini adalah :

1. Menghitung nilai Rf dari asam amino glisin, sistein, alanin dan sampel x

2. Mengidentifikasi asam amino dalam larutan sampel berdasarkan nilai Rf nya.

1.3 Prinsip Percobaan

Identifikasi asam amino berdasarkan perbedaan nilai Rf dengan

menggunakan metode kromatrografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari

campuran n-butanol, asam asetat dan air, sedangkan fase diamnya adalah plat

silika gell. Identifikasi dilakukan dengan membandingkan jarak noda antara asam

amino satu dengan asam amino yang lainnya.

 Jumat, 11 Oktober 2019
BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Asam Amino

Asam amino adalah unit dasar protein. Asam amino mengandung gugus

amino dan gugus karboksilat. Asam amino memiliki peran penting dalam

berbagai proses terkait dengan ekspresi gen, termasuk modulasi fungsi protein

yang memediasi mRNA. Asam amino digunakan dalam pembentukan protein.

Jika terjadi kekurangan asam amino, maka sintesis protein tidak akan terjadi.

Sebagai akibatnya terjadi defisiensi protein. Asam amino diketahui secara akut

mengatur sekresi insulin dari β-sel in vivo dan in vitro (Akram dkk, 2011).

Mutu protein dinilai dari perbandingan asam-asam amino yang terkandung

dalam protein. Asam amino diperlukan oleh makhluk hidup sebagai penyusun

protein atau sebagai kerangka molekul-molekul penting. Apabila spesies tersebut

memerlukannya tetapi tidak mampu memproduksi sendiri disebut asam amino

esensial. Asam amino non esensial dapat dibentuk di dalam tubuh sehingga tidak

harus dipenuhi dari asupan makanan. Pada prinsipnya suatu protein yang dapat

menyediakan asam amino esensial dalam suatu perbandingan yang menyamai

kebutuhan manusia mempunyai mutu yang tinggi. Sebaliknya protein yang

kekurangan satu atau lebih asam-asam amino esensial mempunyai mutu yang

rendah (Ginting dkk, 2017).

2.1.1 Sistein

Molekul asam amino ini mengandung gugus sulfhidril (-SH) yang cukup

relatif terutama pada proses dehidrogenasi. Dengan oksidasi dua molekul sistein

akan berikatan dan membentuk molekul sistin (Poedjiadi, 2006). Sistein

 Jumat, 11 Oktober 2019
merupakan asam amino netral yang polar namun tidak mempunyai gugus

fungsional yang rantai cabangnya dapat membentuk ikatan hidrogen dengan air.

Sistin memiliki berat molekul 121,16 g/mol (Rahayu dkk, 2014).

2.1.2 Alanin

Asam amino kecuali glisin dapat dianggap sebagai derivate alanin. Alanin

diperoleh untuk pertama kalinya oleh Weyl dari hasil hidrolisis fibroin, yaitu

protein yang terdapat pada sutera (poedjiadi, 2006). Alanin merupakan jenis asam

amino nonesensial, memiliki sifat netral, nonpolar pada pH mendekati 7 dan

alifatik. Alanin memiliki rantai cabang hidrokarbon. Hasil uji HPLC

menunjukkan berat molekul Alanin pada perlakuan K1, K2, K4, K8, K16 dan K24

yaitu sebesar 89,1 g/mol (Rahayu dkk, 2014).

2.1.3 Glisin

Glisin adalah asam amino yang paling sederhana yang terdapat pada

skleroprotein. Pada tahun 1820 Braconnot menemukan glisin dari hasil hidrolisis

gelatin (Poedjiadi, 2006). Glisin termasuk dalam klasifikasi asam amino yang

bersifat netral, nonpolar (hidrofobik), nonesensial dan memiliki rantai samping

terbuka sehingga tergolong asam amino alifatik. Hasil pengujian HPLC terhadap

berat molekul Glisin yaitu 75,07 g/mol (Rahayu dkk, 2014).

2.2 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan distribusi dari komponen-komponen dalam fasa gerak dan fasa diam.

Fasa gerak dapat berupa gas atau cairan, sedangkan fasa diam dapat berupa cairan

atau padatan. Fasa gerak berupa gas disebut kromatografi gas (Gas

Chromatography). Kegunaan dari gas chromatography adalah untuk identifikasi

 Jumat, 11 Oktober 2019
semua jenis senyawa organik yang mudah menguap dan juga dapat digunakan

untuk analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa dalam suatu campuran. Analisis

kuantitatif dengan gas chromatography menggunakan metode standar internal.

Metode ini digunakan karena terdapat ketidakpastian yang disebabkan injeksi

sampel dan kecepatan aliran. Metode ini seringkali digunakan untuk sampel yang

tidak sesuai atau tidak mungkin diinjeksi langsung pada gas chromatography

(Rizalina dkk, 2018).

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dikembangkan oleh Ismailoff dan

Schraiber pada tahun 1983. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain

kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada kromatografi lapis tipis fase diamnya

berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang

didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium atau plat plastik (Zaki, 2013).

Prinsip KLT yaitu perpindahan analit pada fase diam karena pengaruh fase

gerak, proses ini biasa disebut elusi. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase

diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja

KLTdalam hal efesiensi dan resolusinya. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut

pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada

pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada

pengembangan secara menurun (descending) (Zaki, 2013).

 Jumat, 11 Oktober 2019
BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan

Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah Eluen (n-butanol : asam

asetat : air = 2,6 : 0,6 : 2,6 v/v, larutan penyemprot ninhidrin 2%, aseton, dan

larutan asam amino (alanin, glisin, sistein dan sampel x)

3.2 Alat Percobaan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah chamber, pipa kapiler,

gelas ukur 10 mL, botol semprot, pensil, penggaris, oven, pingset dan pipet tetes

berskala.

3.3 Prosedur Percobaan

3.3.1 Pembuatan eluen

Dibuat larutan eluen dengan menggunakan larutan n–butanol, asam asetat,

dan air dengan perbandingan 2,6 : 0,6 : 2,6 v/v. Kemudian eluen dimasukkan ke

dalam chamber, dikocok sebentar, kemudian ditutup dan ditunggu sampai jenuh ±

30 menit.

3.3.2 Penotolan Sampel

Pada plat KLT yang sebelumya telah digunting sesuai ukuran chamber

(3 x 7 cm), dikeringkan kemudian dibuat garis batas bawah 1,5 cm dan batas atas

1 cm, dibuat titik-titik pada garis batas bawah yang merupakan tempat

penotolan larutan asam amino glisin, sistein, alanin dan sampel x. Setelah itu,

semua larutan asam amino dan larutan asam amino sampel ditotolkan pada titik
 Jumat, 11 Oktober 2019
yang telah dibuat pada plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler yang

sebelumnya berada dalam aseton. Selanjutnya dikeringkan pada suhu kamar.

3.3.3 Proses Elusi

Jika eluen telah jenuh, Plat KLT dielusi ke dalam chamber dengan hati-

hati agar garis batas bawah tidak tercelup ke dalam eluen. Elusi dihentikan jika

eluen menempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya (garis batas atas).

Dikeluarkan plat dari chamber dan dikeringkan. Selanjutnya plat KLT disemprot

dengan larutan ninhidrin, kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu kurang

lebih 60 0C selama beberapa menit. Setelah kering diberi tanda pada noda yang

timbul pada plat KLT dengan pensil. Ditentukan nilai Rf dari masing-masing noda

pada Plat KLT

 Jumat, 11 Oktober 2019

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Pada percobaan ini, dilakukan pemisahan dan identifikasi asam amino pada

suatu larutan sampel dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis. Dari

percobaan yang telah dilakukan diperoleh data sebagai berikut :

Tabel 1. Data hasil pengamatan

Jarak Noda
NO Larutan Sampel Jarak Eluen (cm) Rf (cm)
(cm)

1. Alanin 1,5 cm 0 0

2. Glisin 1,5 cm 0 0

3. Sistein 1,5 cm 0 0

4. Sampel x 1,5 cm 0 0

4.3 Pembahasan

Pada percobaan ini, tahap pertama yang dilakukan adalah kertas

kromatografi diguntingsesuai yang dibutuhkan, pada kertas kromatografi kita

membuat garis yang digunakan sebagai tempat menotol larutan asam amino

dan sampel yang berjarak 1,5 cm dari tepi bawah pada kertas kromatografi dan

1 cm pada bagian tepi atas. Kertas kromatografi ini adalah fase diam dalam

percobaan ini. Lalu dikeringkan dalam oven, tujuannya yaitu untuk

mengaktifkan lapisan KLT agar kertas tersebut benar-benar kering karena

suspensi absorbannya terbuat dari air (fase diam).

 Jumat, 11 Oktober 2019
Eluen sebagai fase gerak dibuat dengan campuran n-butanol, asam asetat

dan air dengan urutan perbandingan 2,6 : 0,6 : 2,6 mL. Selanjutnya eluen

dimasukkan ke dalam chamber, eluen dibuat benar-benar jenuh terhadap

chamber untuk mempercepat proses elusi. Digunakan campuran n-butanol,

asam asetat, dan air sebagai eluen karena ketiga bahan tersebut memiliki

kepolaran, dan memiliki perbedaan titik dielektrik. Air lebih polar dari pada n-

butanol dan n-butanol lebih polar jika dibandingkan dengan asam asetat.

Prinsip percobaan KLT ini didasarkan pada sifat fisik dan kimia asam amino.

Sifat fisik ditunjukkan oleh kecepatan bergerak pada fase diam dari kertas

kromatografi dan sifat kimianya berdasarkan pada warna yang timbul ketika

disemprot dengan larutan ninhidrin.

Asam amino glisin, sistein, alanin dan sampel x ditotolkan pada kertas

kromatografi yang berjarak 1,5 cm dari bawah kertas dengan menggunakan

pipa kapiler. Penotolan sampel dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler yang

sebelumnya telah dibilas dengan aseton. Aseton merupakan salah satu larutan

yang sering digunakan untuk membersihkan alat sebab sifatnya yang nonpolar

sehingga dapat membersihkan bahan-bahan non polar pada alat. Selain itu,

sifatnya yang mudah menguap dapat mempercepat pengeringan alat, sehingga

sangat membantu pengeringan untuk alat seperti pipa kapiler. Penotolan untuk

setiap larutan dilakukan 1 kali karena jika lebih dapat mempengaruhi hasil yang

diperoleh. Selanjutnya kertas yang sudah ditotolkan dengan larutan dikeringkan

pada suhu kamar. Setelah kering kertas kromatografi lapis tipis dimasukkan

ke dalam chamber. Pada saat dimasukkan dalam chamber totolan pada

kertas kromatografi diupayakan tidak

 Jumat, 11 Oktober 2019
tercelup dalam eluen agar asam amino tidak larut pada eluen sehingga dapat

berpisah. Proses elusi dilakukan sampai eluen mencapai jarak tertentu yang telah

diberi tanda dan setelah sampai plat KLT dikeringkan pada suhu kamar agar

pelarut menguap sempurna sehingga noda yang terbentuk tidak melebar. Setelah

plat benar-benar kering, disemprotkan larutan ninhidrin 0,2%. Ninhidrin

digunakan karena dapat memberikan reaksi spesifik terhadap asam amino dengan

membentuk warna tertentu bagi asam amino tertentu. Setelah itu, kertas

kromatografi dikeringkan dalam oven agar benar-benar kering agar diperoleh

warna yang lebih jelas. Kemudian noda yang terbentuk ditandai lalu dihitung nilai

Rf masing-masing noda. Noda yang terbentuk pada plat tidak terpisah dengan

baik, hal ini disebabkan karena penotolan yang dilakukan terlalu banyak.

Hasil yang terlihat setelah plat KLT di ambil dari oven, warna yang

terbentuk dari larutan asam amino sistein, alanin dan sampel x tidak dapat di

identifikasi sehingga nilai Rf dari larutan asam amino tersebut adalah 0. Hasil

yang diperoleh dalam praktikum ini berbanding terbalik dengan teori yang

menyatakan bahwa nilai Rf glisin adalah 0,26; nilai Rf sistein adalah 0,40 dan

nilai Rf alanin adalah 0,38. Adanya perbedaan antara hasil praktikum dan teori

yang ada dapat disebabkan karena kurang telitinya pada saat melakukan pratikum

yang mungkin dapat disebabkan karena plat KLT terlalu lama di letakkan didalam

chamber sehingga melewati batas tepi bawah dari tempat penotolan atau dapat

pula disebabkan karena alat-alat serta bahan-bahan percobaan yang digunakan

kurang steril sehingga terdapat perbedaan antara praktek dengan teori.

.
 Jumat, 11 Oktober 2019
BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa

percobaan yang telah dilakukan diperoleh hasil yang tidak sesuai dengan teori

yang dapat disebabkan oleh kesalah pada saat melakukan praktikum sehingga

Nilai Rf dari sampel larutan asam amino sistein, alanin, glisin dan sampel x tidak

dapat dihitung dan asam amino tidak dapat di identifikasi karena nilai Rf tidak

dapat di hitung

5.2 Saran

5.2.1 Saran Untuk Laboratorium

Untuk laboratorium sudah baik baik alat-alat dan bahan sudah lengkap,

Saran untuk laboratorium agar kedepannya fasilitasnya bisa lebih baik lagi.

5.2.2 Saran Untuk Percobaan

Sebaiknya digunakan juga metode yang lain untuk mengidentifikasi asam

amino, agar pengetahuan yang diperoleh lebih banyak.

 Jumat, 11 Oktober 2019
DAFTAR PUSTAKA

Akram M., Asif H.M., Uzair M., Akhtar N., Madni A., dan Ali s.M., 2011,
Amino acids: A review article. Journal Of Medicinal Plan Research.
5 (17): 3998-3999.

Ginting A.R., Sitorus S., dan Astuti W., 2017, Penentuan Kadar Asam Amino
Esensial (Metionin, Leusin, Isoleusin dan Lisin) Pada Telur Penyu dan
Telur Bebek, Jurnal Kimia Mulawarman, 14(2): 91-92.

Poedjiadi A., dan Supriyanti F.M.T., 2006, Dasar-dasar Biokimia, Universitas

Indonesia Press

Rahayu M., Pramonowibowo dan Yulianto T., Profil Asam Amino Yang
Terdistribusi Kedalam Kolom Air Laut Pada Ikan Kembung (Rastrelliger
kanagurta) sebagai Umpan Skala Laboratorium. Journal Of Fisheries
Resources Utilization Management and Technology, 3(3): 238-247.

Rizalina H., Cahyono E., Mursiti S., Nurcahyo B., dan Supartono., 2018,
Optimasi Penentuan Kadar Metanol dalam Darah Menggunakan Gas
Chromatography, Indonesian Journal Of Chemical Science, 7(3): 255.

Zaki M.M., 2013, isolasi Senyawa Metabolit Sekunder Dari Ekstrak n-Heksana
Lumut Hati Mastighopora Diclados (Brid. Ex Web) Nees, Skripsi,. UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta
 Jumat, 11 Oktober 2019
LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 11 Oktober 2019

ASISTEN
PRAKTIKAN

Musdalipa Nurlia S
Lampiran 1 (Bagan Kerja)
 Jumat, 11 Oktober 2019
1. Pembuatan Eluen

n-butanol Asam asetat Air

2,6 mL 0,6 mL 2,6 mL

 Dimasukkan dalam tabung reaksi dan di homogenkan

 Dimasukkan ke dalam chamber

 Dihomogenkan

 Ditutup dan ditunggu sampai jenuh selama 30 menit

Eluen

2. Penotolan Sampel

Plat KLT

 Digunting sesuai ukuran yang dibutuhkan

 Di keringkan kemudian dibuat garis batas bawah 1,5 cm dan batas

atas 1 cm

 Dibuat titik-titik pada garis batas bawah yang merupakan tempat

penotolan larutan asam amino alanine, glisin, sistein dan sampel x

 Larutan asam amino dan sampel ditotolkan pada titik yang telah

dibuat pada plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler yang

sebelumnya berada dalam aseton.

 Dikeringkan pada suhu kamar.

KLT

3. Proses Elusi
 Jumat, 11 Oktober 2019

Plat KLT yang telah ditotol

 Dielusi ke dalam chamber berisi eluen yang telah jenuh dengan hati-

hati agar garis batas bawah tidak tercelup ke dalam eluen

 Dihentikan jika eluen menempuh jarak yang telah ditentukan

sebelumnya

 Plat dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan

 Plat KLT disemprot dengan larutan ninhidrin

 Dikeringkan dalam Oven dengan suhu ± 60 0C selama 30 menit

 Setelah kering diberi tanda pada noda yang timbul pada plat KLT

dengan pensil

 Ditentukan nilai Rf dari masing-masing noda pada plat KLT

Data
 Jumat, 11 Oktober 2019

Lampiran 2 (Foto Percobaan)

Jumat, 11 Oktober 2019